乃門塔娜 張燕軍 劉東軍 李金泉

（1. 內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科學(xué)學(xué)院，呼和浩特 010018；2. 內(nèi)蒙古大學(xué)哺乳動物生殖生物學(xué)及生物技術(shù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，呼和浩特010070）

毛囊組織被稱為動態(tài)的微小器官，隨著機(jī)體的一生不斷周期性生長［1］。它不僅具有保護(hù)皮膚組織受損、感覺、免疫防護(hù)等重要的生物學(xué)功能，還包含多種干細(xì)胞維持著毛囊組織的體內(nèi)平衡。而毛囊的形態(tài)發(fā)生和再生均離不開毛囊干細(xì)胞（Hair follicle stem cells，HFSCs）。HFSCs因其獲取方便、創(chuàng)傷小、增殖能力強(qiáng)、可在體外多向分化等優(yōu)勢，日漸成為生物學(xué)與醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的前沿［2-4］。國際上主要以小鼠和人的HFSCs為研究對象，對其鑒定標(biāo)記、分化能力、應(yīng)用等方面有了較多的研究。對其它大動物如山羊、綿羊、馬等的毛囊研究較少。

阿爾巴斯絨山羊是內(nèi)蒙古地區(qū)肉絨兼?zhèn)涞膬?yōu)良品種，所產(chǎn)的高品質(zhì)羊絨具有柔軟、光滑、纖細(xì)的特性［5］。絨山羊是羊絨產(chǎn)品的主要來源。絨毛生長是一個復(fù)雜的過程，受環(huán)境、營養(yǎng)和遺傳等因子的影響［6］。隨著近些年自然環(huán)境的破壞、品種間的雜交，絨山羊的絨毛品質(zhì)也受到了不同程度的影響。保護(hù)絨山羊純種和保證絨毛優(yōu)良品質(zhì)是畜牧業(yè)及其產(chǎn)品發(fā)展的前提。在體外分離培養(yǎng)毛囊干細(xì)胞并對其進(jìn)行生物學(xué)特性研究是探索毛發(fā)形態(tài)發(fā)生機(jī)制和毛囊多樣性的基礎(chǔ)。在之前的研究中，我們分離培養(yǎng)了阿爾巴斯絨山羊毛囊干細(xì)胞（gHFSCs），并對其進(jìn)行了分化能力和多能性分析［7-8］。但目前gHFSCs的研究還較少，因此鑒定標(biāo)記也較模糊。

本研究參考小鼠和人毛囊學(xué)領(lǐng)域的研究，選取了廣泛被應(yīng)用的標(biāo)記 Krt15、Krt19、CD34［9］和Sox9［10］，檢測它們在阿爾巴斯絨山羊皮膚組織中的表達(dá)情況，旨在為今后在體外分類培養(yǎng)毛囊細(xì)胞提供鑒定標(biāo)記選擇的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 儀器 冰凍切片機(jī)Leica CM1900，共聚焦顯微鏡 Nikon A1 confocal。

1.1.2 試劑 包埋劑（Tissue-Tek4583，OCT，SAKURA），4%多聚甲醛（P6148，Sigma），TritonX-100（9002-93-1，Sigma），山羊血清（SL2-10，Solarbio），PBS（SH30028，Hyclone）。RNAiso Plus（9109），Prime ScriptTMRT reagent kit（RR047A） 和 SYBRRPremix Ex Taq（RR820A）均購自寶生物技術(shù)有限公司。實(shí)驗(yàn)中所用到的Sox9抗體（ab185966）、Krt15抗 體（ab52816）、krt19抗 體（ab52625）、CD34抗體（ab81289）及Cy3標(biāo)記二抗（ab6939）均購自Abcam（USA，Cambridge）公司。

1.1.3 皮膚樣 阿爾巴斯絨山羊皮膚組織由內(nèi)蒙古億維白絨山羊種羊場提供。

1.1.4 細(xì)胞 gHFSCs為實(shí)驗(yàn)室保存（gHFSCs的分離鑒定及培養(yǎng)方法見參考文獻(xiàn)［7］。

1.2 方法

1.2.1 冰凍切片免疫組化 待切片機(jī)溫度降至-20℃，進(jìn)行組織包埋（-20℃，15 min）將其固定在切片機(jī)圓盤上。調(diào)厚度為8 μm進(jìn)行切片。小心將切片貼附于載玻片上，滴加4%多聚甲醛室溫固定15 min后，0.5% TritonX-100通透10 min，PBS清洗（×3）。10%正常山羊血清（PBS稀釋）室溫封閉1 h，傾去血清，滴加1∶300稀釋的（封閉液稀釋）相應(yīng)的一抗，4℃孵育過夜。次日滴加1∶500稀釋的（PBS稀釋）Cy3標(biāo)記的二抗37℃避光孵育45 min。PBS清洗（×3次）。最后1∶1 000稀釋（PBS稀釋）的DAPI避光復(fù)染10 min，PBS清洗。全部染色結(jié)束后，進(jìn)行共聚焦顯微鏡照相（A1 confocal microscope，Nikon，Japan）。

1.2.2 gHFSCs復(fù)蘇培養(yǎng) 紫外燈照射超凈工作臺30 min，預(yù)熱細(xì)胞培養(yǎng)液后，將其放入超凈臺。從液氮罐中取出凍存管，于37℃水浴鍋中快速解凍。待管內(nèi)液體全部融化后，移至超凈臺中。吸取適量細(xì)胞培養(yǎng)液與解凍細(xì)胞按1∶10比例加入離心管中，輕輕混勻，800 r/min離心5 min，去上清。加入適量培養(yǎng)液重懸細(xì)胞，接種到六孔板中，置于37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，次日換液。細(xì)胞匯合度達(dá)到80%時進(jìn)行傳代培養(yǎng)。

1.2.3 生長曲線檢測 細(xì)胞傳代的同時一部分細(xì)胞進(jìn)行計數(shù)，按1×104個/mL量接種到24孔板中。每24 h消化3個孔進(jìn)行細(xì)胞計數(shù)。連續(xù)計數(shù)8 d，以每次所計平均數(shù)和時間繪制細(xì)胞生長曲線。

1.2.4 細(xì)胞免疫組化 按1×105個/mL將細(xì)胞接種到24孔板（圓蓋玻片）中，當(dāng)細(xì)胞匯合度達(dá)70%左右，棄掉培養(yǎng)液，加入4%多聚甲醛在室溫固定10 min。棄掉固定液，PBS清洗（×3），加入0.05%Triton X-100，室溫通透10 min（標(biāo)記為膜蛋白時不做通透）。封閉、孵抗體、復(fù)染步驟與冰凍切片免疫組化操作相同，不再贅述。

1.2.5 實(shí)時定量PCR 根據(jù)GenBank中基因序列設(shè)計了絨山羊Krt15、CD34和Sox9特異引物（NCBI中未找到山羊krt19的序列），通過實(shí)時定量PCR的方法檢測選取的標(biāo)記基因在個gHFSCs中RNA水平表達(dá)。引物序列見表1。RNAiso Plus裂解細(xì)胞提取總RNA。用PrimeScriptTMRT反轉(zhuǎn)錄試劑盒將提取的RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA備用。實(shí)時定量PCR反應(yīng)體系為2×SYBR Green混合液10 μL，上下游引物各0.5 μL，模板 1 μL，無酶水 8 μL，總體積為 20 μL。實(shí)時定量PCR程序?yàn)?5℃預(yù)變性30 s后進(jìn)行40個95℃5 s，60℃30 s的循環(huán)。以GAPDH為內(nèi)參基因，同一組織來源的角質(zhì)細(xì)胞（Goat keratinocytes，gKCs）為對照細(xì)胞，每個基因mRNA相對水平通過3次重復(fù)實(shí)驗(yàn)的數(shù)據(jù)，用2-ΔΔCt法計算。

表 1 Krt15，CD34，Sox9引物序列

2 結(jié)果

2.1 Krt15、Krt19、CD34和Sox9均在隆突部表達(dá)

冰凍切片免疫組化顯示（圖1），4個標(biāo)記蛋白在初級毛囊外根鞘中均表達(dá)，且可區(qū)別。Krt15和Krt19表達(dá)位置相似，均在隆突部較強(qiáng)表達(dá)，且穩(wěn)定，在隆突部下端呈不連續(xù)表達(dá)；CD34在隆突部和隆突部下端都有表達(dá)，且在隆突部下端的表達(dá)較強(qiáng)；Sox9集中在隆突部表達(dá)，在毛球部也有少許表達(dá)。即Krt15、Krt19、CD34和Sox9在隆突部均表達(dá)。

圖1 皮膚組織冰凍切片免疫組化

2.2 在體外分離培養(yǎng)的gHFSCs中Krt15、Krt19、CD34和Sox9均表達(dá)

對應(yīng)皮膚組織冰凍切片實(shí)驗(yàn)，在體外培養(yǎng)的gHFSCs中進(jìn)行了細(xì)胞免疫組化染色。復(fù)蘇培養(yǎng)后的細(xì)胞鋪路狀生長，細(xì)胞連接緊密，貼附能力好，立體形態(tài)似巢，保持著毛囊干細(xì)胞的形態(tài)特征（圖2-A）。從接種1-3 d，細(xì)胞生長緩慢，處于潛伏期；第4天開始迅速增殖進(jìn)入對數(shù)生長期；從第7天開始細(xì)胞生長速度減慢，出現(xiàn)少量凋亡，逐漸進(jìn)入平臺期，呈現(xiàn)典型的潛伏期、對數(shù)生長期和平臺期（圖2-B），說明生長狀態(tài)良好，可以用于后續(xù)檢測試驗(yàn)。實(shí)時定量PCR檢測了Krt15、Krt19、CD34和Sox9在gHFSCs中轉(zhuǎn)錄水平的表達(dá)（圖2-C）。對其進(jìn)行細(xì)胞免疫組化實(shí)驗(yàn)，結(jié)果（圖3）顯示Krt15、Krt19、CD34和Sox9在gHFSCs中均呈陽性表達(dá)。

根據(jù)以上免疫組化的結(jié)果，繪制了可作為內(nèi)蒙古絨山羊毛囊干細(xì)胞候選鑒定標(biāo)記的Krt15、Krt19、CD34和Sox9在阿爾巴斯絨山羊毛囊組織中的表達(dá)位置示意圖（圖4）。

3 討論

圖2 體外分離培養(yǎng)的阿爾巴斯絨山羊毛囊干細(xì)胞（gHFSCs）

由于物種之間的差異和毛囊中干細(xì)胞種類較多，選取標(biāo)記蛋白時存在一定難度。在小鼠的研究中發(fā)現(xiàn)，表達(dá)Krt15的細(xì)胞可參與皮膚及附件組織的發(fā)生和再生所需的全部細(xì)胞系，具有較強(qiáng)的克隆形成能力［11］。Krt19是另一個主要的鑒定標(biāo)記，在隆突部和隆突部底端表達(dá)［12］。在已有的皮膚基底層細(xì)胞培養(yǎng)中用Krt15和Krt19作為鑒定標(biāo)記［13］。整合素β1也被用于人HFSCs的鑒定，但整合素β1在基底層細(xì)胞研究中應(yīng)用較多，被報道與基底層細(xì)胞增殖能力相關(guān)［14］。在我們之前的研究中也發(fā)現(xiàn)，整合素β1在體外培養(yǎng)的gHFSCs中轉(zhuǎn)錄水平和蛋白水平表達(dá)均較少，因此在本實(shí)驗(yàn)中未對其進(jìn)行檢測。CD34是小鼠皮膚干細(xì)胞的標(biāo)記物，且在毛囊隆突部中與Krt15共表達(dá)［15］。隨著干細(xì)胞特性、多能性維持的不斷研究，轉(zhuǎn)錄因子成為了熱點(diǎn)，而干細(xì)胞自我更新和分化之間的平衡是通過一些轉(zhuǎn)錄因子的動態(tài)調(diào)控來維持的［16］。在小鼠中的研究得出Sox9是毛囊干細(xì)胞超級增強(qiáng)子（Super-enhancers）中關(guān)鍵的染色質(zhì)“變阻器”，是毛囊干細(xì)胞中動態(tài)的、密集的轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合平臺，調(diào)控譜系決定和分化中干細(xì)胞的時空狀態(tài)、干性和可塑性［17］。在發(fā)育時期和成體中，毛囊干細(xì)胞的發(fā)生和分化均受Sox9的影響［10］。

圖3 體外培養(yǎng)的gHFSCs細(xì)胞免疫組化染色

圖4 Krt15、Krt19、CD34和Sox9表達(dá)位置的示意圖

根據(jù)以上分析，本實(shí)驗(yàn)選取了Krt15、Krt19、CD34和Sox9作為gHFSCs候選鑒定標(biāo)記，對其進(jìn)行了皮膚組織和細(xì)胞的免疫組化實(shí)驗(yàn)。從皮膚組織冰凍切片結(jié)果可以看出，Krt15、Krt19、CD34和Sox9均表達(dá)的部位為毛囊隆突部。隆突部來源的干細(xì)胞應(yīng)為以上4個候選標(biāo)記均陽性。復(fù)蘇后的gHFSCs形態(tài)和生長情況均良好，細(xì)胞免疫組化結(jié)果顯示，體外培養(yǎng)的gHFSCs為Krt15、Krt19、CD34和Sox9均陽性，與毛囊組織切片的結(jié)果吻合，證明在我們之前實(shí)驗(yàn)中得到的細(xì)胞確實(shí)為隆突部毛囊干細(xì)胞，且這4種蛋白可作為隆突部來源的毛囊干細(xì)胞的鑒定標(biāo)記。冰凍切片的結(jié)果表明，Krt15和Krt19在隆突部表達(dá)情況相同，在今后的實(shí)驗(yàn)中可以選擇Krt15、Krt19兩者或其一作為gHFSCs鑒定標(biāo)記；CD34在隆突部下端的表達(dá)比隆突部強(qiáng)，所以CD34需與其他標(biāo)記結(jié)合起來應(yīng)用于gHFSCs鑒定；在毛囊組織中Sox9集中在隆突部表達(dá)，是最理想的gHFSCs鑒定標(biāo)記。已有的研究和本研究中的細(xì)胞免疫組化實(shí)驗(yàn)證明，Krt15、Krt19主要在細(xì)胞質(zhì)內(nèi)表達(dá)；Sox9在細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核內(nèi)均表達(dá)；CD34為細(xì)胞膜蛋白。毛囊細(xì)胞的分離方法主要有流式分選、組織貼壁培養(yǎng)，因此根據(jù)具體分離方法和抗體的情況選擇標(biāo)記蛋白。流式分選可選擇CD34+Krt15（Krt19）、Sox9或者CD34+Sox9；組織貼壁培養(yǎng)可選擇與流式分選相同的抗體，也可選擇細(xì)胞質(zhì)蛋白和核蛋白的組合。

4 結(jié)論

本研究借助免疫組化的方法確定了Krt15、Krt19、CD34和Sox9均表達(dá)的部位為隆突部，且在體外培養(yǎng)的gHFSCs中均呈陽性表達(dá)，因此可作為阿爾巴斯絨山羊毛囊隆突部來源的毛囊干細(xì)胞的鑒定標(biāo)記。綜合分離方法及實(shí)驗(yàn)需求建議在體外分離培養(yǎng)絨山羊毛囊干細(xì)胞時選擇Krt15/Krt19、CD34和Sox9作為的鑒定標(biāo)記。

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