萬青青 李潔 曾鈺 張明明 趙心清 白鳳武

（微生物代謝國家重點實驗室 上海交通大學(xué)生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院，上海 200240）

釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）廣泛用于乙醇發(fā)酵生產(chǎn)，也是異源蛋白表達(dá)的重要宿主之一。利用釀酒酵母表達(dá)的外源蛋白包括抗體等藥物蛋白［1］和纖維素酶等多種工業(yè)酶等［2］。因此，提高釀酒酵母外源蛋白表達(dá)水平相關(guān)研究受到普遍關(guān)注。纖維素酶屬于糖苷水解酶家族，通過催化糖苷鍵水解從而解聚纖維素并釋放葡萄糖，進而可用于生物燃料和生物基化學(xué)品的發(fā)酵生產(chǎn)［3］。將纖維素酶在釀酒酵母中表達(dá)，特別是分泌表達(dá)，可以將纖維素組分的酶水解及葡萄糖乙醇發(fā)酵整合，開發(fā)聯(lián)合生物加工（Consolidated bioprocessing，CBP）策略［3］，是纖維素乙醇生產(chǎn)創(chuàng)新技術(shù)開發(fā)的前沿。纖維素酶為復(fù)合酶系，主要包括內(nèi)切葡聚糖酶（Endoglucanase，EG）、外切纖維素酶（Cellobiohydrolase，CBH）和β-葡萄糖苷酶（β-glucosidase，BGL），通過協(xié)同作用降解纖維素［4］。目前，釀酒酵母異源表達(dá)纖維素酶水平低，導(dǎo)致纖維素組分酶水解速率慢，是制約整個利用CBP生產(chǎn)纖維素乙醇過程的突出問題。雖然基于釀酒酵母細(xì)胞表面展示技術(shù)，異源表達(dá)纖維素酶可以錨定到細(xì)胞表面形成局部高濃度，在一定程度上解決纖維素組分水解速率慢的問題。但纖維素組分是非可水溶性的，與釀酒酵母細(xì)胞接觸的比表面積很低，釀酒酵母細(xì)胞表面展示纖維素酶后，纖維素組分水解速率仍然無法與乙醇發(fā)酵相匹配［5］。因此研究纖維素酶的分泌生產(chǎn)是提高CBP效率的重要內(nèi)容。此外，促進酶的分泌生產(chǎn)也有利于生產(chǎn)多種藥用蛋白，因此引起了廣泛關(guān)注。

釀酒酵母表達(dá)異源蛋白的效率受到多因素影響，包括酶基因的選擇［6］、啟動子強弱［7］等。此外，在釀酒酵母中異源蛋白表達(dá)和分泌不可避免會對細(xì)胞產(chǎn)生多種脅迫，如營養(yǎng)匱乏、能量供給不足及氧化脅迫等［8，9］。所以，過表達(dá)脅迫耐受性基因可能對釀酒酵母外源蛋白分泌表達(dá)具有綜合的促進作用。研究表明超氧化物歧化酶基因SOD1過表達(dá)可提高重組酵母纖維素酶的生產(chǎn)［10］，與細(xì)胞脅迫相關(guān)的熱激響應(yīng)（Heat shock response，HSR）的激活能夠提高釀酒酵母異源α-淀粉酶的生產(chǎn)［11］。因此，對脅迫耐受性相關(guān)基因進行深入研究，有可能進一步促進重組酵母纖維素酶的生產(chǎn)。

本課題組近期研究表明，編碼線粒體核糖體蛋白家族的基因MRP8在乙酸耐受性提高的釀酒酵母突變株中表達(dá)量明顯高于對照菌株，進一步研究證明，過表達(dá)MRP8可提高模式釀酒酵母菌株S288c乙酸脅迫耐受性［12］。目前對MRP8的功能了解很少，由于其過表達(dá)對釀酒酵母環(huán)境脅迫耐受性的促進作用，推測該基因有可能在重組酵母表達(dá)外源蛋白過程中也起到和SOD1類似的促進作用，但目前對其在纖維素酶等外源蛋白生產(chǎn)中的作用還沒有研究報道。本文以異源表達(dá)CBH1釀酒酵母菌株為模式體系，研究MRP8過表達(dá)對CBH1合成與分泌的影響，為進一步研究利用脅迫相關(guān)基因改造促進釀酒酵母高效分泌表達(dá)其他纖維素酶，進而為開發(fā)纖維素乙醇生產(chǎn)CBP創(chuàng)新技術(shù)奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株、質(zhì)粒和引物 本實驗中使用的釀酒酵母菌株、質(zhì)粒和引物見表1和表2。重組釀酒酵母出發(fā)菌株S. cerevisiaeY294-CBH1為過表達(dá)Talaromyces emersonii來源的 CBH1［6］的S. cerevisiaeY294 衍生菌株，由南非西開普敦大學(xué)Riaan den Haan博士提供。

1.1.2 培養(yǎng)基 培養(yǎng)大腸桿菌Escherichia coliDH5α使用LB液體培養(yǎng)基（g/L）：胰蛋白胨10，酵母粉5，氯化鈉10；LB固體培養(yǎng)基在此基礎(chǔ)上添加20 g/L瓊脂粉?；罨劸平湍讣斑M行酶活評價使用YPD培養(yǎng)基（g/L）：葡萄糖20，蛋白胨20，酵母粉10；YPD固體培養(yǎng)基在此基礎(chǔ)上添加20 g/L瓊脂粉。以上培養(yǎng)基均在115℃高壓蒸汽滅菌20 min。

表2 本文構(gòu)建菌株使用的引物

1.2 方法

1.2.1 菌株構(gòu)建與活化 以模式釀酒酵母S288c基因組為模板，用引物XmaI MRP8-F/SalI MRP8-R擴增出MRP8基因序列。采用USER酶連接方法［15］快速構(gòu)建得到含PGK1p-MRP8-CYC1t片段的質(zhì)粒。質(zhì)粒經(jīng)測序驗證正確后作為模板，利用引物19-PGK1p-F和19-CYC1t-R擴增獲得用于釀酒酵母同源重組的線性化片段，其中包含釀酒酵母S288c染色體XV上整合位點（YORWdelta22）的上游同源臂、PGK1啟動子、MRP8基因、CYC1終止子、以及整合位點的下游同源臂。利用醋酸鋰轉(zhuǎn)化法［16］將Cas9表達(dá)載體Cas9-NAT轉(zhuǎn)至分泌產(chǎn)酶的重組釀酒酵母Y294-CBH1菌株中，在含有100 mg/L諾爾絲菌素的YPD固體平板上篩選得到轉(zhuǎn)化子。再將YORWdelta22位點的gRNA表達(dá)載體pRS42H-gRNA-19和線性化片段轉(zhuǎn)化至含有Cas9表達(dá)載體的轉(zhuǎn)化子中，以含有100 mg/L諾爾絲菌素和300 mg/L潮霉素B的YPD固體平板篩選轉(zhuǎn)化子。提取基因組DNA，用引物Ppgk1-F和SalI MRP8-R，以及XmaI MRP8-F和Tcyc1-R擴增轉(zhuǎn)化元件，驗證轉(zhuǎn)化子。將轉(zhuǎn)化子在不含抗生素的YPD液體培養(yǎng)基中繼代，每24 h轉(zhuǎn)接一次，連續(xù)轉(zhuǎn)接5次，丟失Cas9-NAT和pRS42H-gRNA-19質(zhì)粒，獲得重組菌株用于產(chǎn)酶實驗。所獲得的重組酵母菌株均保存于-80℃冰箱。

重組酵母菌株活化：取-80℃保存的重組釀酒酵母菌株在YPD液體培養(yǎng)基中30℃、150 r/min過夜培養(yǎng)至對數(shù)期，經(jīng)二次活化后，用于后續(xù)發(fā)酵實驗。

1.2.2 重組酵母酶活評價 經(jīng)二次活化的重組釀酒酵母菌株接種于含100 mL YPD培養(yǎng)基的250 mL三角瓶中，30℃、150 r/min過夜培養(yǎng)后離心收集菌體，再以初始OD600為1的起始接種量，于100 mL YPD培養(yǎng)基中，在150 r/min、30℃條件下培養(yǎng)。每隔24 h定時取樣測定OD600。所取發(fā)酵液6 000 r/min離心5 min，留上清測定酶活。

酶活測定方法：參考文獻方法測定［17］，以0.02 g/L pNP（p-nitrophenyl）適當(dāng)稀釋繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，換算后得到相應(yīng)酶活。一個酶活力單位定義為每分鐘生成1 μg pNP所需的酶量。發(fā)酵液上清的酶活力以每mg細(xì)胞干重計量。

酵母細(xì)胞干重測定：收集不同時期酵母細(xì)胞，ddH2O洗兩次后，分別稀釋成不同濃度（每個濃度準(zhǔn)備兩份），一份用來測定OD600，一份用來測定細(xì)胞干重，從而制得OD600-干重標(biāo)準(zhǔn)曲線。發(fā)酵過程取樣后測OD600，并根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計算干重。

1.2.3 SDS-PAGE分析 取500 μL培養(yǎng)96 h的發(fā)酵液，離心收集上清，冷凍干燥后，加25 μL ddH2O溶解，添加糖苷內(nèi)切酶-H（Endoglycosidase H，Endo-H，New England Biolabs）37℃反應(yīng)1 h用于去糖基化，以不添加Endo-H作為對照，進行SDS-PAGE。電泳結(jié)束后用考馬斯亮藍(lán)R-250染色，經(jīng)脫色液（10% V/V冰醋酸，5% V/V乙醇）脫色后觀察蛋白條帶。

1.2.4 重組酵母胞內(nèi)活性氧和ATP含量檢測 分別取12、24、48、72和96 h的酵母細(xì)胞，3 000 r/min離心3 min后，收集酵母細(xì)胞，然后用1 mol/L的PBS（磷酸鹽緩沖液）洗滌兩次，使用活性氧檢測試劑盒（碧云天公司，S0033）和ATP檢測試劑盒（碧云天公司，S0026）檢測胞內(nèi)活性氧及ATP的含量。

1.2.5 關(guān)鍵基因表達(dá)水平分析 取4 mL培養(yǎng)24 h和48 h的發(fā)酵液，10 000 r/min離心2 min后收集酵母細(xì)胞，ddH2O洗兩次，液氮速凍后，凍存于-80℃，用于RNA提取。使用總RNA抽提純化試劑盒（Sangon Biotech）提取總RNA，然后用反轉(zhuǎn)錄試劑盒（Prime Script RT reagent Kit，TaKaRa）反轉(zhuǎn)成cDNA作為模板，使用iQTMSYBR? Green試劑盒（Bio-Rad）進行實時定量PCR（RT-qPCR）分析，以2-ΔΔCt方法比較轉(zhuǎn)錄量［18］，以ALG9為內(nèi)參基因。本實驗中使用的實時定量引物見表3。

表3 本文使用的實時定量引物

1.2.6 菌株耐性評價 培養(yǎng)二次活化后的菌株至對數(shù)生長期，將菌液OD600調(diào)至1.0，按照一定梯度稀釋后，取2 μL菌液在對照條件，以及分別添加剛果紅（Congo red）、衣霉素（Tunicamycin，TM）、二硫蘇糖醇（Dithiothreitol，DTT）的YPD平板上點板培養(yǎng)，記錄菌株生長情況。剛果紅濃度分別為5、10、25、50、100、200、500 μg/mL；衣霉素濃度分別為 0.5和0.8 μg/mL；二硫蘇糖醇濃度為5 mmol/L。

2 結(jié)果

2.1 菌株生長情況及酶活評價

采用CRISPR-Cas9基因組編輯技術(shù)將MRP8定點整合到釀酒酵母XV染色體YORWdelta22位點，研究其過表達(dá)對纖維素酶生產(chǎn)的影響。如圖1-A所示，在30℃培養(yǎng)96 h時，Y294-CBH1-MRP8菌株的生物量OD600約為3.33，對照菌株約為3.37，表明生長無明顯差異。酶活情況如圖1-B所示，在30℃培養(yǎng)96 h時，MRP8過表達(dá)菌株分泌產(chǎn)生的CBH1酶活達(dá)到了5.26 IU/mg DCW，與對照菌株相比提高了約80%，說明MRP8過表達(dá)顯著提高了菌株CBH1生產(chǎn)。

圖 1 MRP8過表達(dá)菌株和對照菌株的生長與CBH1酶活性比較

2.2 外切纖維素酶胞外分泌分析

由于在釀酒酵母中生產(chǎn)異源蛋白，易產(chǎn)生糖基化現(xiàn)象，影響蛋白條帶觀察，故利用Endo-H進行去糖基化反應(yīng)。SDS-PAGE分析結(jié)果如圖2所示，與對照菌株相比，重組菌株Y294-CBH1-MRP8菌株在CBH1預(yù)測分子量位置條帶亮度更亮，推測CBH1蛋白濃度更高，與CBH1酶活高于對照菌株結(jié)果一致。

2.3 關(guān)鍵基因表達(dá)水平分析

圖 2 MRP8過表達(dá)菌株和對照菌株粗酶液SDS-PAGE蛋白電泳分析

為了挖掘MRP8過表達(dá)提高釀酒酵母分泌表達(dá)CBH1酶活的內(nèi)在機理，檢測了重組酵母和對照菌株中與外源蛋白分泌相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄水平（圖3）。在發(fā)酵24 h時，基因幾乎無顯著變化，然而在發(fā)酵48 h時，CBH1表達(dá)上調(diào)2.0倍，但是與蛋白轉(zhuǎn)運相關(guān)的基因IMH1和TYP32等表達(dá)都沒有明顯變化，提示MRP8過表達(dá)提高CBH1的生產(chǎn)是促進了CBH1酶基因轉(zhuǎn)錄，可能與外切纖維素酶在細(xì)胞內(nèi)的轉(zhuǎn)運和分泌無關(guān)，但還需要研究其他時間點和更多的基因，并結(jié)合后續(xù)的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)進行深入分析?？寡趸窼OD1基因轉(zhuǎn)錄也未發(fā)現(xiàn)明顯變化。

圖 3 MRP8過表達(dá)菌株和對照菌株相關(guān)基因轉(zhuǎn)錄水平比較

2.4 胞內(nèi)活性氧和ATP檢測

對突變體及對照菌株胞內(nèi)活性氧和ATP進行檢測，結(jié)果如圖4所示。在發(fā)酵初期12 h時，與對照菌株相比，MRP8過表達(dá)菌株活性氧偏高，但ATP含量較低，這可能是由于異源蛋白的表達(dá)增強，使得細(xì)胞在發(fā)酵初期產(chǎn)生一定響應(yīng)。從24 h開始，突變體的CBH1酶活明顯高于對照菌株，但胞內(nèi)活性氧和ATP無顯著差異。

圖 4 MRP8過表達(dá)菌株和對照菌株胞內(nèi)活性氧和ATP含量比較

2.5 重組菌株耐性評價

評價突變體和對照菌株在添加剛果紅、衣霉素或二硫蘇糖醇條件下的生長情況，結(jié)果如圖5所示。剛果紅敏感性與細(xì)胞壁完整性相關(guān)［19］，在添加5-500 μg/mL剛果紅條件下，MRP8過表達(dá)菌株的生長與對照菌株相比無明顯差別，說明MRP8過表達(dá)提高外源蛋白分泌與細(xì)胞壁完整性無關(guān)。此外，額外添加衣霉素和二硫蘇糖醇能夠引起未折疊蛋白響應(yīng)，從而造成內(nèi)質(zhì)網(wǎng)脅迫［20］。實驗結(jié)果表明，MRP8過表達(dá)菌株和對照菌株在衣霉素平板中的生長基本一致，此外，突變體在DTT平板中生長略弱于對照，證實CBH1蛋白生產(chǎn)增強和未折疊蛋白響應(yīng)無顯著聯(lián)系。

3 討論

圖5 MRP8過表達(dá)菌株和對照菌株在脅迫條件下的生長情況比較

本研究證明，過表達(dá)MRP8促進外切纖維素酶CBH1的生產(chǎn)，且對菌株生長無影響。前期研究表明，蛋白質(zhì)經(jīng)過轉(zhuǎn)錄翻譯后，在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上進行折疊加工，期間涉及的相關(guān)基因均會參與到此過程中［21］。此外，在蛋白質(zhì)從內(nèi)質(zhì)網(wǎng)到高爾基體，從高爾基體到細(xì)胞膜的運輸過程中同樣涉及大量蛋白的參與［22-24］。在本研究中，蛋白分泌量增多，實時定量PCR分析MRP8過表達(dá)突變體CBH1轉(zhuǎn)錄量提高，但囊泡運輸過程相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄水平無明顯變化，說明MRP8過表達(dá)可能促進CBH1蛋白合成，而可能和增強蛋白分泌途徑?jīng)]有直接關(guān)系，但是相關(guān)研究還需要深入分析其他時間點和更多相關(guān)的關(guān)鍵蛋白基因后才能得到更準(zhǔn)確的結(jié)論。未來將進行不同時間點重組酵母細(xì)胞全局轉(zhuǎn)錄組分析，得到更加全面的信息，進而深入揭示蛋白表達(dá)和分泌的分子機理。

MRP8在釀酒酵母細(xì)胞中的具體功能目前還不十分清楚。以往研究表明，MRP8轉(zhuǎn)錄受細(xì)胞壁損傷脅迫的誘導(dǎo)［25］，其蛋白表達(dá)在厭氧條件下比好氧條件低［26］。此外，MRP8在過氧化氫和乙醇脅迫下受到泛素化修飾［27］，說明該基因的表達(dá)與脅迫響應(yīng)有關(guān)。蛋白的過量生產(chǎn)和分泌可能產(chǎn)生活性氧［9］，但是檢測發(fā)現(xiàn)MRP8過表達(dá)菌株ROS無明顯變化，推測該基因過表達(dá)能降低活性氧的積累，從而導(dǎo)致ROS和對照水平相當(dāng)。SOD1基因轉(zhuǎn)錄無明顯差異，SOD酶活檢測也未發(fā)現(xiàn)顯著變化，推測活性氧的清除可能與其他抗氧化機制有關(guān)。蛋白合成過程中需要能量供應(yīng)，檢測胞內(nèi)ATP含量發(fā)現(xiàn)，過表達(dá)菌株與對照水平基本一致，猜測是由于MRP8過表達(dá)促進能量代謝，使得CBH1蛋白合成提高所消耗的能量得到抵消。此外，MRP8過表達(dá)提高外源蛋白分泌與細(xì)胞壁完整性和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)脅迫均無顯著聯(lián)系，其調(diào)控產(chǎn)酶的分子機理值得進一步深入挖掘。

本課題組前期對與生物燃料生產(chǎn)相關(guān)的環(huán)境脅迫耐受性基因機理進行了研究，發(fā)現(xiàn)了多個與釀酒酵母環(huán)境脅迫耐受性相關(guān)的基因，例如發(fā)現(xiàn)過表達(dá)組蛋白H4甲基化轉(zhuǎn)移酶編碼基因SET5可提高釀酒酵母對乙酸和氧化脅迫的耐受性［28］。本研究結(jié)果表明，其他與脅迫耐受性相關(guān)基因也可能用于提高纖維素酶的生產(chǎn)，未來可繼續(xù)研究這些環(huán)境脅迫耐受性相關(guān)基因?qū)χ亟M蛋白生產(chǎn)的影響。后續(xù)也將著重研究MRP8過表達(dá)對其他酶生產(chǎn)的影響，從而促進重組酵母在多種藥用蛋白和工業(yè)酶生產(chǎn)中的應(yīng)用。

4 結(jié)論

在重組釀酒酵母中過表達(dá)MRP8可提高外切纖維素酶的生產(chǎn)，與對照菌株相比，CBH1酶活提高了約80%。進一步對促進酶分泌的機理進行探討，發(fā)現(xiàn)在MRP8過表達(dá)突變體中，CBH1轉(zhuǎn)錄水平高于對照菌株，但是與蛋白分泌相關(guān)的關(guān)鍵基因轉(zhuǎn)錄水平?jīng)]有明顯變化。過表達(dá)MRP8對細(xì)胞壁完整性和由未折疊蛋白響應(yīng)引起的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)脅迫無明顯影響，其增強產(chǎn)酶機理與促進酶基因轉(zhuǎn)錄有關(guān)。

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