乃門塔娜 張燕軍 劉東軍 李金泉

（1. 內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學動物科學學院，呼和浩特 010018；2. 內(nèi)蒙古大學哺乳動物生殖生物學及生物技術(shù)教育部重點實驗室，呼和浩特010070）

毛囊組織被稱為動態(tài)的微小器官，隨著機體的一生不斷周期性生長［1］。它不僅具有保護皮膚組織受損、感覺、免疫防護等重要的生物學功能，還包含多種干細胞維持著毛囊組織的體內(nèi)平衡。而毛囊的形態(tài)發(fā)生和再生均離不開毛囊干細胞（Hair follicle stem cells，HFSCs）。HFSCs因其獲取方便、創(chuàng)傷小、增殖能力強、可在體外多向分化等優(yōu)勢，日漸成為生物學與醫(yī)學領(lǐng)域的前沿［2-4］。國際上主要以小鼠和人的HFSCs為研究對象，對其鑒定標記、分化能力、應(yīng)用等方面有了較多的研究。對其它大動物如山羊、綿羊、馬等的毛囊研究較少。

阿爾巴斯絨山羊是內(nèi)蒙古地區(qū)肉絨兼?zhèn)涞膬?yōu)良品種，所產(chǎn)的高品質(zhì)羊絨具有柔軟、光滑、纖細的特性［5］。絨山羊是羊絨產(chǎn)品的主要來源。絨毛生長是一個復雜的過程，受環(huán)境、營養(yǎng)和遺傳等因子的影響［6］。隨著近些年自然環(huán)境的破壞、品種間的雜交，絨山羊的絨毛品質(zhì)也受到了不同程度的影響。保護絨山羊純種和保證絨毛優(yōu)良品質(zhì)是畜牧業(yè)及其產(chǎn)品發(fā)展的前提。在體外分離培養(yǎng)毛囊干細胞并對其進行生物學特性研究是探索毛發(fā)形態(tài)發(fā)生機制和毛囊多樣性的基礎(chǔ)。在之前的研究中，我們分離培養(yǎng)了阿爾巴斯絨山羊毛囊干細胞（gHFSCs），并對其進行了分化能力和多能性分析［7-8］。但目前gHFSCs的研究還較少，因此鑒定標記也較模糊。

本研究參考小鼠和人毛囊學領(lǐng)域的研究，選取了廣泛被應(yīng)用的標記 Krt15、Krt19、CD34［9］和Sox9［10］，檢測它們在阿爾巴斯絨山羊皮膚組織中的表達情況，旨在為今后在體外分類培養(yǎng)毛囊細胞提供鑒定標記選擇的實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 儀器 冰凍切片機Leica CM1900，共聚焦顯微鏡 Nikon A1 confocal。

1.1.2 試劑 包埋劑（Tissue-Tek4583，OCT，SAKURA），4%多聚甲醛（P6148，Sigma），TritonX-100（9002-93-1，Sigma），山羊血清（SL2-10，Solarbio），PBS（SH30028，Hyclone）。RNAiso Plus（9109），Prime ScriptTMRT reagent kit（RR047A） 和 SYBRRPremix Ex Taq（RR820A）均購自寶生物技術(shù)有限公司。實驗中所用到的Sox9抗體（ab185966）、Krt15抗 體（ab52816）、krt19抗 體（ab52625）、CD34抗體（ab81289）及Cy3標記二抗（ab6939）均購自Abcam（USA，Cambridge）公司。

1.1.3 皮膚樣 阿爾巴斯絨山羊皮膚組織由內(nèi)蒙古億維白絨山羊種羊場提供。

1.1.4 細胞 gHFSCs為實驗室保存（gHFSCs的分離鑒定及培養(yǎng)方法見參考文獻［7］。

1.2 方法

1.2.1 冰凍切片免疫組化 待切片機溫度降至-20℃，進行組織包埋（-20℃，15 min）將其固定在切片機圓盤上。調(diào)厚度為8 μm進行切片。小心將切片貼附于載玻片上，滴加4%多聚甲醛室溫固定15 min后，0.5% TritonX-100通透10 min，PBS清洗（×3）。10%正常山羊血清（PBS稀釋）室溫封閉1 h，傾去血清，滴加1∶300稀釋的（封閉液稀釋）相應(yīng)的一抗，4℃孵育過夜。次日滴加1∶500稀釋的（PBS稀釋）Cy3標記的二抗37℃避光孵育45 min。PBS清洗（×3次）。最后1∶1 000稀釋（PBS稀釋）的DAPI避光復染10 min，PBS清洗。全部染色結(jié)束后，進行共聚焦顯微鏡照相（A1 confocal microscope，Nikon，Japan）。

1.2.2 gHFSCs復蘇培養(yǎng) 紫外燈照射超凈工作臺30 min，預(yù)熱細胞培養(yǎng)液后，將其放入超凈臺。從液氮罐中取出凍存管，于37℃水浴鍋中快速解凍。待管內(nèi)液體全部融化后，移至超凈臺中。吸取適量細胞培養(yǎng)液與解凍細胞按1∶10比例加入離心管中，輕輕混勻，800 r/min離心5 min，去上清。加入適量培養(yǎng)液重懸細胞，接種到六孔板中，置于37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，次日換液。細胞匯合度達到80%時進行傳代培養(yǎng)。

1.2.3 生長曲線檢測 細胞傳代的同時一部分細胞進行計數(shù)，按1×104個/mL量接種到24孔板中。每24 h消化3個孔進行細胞計數(shù)。連續(xù)計數(shù)8 d，以每次所計平均數(shù)和時間繪制細胞生長曲線。

1.2.4 細胞免疫組化 按1×105個/mL將細胞接種到24孔板（圓蓋玻片）中，當細胞匯合度達70%左右，棄掉培養(yǎng)液，加入4%多聚甲醛在室溫固定10 min。棄掉固定液，PBS清洗（×3），加入0.05%Triton X-100，室溫通透10 min（標記為膜蛋白時不做通透）。封閉、孵抗體、復染步驟與冰凍切片免疫組化操作相同，不再贅述。

1.2.5 實時定量PCR 根據(jù)GenBank中基因序列設(shè)計了絨山羊Krt15、CD34和Sox9特異引物（NCBI中未找到山羊krt19的序列），通過實時定量PCR的方法檢測選取的標記基因在個gHFSCs中RNA水平表達。引物序列見表1。RNAiso Plus裂解細胞提取總RNA。用PrimeScriptTMRT反轉(zhuǎn)錄試劑盒將提取的RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA備用。實時定量PCR反應(yīng)體系為2×SYBR Green混合液10 μL，上下游引物各0.5 μL，模板 1 μL，無酶水 8 μL，總體積為 20 μL。實時定量PCR程序為95℃預(yù)變性30 s后進行40個95℃5 s，60℃30 s的循環(huán)。以GAPDH為內(nèi)參基因，同一組織來源的角質(zhì)細胞（Goat keratinocytes，gKCs）為對照細胞，每個基因mRNA相對水平通過3次重復實驗的數(shù)據(jù)，用2-ΔΔCt法計算。

表 1 Krt15，CD34，Sox9引物序列

2 結(jié)果

2.1 Krt15、Krt19、CD34和Sox9均在隆突部表達

冰凍切片免疫組化顯示（圖1），4個標記蛋白在初級毛囊外根鞘中均表達，且可區(qū)別。Krt15和Krt19表達位置相似，均在隆突部較強表達，且穩(wěn)定，在隆突部下端呈不連續(xù)表達；CD34在隆突部和隆突部下端都有表達，且在隆突部下端的表達較強；Sox9集中在隆突部表達，在毛球部也有少許表達。即Krt15、Krt19、CD34和Sox9在隆突部均表達。

圖1 皮膚組織冰凍切片免疫組化

2.2 在體外分離培養(yǎng)的gHFSCs中Krt15、Krt19、CD34和Sox9均表達

對應(yīng)皮膚組織冰凍切片實驗，在體外培養(yǎng)的gHFSCs中進行了細胞免疫組化染色。復蘇培養(yǎng)后的細胞鋪路狀生長，細胞連接緊密，貼附能力好，立體形態(tài)似巢，保持著毛囊干細胞的形態(tài)特征（圖2-A）。從接種1-3 d，細胞生長緩慢，處于潛伏期；第4天開始迅速增殖進入對數(shù)生長期；從第7天開始細胞生長速度減慢，出現(xiàn)少量凋亡，逐漸進入平臺期，呈現(xiàn)典型的潛伏期、對數(shù)生長期和平臺期（圖2-B），說明生長狀態(tài)良好，可以用于后續(xù)檢測試驗。實時定量PCR檢測了Krt15、Krt19、CD34和Sox9在gHFSCs中轉(zhuǎn)錄水平的表達（圖2-C）。對其進行細胞免疫組化實驗，結(jié)果（圖3）顯示Krt15、Krt19、CD34和Sox9在gHFSCs中均呈陽性表達。

根據(jù)以上免疫組化的結(jié)果，繪制了可作為內(nèi)蒙古絨山羊毛囊干細胞候選鑒定標記的Krt15、Krt19、CD34和Sox9在阿爾巴斯絨山羊毛囊組織中的表達位置示意圖（圖4）。

3 討論

圖2 體外分離培養(yǎng)的阿爾巴斯絨山羊毛囊干細胞（gHFSCs）

由于物種之間的差異和毛囊中干細胞種類較多，選取標記蛋白時存在一定難度。在小鼠的研究中發(fā)現(xiàn)，表達Krt15的細胞可參與皮膚及附件組織的發(fā)生和再生所需的全部細胞系，具有較強的克隆形成能力［11］。Krt19是另一個主要的鑒定標記，在隆突部和隆突部底端表達［12］。在已有的皮膚基底層細胞培養(yǎng)中用Krt15和Krt19作為鑒定標記［13］。整合素β1也被用于人HFSCs的鑒定，但整合素β1在基底層細胞研究中應(yīng)用較多，被報道與基底層細胞增殖能力相關(guān)［14］。在我們之前的研究中也發(fā)現(xiàn)，整合素β1在體外培養(yǎng)的gHFSCs中轉(zhuǎn)錄水平和蛋白水平表達均較少，因此在本實驗中未對其進行檢測。CD34是小鼠皮膚干細胞的標記物，且在毛囊隆突部中與Krt15共表達［15］。隨著干細胞特性、多能性維持的不斷研究，轉(zhuǎn)錄因子成為了熱點，而干細胞自我更新和分化之間的平衡是通過一些轉(zhuǎn)錄因子的動態(tài)調(diào)控來維持的［16］。在小鼠中的研究得出Sox9是毛囊干細胞超級增強子（Super-enhancers）中關(guān)鍵的染色質(zhì)“變阻器”，是毛囊干細胞中動態(tài)的、密集的轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合平臺，調(diào)控譜系決定和分化中干細胞的時空狀態(tài)、干性和可塑性［17］。在發(fā)育時期和成體中，毛囊干細胞的發(fā)生和分化均受Sox9的影響［10］。

圖3 體外培養(yǎng)的gHFSCs細胞免疫組化染色

圖4 Krt15、Krt19、CD34和Sox9表達位置的示意圖

根據(jù)以上分析，本實驗選取了Krt15、Krt19、CD34和Sox9作為gHFSCs候選鑒定標記，對其進行了皮膚組織和細胞的免疫組化實驗。從皮膚組織冰凍切片結(jié)果可以看出，Krt15、Krt19、CD34和Sox9均表達的部位為毛囊隆突部。隆突部來源的干細胞應(yīng)為以上4個候選標記均陽性。復蘇后的gHFSCs形態(tài)和生長情況均良好，細胞免疫組化結(jié)果顯示，體外培養(yǎng)的gHFSCs為Krt15、Krt19、CD34和Sox9均陽性，與毛囊組織切片的結(jié)果吻合，證明在我們之前實驗中得到的細胞確實為隆突部毛囊干細胞，且這4種蛋白可作為隆突部來源的毛囊干細胞的鑒定標記。冰凍切片的結(jié)果表明，Krt15和Krt19在隆突部表達情況相同，在今后的實驗中可以選擇Krt15、Krt19兩者或其一作為gHFSCs鑒定標記；CD34在隆突部下端的表達比隆突部強，所以CD34需與其他標記結(jié)合起來應(yīng)用于gHFSCs鑒定；在毛囊組織中Sox9集中在隆突部表達，是最理想的gHFSCs鑒定標記。已有的研究和本研究中的細胞免疫組化實驗證明，Krt15、Krt19主要在細胞質(zhì)內(nèi)表達；Sox9在細胞質(zhì)和細胞核內(nèi)均表達；CD34為細胞膜蛋白。毛囊細胞的分離方法主要有流式分選、組織貼壁培養(yǎng)，因此根據(jù)具體分離方法和抗體的情況選擇標記蛋白。流式分選可選擇CD34+Krt15（Krt19）、Sox9或者CD34+Sox9；組織貼壁培養(yǎng)可選擇與流式分選相同的抗體，也可選擇細胞質(zhì)蛋白和核蛋白的組合。

4 結(jié)論

本研究借助免疫組化的方法確定了Krt15、Krt19、CD34和Sox9均表達的部位為隆突部，且在體外培養(yǎng)的gHFSCs中均呈陽性表達，因此可作為阿爾巴斯絨山羊毛囊隆突部來源的毛囊干細胞的鑒定標記。綜合分離方法及實驗需求建議在體外分離培養(yǎng)絨山羊毛囊干細胞時選擇Krt15/Krt19、CD34和Sox9作為的鑒定標記。

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