朱薇 馬亞龍

（1. 湖南工業(yè)大學，株洲 412000；2. 中南大學資源加工與生物工程學院，長沙 410083）

單質(zhì)硫（S0）的微生物氧化是硫的生物地球化學循環(huán)過程中最重要的反應之一，這些微生物一方面通過對S0的氧化為其自身生長提供能量［1］；另一方面通過溶解自然界中的含硫礦物，釋放一些金屬離子。因此，人們利用微生物對S0的氧化作用掀起了一門新興技術(shù)——生物濕法冶金技術(shù)（Biohydrometallurgy），即利用微生物法提取復雜低品位原生硫化礦（包括含銅、鈾、金、鈷和鉛等硫化礦）中的有價金屬及對金礦表面的硫化礦進行氧化預處理［2-3］。

硫化礦生物浸出的微生物根據(jù)其最適生長溫度可劃分為常溫微生物（30-40℃）、中度嗜熱微生物（40-60℃）和極端嗜熱微生物（60-80℃）［4］。與常見的中溫菌相比，極端嗜酸熱古菌由于具有耐高溫、提取速率快和浸出率高等特點，在生物冶金工業(yè)應用上有著很大的潛力，正逐漸成為人們研究的熱點。其中硫氧化機制及其代謝途徑是所有研究的核心，但是目前對于極端嗜酸熱古菌的硫氧化相關(guān)酶基因的注解非常缺乏，人們對嗜酸熱古菌硫氧化過程缺乏清晰的認識和了解［5-6］。萬座嗜酸兩面菌Acidianus manzaensis是嗜酸菌屬的一個新種，是一株最適生長溫度在70℃左右的極端嗜酸熱古菌，屬于兼性厭氧和兼性化能自養(yǎng)微生物，能夠在S0和亞鐵（Fe2+）中進行生長，在生物浸出過程中顯示出了很強的應用價值［7-9］。

A.manzaensisYN-25菌全基因組測序的完成為深入了解極端嗜酸熱古菌硫氧化機理和代謝途徑提供了大量信息［10］。本研究基于典型的極端嗜酸熱古菌A. manzaensisYN-25已公布的全基因組序列信息，通過生物信息學分析和基因表達轉(zhuǎn)錄技術(shù)驗證了與硫氧化相關(guān)功能基因，并通過對前述結(jié)果的分析，擬構(gòu)建極端嗜酸熱古菌A. manzaensis菌的硫氧化模型，旨在了解嗜酸熱古菌在硫氧化機制方面與硫氧化細菌的區(qū)別和聯(lián)系，并為以后闡明嗜酸熱古菌硫氧化機制的相關(guān)研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

MgSO4·7H2O，K2HPO4，（NH4）2SO4，KCl，Ca（NO3）2均購自上海生工；細菌基因組DNA提取試劑盒和總RNA提取試劑盒均購自于天根生化科技有限公司；引物由湖南擎科生物技術(shù)有限公司（TSINGKE Biological Technology）合成；ReverTra Ace-α-第一鏈cDNA合成試劑盒，HUNDERBIRDTM SYBR? qPCR Mix均購自于日本東洋紡公司（Toyobo co.，LTD.，Osaka，Japan）；RT-qPCR 在 iCycler iQTM Real-time PCR 儀（Bio-Rad Laboratories，Inc.，Hercules，USA）上完成。

1.2 方法

1.2.1 菌株及培養(yǎng)基 本實驗所用菌株Acidianus manzaensisYN-25由中南大學生物冶金重點實驗室提供，培養(yǎng)基配方：0.5 g/L MgSO4·7H2O；0.5 g/L K2HPO4；3.0 g/L（NH4）2SO4；0.1 g/L KCl；0.01 g/L Ca（NO3）2，添加 0.02%（W/V）酵母提取物作為生長因子，并分別加入10 g/L的S0、20 g/L的FeSO4·7H2O作為能源底物，培養(yǎng)基初始pH用濃硫酸分別調(diào)到 2.0（S0能源底物）和 1.5（Fe2+為能源底物）。在 500 mL的三角瓶中培養(yǎng)A. manzaensis，接種前將裝有200 mL培養(yǎng)基的三角瓶在滅菌鍋中 121℃滅菌20 min，待培養(yǎng)基冷卻后進行接種，初始接種菌濃均為 107個/mL，在 65℃、170 r/min的空氣浴搖床中培養(yǎng)。

1.2.2 S0和Fe2+能源底物中的A. manzaensis菌生長特性A. manzaensis在不同能源底物S0和Fe2+的培養(yǎng)過程中，每隔12 h取液體樣品分別測定細胞密度、pH值、SO42-和Fe3+。其中細胞密度采用光學顯微鏡直接鏡檢計數(shù)法，pH值使用pH計測定（雷磁PHS-3C），SO42-用改良的硫酸鋇比濁法測定［11］（在 50 mL比色管中分別加入 6.0 mL BaCl2標準溶液、6.0 mL無水乙醇、2.0 mL 0.1 g/L Tween-80和 5 mL Na2SO4標準溶液，最后用pH 1.0鹽酸溶液定容至 50 mL，定容之后靜置 5 min在波長為 420 nm可見光范圍內(nèi)測量吸光值）。Fe3+采用磺基水楊酸法測定［12］（在50 mL比色管中分別加入 3 mL待測樣品溶液、20%磺基水楊酸 10 mL，定容至 50 mL，靜置 5 min后在波長為 420 nm可見光范圍內(nèi)測量吸光值）。

1.2.3 NCBI數(shù)據(jù)庫檢索硫氧化基因及引物設(shè)計A.manzaensisYN-25的全基因組序列和完整的注釋通過檢索NCBI（登錄號為CP020447）數(shù)據(jù)庫獲得，根據(jù)數(shù)據(jù)庫檢索得到的相關(guān)基因信息采用Primer3（v.0.4.0）在線引物設(shè)計網(wǎng)站（http://bioinfo.ut.ee/primer3-0.4.0/primer3/）設(shè)計對應引物（表 1），相應蛋白質(zhì)序列通過檢索NCBI Nonredundant Database數(shù)據(jù)庫獲得［13］，蛋白質(zhì)的亞細胞結(jié)構(gòu)定位通過開放閱讀課框中可能的跨膜區(qū)域由TMHMM 2.0 服務(wù)器（www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM）和THUMBUP服務(wù)器（http://sparks.informatics.iupui.edu/Softwares-Services_files/thumbup.htm）在線分析［14-15］。

1.2.4 RT-qPCR驗證篩選S0氧化相關(guān)基因 為了驗證篩選的20個基因與S0氧化相關(guān)性，采用RT-qPCR對其進行轉(zhuǎn)錄水平的檢測。用于RT-qPCR的細胞收集于對數(shù)中期，總RNA的提取和總基因組DNA的提取分別采用細菌總RNA提取試劑盒和細菌總基因組DNA提取試劑盒（天根生化科技有限公司）。對提取的總RNA用微量分光光度計（Thermo Scientific NanoDrop? ND-1000 spectrophotometer） 測定其濃度，同時采用A260/A280和A260/A230的比值對所提RNA的純度和質(zhì)量進行評估。以提取的總RNA用作模板，采用ReverTra Ace-α-第一鏈cDNA合成試劑盒進行反轉(zhuǎn)錄反應，合成相應的cDNA。RT-qPCR實驗以cDNA為模板，使用高效率SYBR熒光定 量 PCR mix QPK-201（Toyobo co.，LTD.，Osaka，Japan）配制反應體系后在iCycler iQTM Real-time PCR 儀（Bio-Rad Laboratories，Inc.，Hercules，USA）上進行，每個反應設(shè) 3 個重復。

表1 用于RT-qPCR引物序列信息

RT-qPCR分以下幾個程序：（1）98℃預變性 2 min ；（2）98℃解鏈 10 s，56℃復性 30 s，68℃延伸30 s，共設(shè) 40 個循環(huán)，并在每個循環(huán)的退火階段檢測熒光信號；（3）循環(huán)結(jié)束后反應溫度從 55℃開始梯度升高到 98℃作產(chǎn)物的熔解曲線，升溫時每次增加 0.5℃。對RT-qPCR采集的數(shù)據(jù)，用16S rDNA基因作為內(nèi)部參照校正，用（1+E）-ΔΔCq法進行計算（其中E為擴增效率，Cq值為熒光信號達到域值時的循環(huán)數(shù)），分析各個基因在不同能源底物培養(yǎng)時的相對表達量［16］。結(jié)果用log2［S0/Fe2+］±SD表示，并采用t檢驗進行差異性分析，即log2［S0/Fe2+］≥0.7（P≤ 0.05）表示為在S0能源底物下表達上調(diào)，如果log2［S0/Fe2+］≤ - 0.7（P≥0.05）則表示在S0能源底物下表達下調(diào)，即在Fe2+能源底物下表達上調(diào)。

2 結(jié)果

2.1 A. manzaensis菌在S0和Fe2+中的生長特性

首先比較研究了A. manzaensis菌在S0和Fe2+兩種不同能源底物下的生長特性，從圖1可知，在S0為能源底物時細胞的延滯期比以Fe2+為能源底物時長，以可溶性的能源底物FeSO4·7H2O培養(yǎng)的細胞更容易獲得能量進行生長，而作為固體形式的能源底物S0，由于細胞需要將S0轉(zhuǎn)運至細胞內(nèi)才能進一步被氧化利用，但是在S0中生長的細胞的對數(shù)期的細胞濃度比在Fe2+中高。

從圖1-A可知，隨著培養(yǎng)時間的進行，溶液中的SO42-逐漸增大，同時溶液中的pH值也逐漸下降，說明A. manzaensis菌逐漸將S0氧化成SO42-，并且生成H+，從而導致溶液pH的下降。

從圖1-B可以看出，在以Fe2+為能源底物培養(yǎng)過程中溶液中的Fe3+先增大后減小，而且在培養(yǎng)過程中發(fā)現(xiàn)A. manzaensis菌在Fe2+中生長時會有黃鉀鐵礬（MFe3（SO4）2（OH）6，M 為金屬離子）生成（公式1），伴隨著MFe3（SO4）2（OH）6的生成還有H+的產(chǎn)生，從而導致溶液體系pH值的下降，而且形成黃鉀鐵礬過程中會消耗大量的Fe3+，導致溶液中的Fe3+逐漸降低。

圖1 A. manzaensis菌在S0（A）和Fe2+（B）中的生長特性

2.2 A. manzaensis S0氧化相關(guān)基因的篩選及RT-qPCR的驗證

通過檢索NCBI數(shù)據(jù)庫中A. manzaensisYN-25的全基因組序列信息，并通過與其他已經(jīng)公布基因組的嗜熱古菌的基因進行BLAST比對，共找到20個可能與S0氧化基因（表 2），其中包括編碼古菌對S0氧化的初始反應步驟所需的硫氧化還原酶（Sulfur oxygenase-reductase）的sor基因，以及編碼其他的含硫代謝中間產(chǎn)物氧化酶的基因，例如編碼硫代硫酸鹽-醌氧還酶（Thiosulfate-quinone oxidoreductase）的tqo基因，編碼連四硫酸鹽水解酶（Tetrathionate hydrolase）的tetH基因等；同時還包括編碼電子傳遞體（Cytochrome B6）和末端氧化酶（aa3-type terminal oxidase、NADH ：ubiquinone oxidoreductase）的基因；值得注意的是在A. manzaensisYN-25的全基因組注釋信息中包含多個編碼硫還原蛋白家族（Sulfur reduction protein）的dsrE基因。對檢索的S0氧化基因的分類信息見圖 2。在NCBI數(shù)據(jù)庫中A. manzaensisYN-25的注釋信息中沒有編碼硫化物：醌氧化還原酶（Sulfide：quinone oxidoreductase（SQR））的基因sqr的注釋信息，進一步通過BLAST比對發(fā)現(xiàn)在A. manzaensis全基因組中登錄號為B6F84_03775（注釋信息為pyridine nucleotidedisulfide oxidoreductase）的基因與已有文獻報道的與A. manzaensis同一個Acidianus屬的不同種的A.hospitalisW1中的sqr同源性非常高，因此推測該基因在A. manzaensis菌中起到編碼SQR的功能。

為了驗證篩選的20個基因與S0氧化相關(guān)性，采用RT-qPCR對A. manzaensis菌在S0和Fe2+兩種不同能源底物下的基因表達差異進行轉(zhuǎn)錄水平的檢測。RT-qPCR結(jié)果（表 3）表明，通過數(shù)據(jù)庫篩選得到的20個A. manzaensis基因中有15個基因在S0能源底物下均表達上調(diào)，這些上調(diào)的基因中包括編碼對S0和含硫化合物進行氧化的各種酶、電子傳遞體、末端氧化酶、硫還原蛋白家族和硫酸根轉(zhuǎn)運蛋白酶的基因，說明這些基因與S0的氧化密切相關(guān)。有4個基因在兩種能源底物下表達差異并不明顯，值得注意的是soxl基因在S0能源底物下表達下調(diào)（即在Fe2+為能源底物時表達上調(diào)），推測該基因可能與Fe2+氧化相關(guān)。

表2 根據(jù)數(shù)據(jù)庫檢索得到的A. manzaensis S0氧化相關(guān)基因信息

2.3 A. manzaensis的硫氧化模型構(gòu)建

根據(jù)對A. manzaensis菌全基因組注釋信息的分析和RT-qPCR對所篩選的基因驗證結(jié)果，構(gòu)建了極端嗜酸熱古菌A. manzaensis的硫氧化模型（圖 3），即胞外的S0跨膜轉(zhuǎn)運（未知硫轉(zhuǎn)運蛋白）進入細胞內(nèi)后，經(jīng)SOR氧化還原生成S2O32-，SO32-和 H2S，該步反應是胞內(nèi)對S0進行氧化的重要步驟，但是該反應不能與電子傳遞進行偶聯(lián)產(chǎn)生能量，極端嗜酸熱古菌A. manzaensis主要通過對SOR反應形成的中間產(chǎn)物S2O32-，SO32-和H2S的進一步氧化產(chǎn)能，對這些中間產(chǎn)物氧化得到的電子會被傳遞給細胞膜上的氧化性醌（Q2+），使其形成還原性的醌（QH2），QH2最終被末端氧化酶氧化形成NADH和ATP，從而為細胞生長提供能量。而S0氧化后形成的終產(chǎn)物SO42-則通過硫酸根轉(zhuǎn)運蛋白酶（Sulfate ABC transporter permease）排到胞外。

圖2 A. manzaensis菌S0氧化基因功能分類及所占比例

表3 基因RT-qPCR結(jié)果

3 討論

極端嗜酸熱古菌的硫氧化在硫的生物地球化學循環(huán)和硫化礦的生物浸出中起著重要的作用，但是關(guān)于極端嗜酸熱古菌的硫氧化機理研究較少，主要是因為其最適生長條件大都是在極端的生理生化條件下（高溫、低pH），這給研究其相關(guān)的生化反應帶來了很大的困難。目前，隨著越來越多的極端嗜酸熱古菌的全基因組測序的完成，使得利用基因組信息分析相關(guān)代謝機理的模型成為可能。本文利用已公布的極端嗜酸熱古菌A. manzaensisYN-25的全基因組信息，通過數(shù)據(jù)庫比對初步篩選了20個可能與硫氧化相關(guān)的基因，并進一步通過RT-qPCR對篩選得到的基因從轉(zhuǎn)錄水平進行了驗證，共鑒定出了15個與硫氧化相關(guān)的基因，其中包含一系列編碼氧化S0及含硫中間產(chǎn)物的酶［19-20，23-24］，它們對應的編碼基因及蛋白酶在細胞中的定位及所涉及的反應等酶的相關(guān)特性見表4。

圖 3 極端嗜酸熱古菌A. manzaensis的硫氧化模型

SOR在古菌的硫氧化過程中起著重要的作用，但是該酶只存在細胞質(zhì)中，因此胞外的S0需要先經(jīng)過跨膜轉(zhuǎn)運進入到細胞質(zhì)中才能被SOR進行氧化還原反應生成能被進一步氧化的中間產(chǎn)物，但是對于古菌而言，該跨膜轉(zhuǎn)運蛋白至今未被找到。Rohwerder和Sand［21］根據(jù)對嗜酸氧化亞鐵硫桿菌的Acidithiobacillus ferrooxidans的研究提出S0可能被外膜富含巰基（P-SH）的外膜蛋白鍵和形成類似的Pr-SnH（n≥2）結(jié)構(gòu)化合物進而被轉(zhuǎn)運至細胞周質(zhì)空間被氧化（公式 2），其進一步基于同步輻射的原位顯微表征（synchrotron radiation based STXM、μ-XRF））發(fā)現(xiàn)，極端嗜酸熱古菌A. manzaensis在以S0為能源底物培養(yǎng)下的細胞表面的巰基（-SH）是在以Fe2+為能源底物培養(yǎng)下的2.14倍［22］，這表明對于極端嗜酸熱古菌而言，胞外的S0可能同樣被膜上富含-SH的蛋白鍵和形成Pr-SnH（n≥2）結(jié)構(gòu)的復化合物進入細胞中，該復合物在胞內(nèi)重新生成S0從而被SOR進行氧化還原反應生（圖 3）。值得注意的是，在A.manzaensis菌中含有多個編碼硫還原蛋白家族DsrE的基因，而且其在S0底物下的轉(zhuǎn)錄水平均高于在Fe2+為能源底物下，這說明該硫還原蛋白家族DsrE也參與了A. manzaensis的S0氧化過程。根據(jù)已有文獻報道，DsrE蛋白在A. ferrooxidans菌中能夠氧化硫烷硫（Sulfane sulfur，GSSH）（表 4）［23］，因此推測該蛋白家族在古菌中也起到相同的功能。此外，對A. manzaensis菌的全基因組的分析發(fā)現(xiàn)沒有編碼腺苷核苷還原酶（Adenosine phosphosulphate reductase，APS）和腺苷酰硫酸磷酸腺苷轉(zhuǎn)移酶（adenylylsulphate phosphate adenyltransferase，APAT）的基因，說明對于A. manzaensis而言，其硫氧化代謝途徑與已報道的其他嗜酸熱古菌Sulfolobus acidocaldarius和S.solfataricus等相比存在一定的差異［20，24-25］。

4 結(jié)論

本研究比較了極端嗜酸熱古菌A.manzaensis在S0和Fe2+兩種不同能源底物培養(yǎng)下的生長特性，結(jié)果表明細胞在不同的能源底物下可能通過不同的硫代謝途徑。通過實時定量PCR（RT-qPCR）比較了以單質(zhì)硫（S0）和亞鐵（Fe2+）兩種不同能源底物培養(yǎng)下的基因表達差異，共鑒定出了15個與硫氧化相關(guān)的基因，包括一系列編碼能氧化單質(zhì)硫（S0）及含硫中間產(chǎn)物酶、電子傳遞體、末端氧化酶、硫還原蛋白家族和硫酸根轉(zhuǎn)運蛋白酶的基因；同時，實時定量PCR還發(fā)現(xiàn)，A. manzaensis菌中含有多個dsre基因，這些dsre基因與硫的氧化密切相關(guān)?；谏鲜龇治觯狙芯繕?gòu)建了極端嗜酸熱古菌A.manzaensis的硫氧化模型，該模型與已報道的其他嗜酸熱古菌如Sulfolobus acidocaldarius和S. solfataricus等相比存在一定的差異。

表 4 極端嗜酸熱古菌A. manzaensis中S0及含硫化合物氧化相關(guān)酶的特性

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