陳功 陳祥 朱丹丹 王自譜 張小潔 信照亮

遲發(fā)性腦缺血（DCI）是蛛網(wǎng)膜下腔出血（SAH）最重要的并發(fā)癥，與蛛網(wǎng)膜下腔內(nèi)發(fā)生的非特異性炎癥密切相關(guān)。研究發(fā)現(xiàn)，蛛網(wǎng)膜細(xì)胞作為蛛網(wǎng)膜下腔中固有的巨噬細(xì)胞，具有抗原提呈能力，能夠參與啟動(dòng)SAH后的炎癥反應(yīng)[1-2]。Kai等[3]報(bào)道，SAH 時(shí)腦脊液（CSF）中凝血酶的水平與出血嚴(yán)重程度、SAH病情的發(fā)展和腦血管痙攣密切相關(guān)。凝血酶已成為實(shí)驗(yàn)性SAH的常用誘導(dǎo)劑。近年來(lái)人們逐漸認(rèn)識(shí)到，在不同環(huán)境中的巨噬細(xì)胞可以發(fā)生不同性質(zhì)的活化，成為具有不同活化表型和功能特征的亞群。蛛網(wǎng)膜細(xì)胞具有單核巨噬細(xì)胞的類(lèi)似功能，被認(rèn)為是蛛網(wǎng)膜下腔中的固有巨噬細(xì)胞，能夠參與SAH后蛛網(wǎng)膜下腔中的炎癥反應(yīng)。因此，研究蛛網(wǎng)膜細(xì)胞的極化能力有助于闡明蛛網(wǎng)膜下腔細(xì)胞免疫功能低下和SAH后炎癥的發(fā)生機(jī)制。有研究報(bào)道認(rèn)為，IL-6是SAH后CSF中主要的促炎因子[4]，但I(xiàn)L-6是否可以影響蛛網(wǎng)膜細(xì)胞的M1/M2狀態(tài)，未見(jiàn)報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)采用體外培養(yǎng)的大鼠蛛網(wǎng)膜細(xì)胞，經(jīng)外周巨噬細(xì)胞極化誘導(dǎo)因子GM-CSF或M-CSF分別刺激后，采用ELISA法檢測(cè)極化相關(guān)因子IL-6、IL-12p40（M1極化標(biāo)志性因子）、IL-10（M2極化標(biāo)志性因子）的變化，觀(guān)察是否可以誘導(dǎo)蛛網(wǎng)膜細(xì)胞發(fā)生極化；然后用凝血酶作為激活劑活化蛛網(wǎng)膜細(xì)胞在體外模擬SAH狀況，再采用不同劑量IL-6刺激活化的蛛網(wǎng)膜細(xì)胞和正常（非活化）蛛網(wǎng)膜細(xì)胞，實(shí)時(shí)熒光定量PCR（qRT-PCR）法觀(guān)察CD68（單核-巨噬細(xì)胞標(biāo)志物）、CK8+18（蛛網(wǎng)膜細(xì)胞標(biāo)志物）、IL-12p40、IL-23（M1 極化標(biāo)志性因子）、精氨酸酶-1（Arg-I）（M2極化標(biāo)志性因子）的RNA（相對(duì)）表達(dá)水平，以研究IL-6對(duì)大鼠蛛網(wǎng)膜細(xì)胞極化狀態(tài)的影響和量效關(guān)系。

1 材料和方法

1.1 材料 1~2d的SD大乳鼠（西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供）40只，體重5~6g。儀器：激光掃描共聚焦顯微鏡，10、200、1 000μl無(wú)菌無(wú)酶微量吸頭，200μl、1.8ml無(wú)菌無(wú)酶微量離心管，實(shí)時(shí)定量PCR儀，紫外分光光度計(jì)，普通高速離心機(jī)，高速冷凍離心機(jī)，低速離心機(jī)，漩渦混勻器。試劑：胎牛血清（FBS）、PBS、4%多聚甲醛、0.2%Trition、5%牛血清白蛋白（BSA，西安依科生物有限公司）、DMEM/F12培養(yǎng)基、重組人粒細(xì)胞集落刺激因子（GM-CSF）、重組人巨噬細(xì)胞集落刺激因子（M-CSF）、重組人IL-6、凝血酶、小鼠抗人Cytokeratin8&18（CK8+18）單克隆抗體（英國(guó)Abcam公司）、兔抗Vimentin多克隆抗體、兔抗人CD68多克隆抗體（北京博奧森生物有限公司）、羊抗小鼠FITC（英國(guó)Abcam公司）、羊抗兔FITC（北京中杉金橋生物科技有限公司）、DAPI細(xì)胞染色液（中國(guó)碧云天公司）、氯仿、異丙醇、75%乙醇、焦磷酸二乙酯（DEPC）、反轉(zhuǎn)錄試劑盒、RT-PCR試劑盒。

1.2 大鼠蛛網(wǎng)膜細(xì)胞培養(yǎng) 參照蛛網(wǎng)膜細(xì)胞培養(yǎng)的方法[1]。將SD大乳鼠乙醇消毒后移入操作臺(tái)斷頭處死，用剪刀將頭部皮膚鈍性剝離，再?gòu)暮筘堆厥笭羁p及人字縫剪開(kāi)顱骨，剝離顱骨后取蛛網(wǎng)膜層，PBS沖洗后剪碎，置于FBS中浸泡5min，移入培養(yǎng)瓶，取0.1~0.2ml完全培養(yǎng)液滴在組織塊表面，置于培養(yǎng)箱12h待組織塊貼壁后，再補(bǔ)加培養(yǎng)液2ml。2~3d換液1次，7~14d后可見(jiàn)細(xì)胞鋪滿(mǎn)培養(yǎng)瓶底總面積的70%~80%，即可傳代至12孔板中。用移液器吸取0.1ml細(xì)胞懸液，輕輕滴加在蓋玻片上，勿使細(xì)胞懸液從蓋玻片溢出。把12孔培養(yǎng)板移至培養(yǎng)箱中。24h后，待大部分細(xì)胞貼壁向每孔補(bǔ)加1ml完全培養(yǎng)基。每3d換液1次，當(dāng)細(xì)胞爬滿(mǎn)蓋玻片的50%~60%時(shí)取出蓋玻片，立即制片。

1.3 培養(yǎng)蛛網(wǎng)膜細(xì)胞的鑒定（ICC檢測(cè)） CK8+18和Vimentin作為蛛網(wǎng)膜細(xì)胞的標(biāo)志物已在許多研究得到應(yīng)用；Vimentin、CD68是組織內(nèi)和成熟巨噬細(xì)胞的標(biāo)志物。傳代培養(yǎng)蛛網(wǎng)膜細(xì)胞，4%多聚甲醛固定30min，PBS沖洗；0.2%Trition作用10min，沖洗；BSA封閉FC段受體，4℃條件下作用90min。再加200μl一抗：包括小鼠抗人CK8+18單克隆抗體，兔抗CD68多克隆抗體，4℃過(guò)夜。PBS沖洗3遍，每遍5min后分別向每張玻片加200μl二抗：羊抗小鼠FITC，羊抗兔FITC或Cy3標(biāo)記山羊抗兔IgG（上海翊圣生物科技有限公司），37℃，45min，PBS沖洗5遍，3min/次，分別向每張玻片加入200μl DAPI作用3min，PBS沖洗，甘油封片。在熒光顯微鏡（日本Nikon公司）下，觀(guān)察培養(yǎng)細(xì)胞CK8+18、Vimentin、CD68的表達(dá)情況，以鑒定蛛網(wǎng)膜細(xì)胞。

1.4 SAH狀況下蛛網(wǎng)膜細(xì)胞極化狀態(tài)的觀(guān)察

1.4.1 極化誘導(dǎo)因子GM-CSF和M-CSF對(duì)蛛網(wǎng)膜細(xì)胞的極化誘導(dǎo) 在體外，人M1和M2均可由CD14單核細(xì)胞在不同細(xì)胞因子誘導(dǎo)下獲得：在完全培養(yǎng)液中加入重組GM-CSF可獲得M1，而加入M-CSF可獲得M2[5]。待12孔培養(yǎng)板中的蛛網(wǎng)膜細(xì)胞爬滿(mǎn)蓋玻片總面積的50%~60%時(shí)，棄去細(xì)胞上清液，用PBS洗3遍，5min/次，參照Fleetwood等[6]的方法，分別向每孔加入1ml的 GM-CSF（0、500U/ml）、1ml M-CSF（0、100ng/ml）。在刺激后的第6天取出爬片并制片，用ELISA法檢測(cè)上清液中IL-6、IL-12p40和IL-10表達(dá)水平以觀(guān)察其是否可以發(fā)生極化。

1.4.2 凝血酶刺激模擬SAH對(duì)蛛網(wǎng)膜細(xì)胞極化狀態(tài)的影響 凝血酶已成為實(shí)驗(yàn)性SAH的常用誘導(dǎo)劑[3]。參照吳碧華等[7]的方法，分別向每孔加入凝血酶（0、10、50U/ml），分別在刺激后的第3天取出爬片并制片作ICC 檢測(cè) IL-1、TNF-α（M1極化標(biāo)志因子）、CD163、Arg-1（M2極化標(biāo)志因子）。

1.4.3 IL-6刺激模擬SAH狀況對(duì)蛛網(wǎng)膜細(xì)胞極化狀態(tài)影響 SAH后患者CSF中IL-6水平為100~600pg/ml[8-9]；IL-6水平為270~300pg/ml時(shí)與遲發(fā)性腦缺血和顱內(nèi)高壓的發(fā)生率相關(guān)，而血管痙攣組則高達(dá)到450~600pg/ml[8]。因此，筆者選取 100、300、600pg/ml作為低、中、高劑量組。對(duì)照組（為正常蛛網(wǎng)膜細(xì)胞）和實(shí)驗(yàn)組（為最佳劑量凝血酶刺激3d后的蛛網(wǎng)膜細(xì)胞），根據(jù)胡曉芳和劉保國(guó)等[8-9]所報(bào)道的中國(guó)成年SAH患者CSF中IL-6水平，分別向每孔加入 IL-6 0、100、300、600pg/ml，分別在刺激后的第1、3、7、14天取出爬片并制片做ICC檢測(cè)。

1.4.4 qRT-PCR測(cè)定 引物見(jiàn)表1。按實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)留取并保存上清液和實(shí)驗(yàn)的細(xì)胞。每批實(shí)驗(yàn)分別設(shè)置3個(gè)復(fù)孔。所得數(shù)值為3者的均值。

表1 引物表

1.4.4.1 蛛網(wǎng)膜細(xì)胞總mRNA提取 每孔加入1ml Trizol，反復(fù)吹打，室溫靜置 5min，加入氯仿 200μl，劇烈震蕩，離心后取上層水相，加500μl異丙醇，離心后去上清液，加入1ml 75%乙醇洗滌，離心后棄上清液，干燥后加入50μl DEPC-80℃保存。

1.4.4.2 反轉(zhuǎn)錄合成cDNA 去除基因組DNA反應(yīng)后，先加入 8μl的 RNase Free dH2O 和 8μl的 5×PrimeScript Buffer 2，混勻后，再添加2μl RT Primer Mix和2μl的PrimeScript RT Enzyme Mix I，得到 40μl的反應(yīng)體系，輕輕混勻后，37℃作用 15min，85℃ 作用5s。

1.4.4.3 以cDNA為模板擴(kuò)增特異基因片段的RT-PCR反應(yīng) 以 cDNA為模板擴(kuò)增 CD68、IL-12、IL-23和Arg-I的基因編碼片段，以大鼠β-actin為內(nèi)參照，條件如下：94℃預(yù)變性 30s；95℃變性 5s，60℃退火 30s，40個(gè)循環(huán)；延伸10min。采用△△CT數(shù)學(xué)模式對(duì)結(jié)果進(jìn)行分析。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 應(yīng)用Grahpad Prism 5.0或SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件，計(jì)量資料用表示，兩組間比較采用Student′s t檢驗(yàn)，多組間比較采用多組獨(dú)立樣本秩和檢驗(yàn)或方差分析，采用線(xiàn)性相關(guān)分析確定其相關(guān)性，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 大鼠蛛網(wǎng)膜細(xì)胞培養(yǎng)及鑒定 體外培養(yǎng)大鼠蛛網(wǎng)膜細(xì)胞，細(xì)胞呈多角形；ICC可見(jiàn)，95%以上的細(xì)胞CK8+18、Vimentin表達(dá)陽(yáng)性，呈絲狀分布于細(xì)胞質(zhì)內(nèi)，細(xì)胞核內(nèi)未見(jiàn)表達(dá)；95%以上的細(xì)胞CD68表達(dá)陽(yáng)性，呈絲狀分布于細(xì)胞質(zhì)內(nèi)，細(xì)胞核內(nèi)未見(jiàn)表達(dá)（圖1，見(jiàn)插頁(yè)）。

圖1 體外培養(yǎng)大鼠蛛網(wǎng)膜細(xì)胞圖（a：倒置顯微鏡，將蛛網(wǎng)膜組織塊接種至培養(yǎng)瓶1～2d，可見(jiàn)組織塊邊緣有細(xì)胞游走出來(lái)，×100；b：ICC染色，細(xì)胞CK8+18表達(dá)陽(yáng)性，×200；c：ICC染色，細(xì)胞Vimentin表達(dá)陽(yáng)性，×200；d：免疫熒光染色，細(xì)胞CD68表達(dá)陽(yáng)性，×200）

2.2 極化誘導(dǎo)劑GM-CSF和M-CSF對(duì)蛛網(wǎng)膜細(xì)胞的極化誘導(dǎo)狀況 500U/mlGM-CSF組IL-6和IL-12p40水平顯著性增高，而100U/ml M-CSF刺激組無(wú)顯著性變化，見(jiàn)圖2-3；兩組IL-10水平均低于試劑盒檢測(cè)下限?？梢?jiàn)，在GM-CSF和M-CSF分別刺激下，蛛網(wǎng)膜細(xì)胞僅發(fā)生了M1型極化而沒(méi)有發(fā)生M2極化，與外周單核巨噬細(xì)胞的反應(yīng)不同。

圖2 GM-CSF刺激蛛網(wǎng)膜細(xì)胞6d后M1極化因子IL-6水平變化

圖3 GM-CSF刺激蛛網(wǎng)膜細(xì)胞6d后M1極化因子IL-12p40水平變化

2.3 凝血酶刺激模擬SAH對(duì)蛛網(wǎng)膜細(xì)胞極化狀態(tài)的影響 采用10U/ml及50U/ml凝血酶分別刺激蛛網(wǎng)膜細(xì)胞3d后，50U/ml刺激組細(xì)胞IL-1、Arg-I和 CD163 mRNA相對(duì)表達(dá)水平較10U/ml刺激組顯著性升高，TNF-α無(wú)明顯變化，見(jiàn)圖4，提示50U/ml凝血酶是較好的刺激濃度。

圖4 凝血酶刺激蛛網(wǎng)膜細(xì)胞，IL-1、Arg-I、CD163、TNF-α相對(duì)表達(dá)水平

2.4 IL-6刺激模擬SAH狀況對(duì)蛛網(wǎng)膜細(xì)胞極化狀態(tài)的影響

2.4.1 對(duì)照組 不同濃度的IL-6刺激正常的蛛網(wǎng)膜細(xì)胞，經(jīng)100pg/ml的IL-6刺激后，CD68相對(duì)表達(dá)量在各時(shí)間組間比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05）。其中經(jīng)300、600pg/ml的IL-6分別刺激后，CD68表達(dá)的時(shí)間模式，各時(shí)間組之間比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）：當(dāng)IL-6為600pg/ml時(shí)，CD68在1d達(dá)到最高，在7d最低；當(dāng)IL-6為300pg/ml時(shí)，CD68在3d達(dá)到最高，在14d最低（圖5）。蛛網(wǎng)膜細(xì)胞的巨噬樣特征呈IL-6刺激劑量大出現(xiàn)和消退早的時(shí)間模式。

圖5 不同濃度的IL-6刺激正常蛛網(wǎng)膜細(xì)胞CD68表達(dá)情況

IL-6刺激正常蛛網(wǎng)膜細(xì)胞14d時(shí)M1極化因子IL-23和IL-12p40表達(dá)水平增高，IL-23表達(dá)水平顯著提高，IL-12p40在高劑量時(shí)表達(dá)最低，刺激劑量為300pg/ml時(shí)IL-12p40表達(dá)水平最高（圖6）；M2極化因子Arg-Ⅰ表達(dá)在14d時(shí)增高，且Arg-Ⅰ表達(dá)水平隨刺激劑量的增加而降低（圖7），提示，IL-6刺激使得正常蛛網(wǎng)膜細(xì)胞發(fā)生極化需要很長(zhǎng)時(shí)間，且不同的極化因子與刺激劑量的關(guān)系不同。

圖6 不同濃度的IL-6刺激正常蛛網(wǎng)膜細(xì)胞14d后，M1極化因子IL-23和IL-12p40相對(duì)表達(dá)水平

圖7 不同濃度IL-6刺激正常蛛網(wǎng)膜細(xì)胞14d后，Arg-Ⅰ相對(duì)表達(dá)水平

2.4.2 實(shí)驗(yàn)組 經(jīng)100pg/ml的IL-6刺激后，CD68相對(duì)表達(dá)水平在第1天達(dá)到最高，第7天最低，各組之間無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05）；經(jīng) 600、300pg/ml的 IL-6分別刺激后，從第3天開(kāi)始，隨著刺激天數(shù)的增加，CD68相對(duì)表達(dá)水平減少，各組之間有差異統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）（圖 8）?；罨?Ar細(xì)胞，經(jīng) 300~600pg/ml的 IL-6刺激下，根據(jù)CD68相對(duì)表達(dá)水平，1~3d時(shí)Ar細(xì)胞的巨噬樣特征最為明顯，抗原提呈能力可能增強(qiáng)，而在7~14d，其細(xì)胞巨噬樣特征逐漸減弱，抗原提呈能力可能隨之減弱。

圖8 不同濃度IL-6刺激凝血酶活化的蛛網(wǎng)膜細(xì)胞CD68相對(duì)表達(dá)水平

先用50U/ml凝血酶激活蛛網(wǎng)膜細(xì)胞3d后加入IL-6刺激?？梢?jiàn)在1、3、7、14d蛛網(wǎng)膜細(xì)胞M1極化因子IL-23相對(duì)表達(dá)水平均顯著性增高，在最大刺激量時(shí)，3d和7d時(shí)增高幅度非常大（圖9）；而M2極化因子Arg-I相對(duì)表達(dá)水平刺激3d后才顯著性增高，且Arg-Ⅰ表達(dá)水平隨刺激劑量的增加而降低（圖10）。SAH狀況下IL-6誘導(dǎo)極化的誘導(dǎo)的時(shí)間模式明顯不同；可以早期全程誘導(dǎo)M1極化，而在3d才開(kāi)始誘導(dǎo)M2型極化。

圖9 不同濃度IL-6刺激凝血酶活化蛛網(wǎng)膜細(xì)胞1d、3d、7d和14d，M1極化因子IL-23相對(duì)表達(dá)水平

3 討論

圖10 不同濃度IL-6刺激凝血酶活化蛛網(wǎng)膜細(xì)胞3d后細(xì)胞M2極化因子Arg-I相對(duì)表達(dá)水平

大鼠蛛網(wǎng)膜細(xì)胞體外培養(yǎng)技術(shù)已日漸成熟，Lam等[10]發(fā)現(xiàn)大鼠蛛網(wǎng)膜細(xì)胞在結(jié)構(gòu)和功能上均類(lèi)似于人蛛網(wǎng)膜細(xì)胞。Janson等[11]成功誘導(dǎo)了大鼠永生化蛛網(wǎng)膜細(xì)胞，加之人蛛網(wǎng)膜細(xì)胞培養(yǎng)成功率不高等因素，本研究選擇大鼠蛛網(wǎng)膜細(xì)胞作為實(shí)驗(yàn)細(xì)胞。許多研究將CK8+18、Vimentin作為蛛網(wǎng)膜細(xì)胞的標(biāo)志物，將CD68作為組織內(nèi)和成熟巨噬細(xì)胞的標(biāo)志物；因此，我們采用上述標(biāo)志物鑒定培養(yǎng)的細(xì)胞及其活化狀態(tài)。

SA為人體防御功能薄弱的區(qū)域，體液免疫和細(xì)胞免疫功能均明顯底下；靜息狀態(tài)下，蛛網(wǎng)膜細(xì)胞的漿內(nèi)線(xiàn)粒體、粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、高爾基體和溶酶體與外周巨噬細(xì)胞相比均不發(fā)達(dá)，有反應(yīng)能力低下的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)。在本實(shí)驗(yàn)中，經(jīng)GM-CSF誘導(dǎo)后，細(xì)胞上清液中促炎因子IL-6和IL-12p40水平較未刺激組顯著性增高；而經(jīng)M-CSF刺激后，細(xì)胞上清中促炎因子IL-6和IL-12p40水平與對(duì)照組比無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；目前涉及抗炎因子在SAH中作用的相關(guān)報(bào)道較少，本實(shí)驗(yàn)中，IL-10水平低于試劑盒檢測(cè)下限。提示蛛網(wǎng)膜細(xì)胞在GM-CSF的誘導(dǎo)下只發(fā)生了M1極化，未發(fā)生M2極化，與外周明顯不同；這可能部分解釋了SA中免疫功能低下的原因。Kooijman等[12]發(fā)現(xiàn)SAH后的48h，IL-10表達(dá)量只有上升趨勢(shì)（P＞0.05），而Aihara等[13]發(fā)現(xiàn)SAH后14d，IL-10表達(dá)量無(wú)明顯變化。IL-10在SAH中的作用仍存爭(zhēng)議。Murray等[14]發(fā)現(xiàn)發(fā)現(xiàn)單核巨噬細(xì)胞分泌IL-10部分依賴(lài)于MAP激酶級(jí)聯(lián)JAK-STAT通路和MAP激酶級(jí)聯(lián)激活通路。是否M-CSF刺激作用未能激活蛛網(wǎng)膜細(xì)胞分泌IL-10基因轉(zhuǎn)錄相關(guān)通路，需要進(jìn)一步研究證明。

Kai等[3]報(bào)道，SAH時(shí)腦脊液中凝血酶的水平與出血嚴(yán)重程度、SAH病情的發(fā)展和腦血管痙攣密切相關(guān)，凝血酶已成為實(shí)驗(yàn)性SAH的常用誘導(dǎo)劑。凝血酶是一種重要的促炎因子，能上調(diào)多種炎癥因子的表達(dá)，巨噬細(xì)胞表面表達(dá)凝血酶受體，可被凝血酶激活[15]。本實(shí)驗(yàn)采用10U/ml及50U/ml凝血酶分別刺激蛛網(wǎng)膜細(xì)胞，3d后發(fā)現(xiàn)，50U/ml凝血酶刺激組細(xì)胞 IL-1、Arg-I和CD163mRNA相對(duì)水平較10U/ml凝血酶組顯著性升高；Galea等[16]檢測(cè)到SAH患者CSF中CD163水平高于對(duì)照組，F(xiàn)assbender等[17]發(fā)現(xiàn)SAH患者CSF中IL-1濃度顯著性增高。故以50U/ml作為活化蛛網(wǎng)膜細(xì)胞的最佳濃度。

Schoch等[18]認(rèn)為CSF中IL-6顯著性增高則SAH患者預(yù)后不良，IL-6是CSF中與病情密切相關(guān)并能預(yù)測(cè)SAH預(yù)后的標(biāo)志因子。IL-6主要由單核巨噬細(xì)胞產(chǎn)生，作為SAH后SA內(nèi)主要的促炎因子，能夠使單核細(xì)胞發(fā)生活化，并促進(jìn)細(xì)胞表達(dá)黏附因子及多種炎癥遞質(zhì)，還可促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞釋放第Ⅲ凝血因子，并參與啟動(dòng)凝血過(guò)程[19]。筆者根據(jù)SAH后不同階段IL-6在CSF中的濃度[8-9]，選取100pg/ml（低）、300pg/ml（中）和600pg/ml（高）劑量組；分別刺激正常蛛網(wǎng)膜細(xì)胞和經(jīng)凝血酶刺激活化的蛛網(wǎng)膜細(xì)胞1、3、7、14d，發(fā)現(xiàn)IL-6的劑量影響CD68的表達(dá)，且對(duì)正常和活化蛛網(wǎng)膜細(xì)胞刺激結(jié)果一致。中高劑量IL-6刺激時(shí)蛛網(wǎng)膜細(xì)胞的巨噬樣特征在1～3d最為明顯，7～14d逐漸減弱。

經(jīng)3種劑量的IL-6分別刺激正常蛛網(wǎng)膜細(xì)胞，1、3、7d后IL-23相對(duì)表達(dá)水平與未加入IL-6刺激組相比無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，而14d刺激組IL-23水平較未加入IL-6刺激組顯著性升高，且隨刺激劑量的增加而增加。刺激經(jīng)凝血酶活化的蛛網(wǎng)膜細(xì)胞，1、3、7、14d，IL-23 表達(dá)水平均較未加入IL-6刺激組相比顯著性升高。提示蛛網(wǎng)膜細(xì)胞（凝血酶刺激）的活化狀態(tài)與發(fā)生M1極化改變密切相關(guān)；還發(fā)現(xiàn)，當(dāng)高劑量IL-6刺激活化的蛛網(wǎng)膜細(xì)胞3～7d，IL-23表達(dá)水平達(dá)到最高。Schoch和Xie等[18，20]發(fā)現(xiàn)，SAH 發(fā)生 4~6d后，血性 CSF中 M1相關(guān)因子IL-6、TNF-α和IL-1β水平顯著性高于對(duì)照組。在臨床上，DCI多發(fā)生于SAH后的1～3d，7～14d是發(fā)病的高峰時(shí)間。提示，在IL-6可以很快誘導(dǎo)凝血酶活化蛛網(wǎng)膜細(xì)胞發(fā)生M1極化，且其時(shí)間模式與臨床上發(fā)生DCI的時(shí)間模式基本一致。

Arg-I是免疫系統(tǒng)中的關(guān)鍵組分，由Th2細(xì)胞因子如IL-4、IL-10和IL-13誘導(dǎo)產(chǎn)生。王青山等[21]發(fā)現(xiàn)IL-6能在一定程度上抑制巨噬細(xì)胞由M1型向M2型轉(zhuǎn)化。Kigerl等[22]發(fā)現(xiàn)小鼠脊髓損傷后 3～7d，Arg-I表達(dá)陽(yáng)性的M2細(xì)胞增高。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)IL-6刺激正常蛛網(wǎng)膜細(xì)胞，1、3、7、14d Arg-I相對(duì)表達(dá)水平與未加入 IL-6 刺激組相比均有升高，而刺激活化的蛛網(wǎng)膜細(xì)胞僅在第3天時(shí)Arg-I相對(duì)表達(dá)量與未加入IL-6刺激組相比有升高。Kroner等[23]也發(fā)現(xiàn)，脊髓損傷后1~15d內(nèi)主要以M1為主，Arg-I表達(dá)陽(yáng)性的M2細(xì)胞數(shù)僅在第4天達(dá)到高峰，提示IL-6可刺激正常蛛網(wǎng)膜細(xì)胞可發(fā)生M2極化改變。同時(shí)還發(fā)現(xiàn)，100pg/ml的IL-6刺激活化的蛛網(wǎng)膜細(xì)胞后Arg-I相對(duì)表達(dá)水平最高，故推測(cè)在低劑量促炎因子的作用下，細(xì)胞M2極化特征更為明顯。在CSF中，iNOS與Arg競(jìng)爭(zhēng)性消耗精氨酸，Yatsushige等[24]發(fā)現(xiàn)，SAH后CSF中iNOS表達(dá)增加，過(guò)高水平的NO則對(duì)細(xì)胞的代謝和生存不利。提示增加CSF中Arg-I的量以減少NO的產(chǎn)生，利用精氨酸Arg-I代謝途徑以緩解SAH后并發(fā)癥的發(fā)生可能是一個(gè)思路。

總之，蛛網(wǎng)膜細(xì)胞在GM-CSF的誘導(dǎo)下只發(fā)生了M1極化，未發(fā)生M2化，與外周明顯不同。在SAH后的CSF微環(huán)境中，蛛網(wǎng)膜細(xì)胞經(jīng)IL-6刺激后發(fā)生M1/M2極化的時(shí)間和表現(xiàn)模式多樣，也與外周不同，與臨床上變化多端的情況吻合。雖然單純描述蛛網(wǎng)膜細(xì)胞的M1/M2極化狀態(tài)改變，簡(jiǎn)化了SAH后SA內(nèi)巨噬細(xì)胞相關(guān)的炎癥反應(yīng)，但是本研究還是為SAH后蛛網(wǎng)膜細(xì)胞極化改變提供了一個(gè)新的基本概念。

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