張婧波 吳劍榮 蔣蕓 楊迪 詹曉北

（江南大學生物工程學院 工業(yè)生物技術(shù)教育部重點實驗室，無錫 214122）

隨著城市化提高和對空氣質(zhì)量的要求，許多城市對家庭和餐飲店油煙機尾氣排放提高要求。我國食用油在2016年消耗約3 000萬t，按照15%的排放量，則產(chǎn)生約450萬t地溝油，其中約30萬t來自清洗抽油煙機時倒入下水道產(chǎn)生的［1］。大量的抽油煙機廢油直接排入下水道，沒有適當?shù)奶幚?，這對市政的生物廢水處理過程有較大負面影響。因此，抽油煙機廢油的回收和有效處置已經(jīng)成為迫切解決的問題。抽油煙機廢油的主要成分為順式、反式游離脂肪酸、脂肪甘油酯和鹽，能被銅綠假單胞桿菌利用生產(chǎn)生物表面活性劑鼠李糖脂［2］。

生物表面活性劑（Biosurfactant）是一種天然的具有親水、親脂性質(zhì)的物質(zhì)，主要通過微生物發(fā)酵獲得，常見有鼠李糖脂、槐糖脂、脂肽、中性類脂衍生物或多糖脂等［3］，其中研究最早和最多的是銅綠假單胞菌所產(chǎn)生的鼠李糖脂［4］。鼠李糖脂是一種陰離子生物表面活性劑，其結(jié)構(gòu)由1-2個鼠李糖（親水基）鏈接1-2個飽和或不飽和的脂肪酸（疏水基）構(gòu)成［5］，主要通過假單胞菌、伯克氏菌、不動桿菌和腸動桿菌屬代謝產(chǎn)生，但是不同的菌株代謝活性差異較大，鼠李糖脂的產(chǎn)量、表面活性及同系物的組成也會有所不同［6-8］。鼠李糖脂在石油工業(yè)、日用化工、食品領(lǐng)域和農(nóng)業(yè)領(lǐng)域擁有廣闊的應用前景，但鼠李糖脂的工業(yè)化生產(chǎn)受限于較高的原料成本、泡沫控制成本和高昂的提取純化費用。目前鼠李糖脂的發(fā)酵一般以油料為底物，如豆油［9］、棕櫚油［10］、玉米油［11］和葵花籽油［12］，其中以豆油為碳源生產(chǎn)的鼠李糖脂的產(chǎn)量可達70.6 g/L。但是以油料為底物存在發(fā)酵成本過高、產(chǎn)品提取純化工藝復雜的問題。近幾年來，尋找鼠李糖脂發(fā)酵的廉價替代碳源已經(jīng)成為研究熱點，如地溝油、植物油煉油廢棄物、工業(yè)廢棄脂肪酸［13］和廚房油炸剩下廢食用油［14-16］。此外，制造生物柴油的副產(chǎn)物甘油也可以應用鼠李糖脂發(fā)酵，只是發(fā)酵周期比較長且泡沫難以控制［17］?？傮w來看，發(fā)酵產(chǎn)鼠李糖脂的原料占據(jù)較高成本，阻礙其大規(guī)模應用。

目前很少有文獻和專利報道抽油煙機廢油再利用技術(shù)，相對簡單的利用有做肥皂［18］和固體酒精［19］，或作為增塑劑合成的原料［20］。本研究主要探討利用從中式抽油煙機收集的廢油脂為底物發(fā)酵產(chǎn)鼠李糖脂的可能性，旨在降低生產(chǎn)鼠李糖脂的成本，解決因抽煙機廢油直接倒入下水道所造成的環(huán)境污染問題。當然，從分散的家庭中收集油煙機廢油所需成本較大，因此，在未來可以考慮特制簡易微好氧發(fā)酵系統(tǒng)用于家庭獨立發(fā)酵處理油煙機廢油，本研究前期測試表明這種微好氧系統(tǒng)可以正常利用油煙機廢油進行鼠李糖脂發(fā)酵。

1 材料與方法

1.1 材料

以銅綠假單胞菌（Pseudomonas aeruginosa）WB505為出發(fā)菌體，保藏于江南大學生物工程學院生化工程研究室。

斜面培養(yǎng)基（g/L）：氯化鈉 5，酵母粉 5，胰蛋白胨 5，瓊脂 20，pH 7.0（滅菌前）。

種子培養(yǎng)基（LB培養(yǎng)基，g/L）：氯化鈉 5，酵母粉 5，胰蛋白胨 5，pH 7.0（滅菌前）。

發(fā)酵培養(yǎng)基（g/L）：抽油煙機廢油 40，NaNO36，Na2HPO4·12H2O 1，KH2PO41，F(xiàn)eSO4·7H2O 0.01，MgSO4·7H2O 0.1，pH7.0（滅菌前）。

1.2 方法

1.2.1 鼠李糖脂的提取方法 發(fā)酵液于12 000 r/min離心，15 min后，取上清液調(diào)節(jié)pH為2.0，加入3倍體積的乙酸乙酯試劑萃取3次。收集有機相，于60℃旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀去除乙酸乙酯，即得到鼠李糖脂粗提液。

1.2.2 生物量的測定 取5.0 mL發(fā)酵液，于8 000 r/min離心15 min，去除上清液，并用去離子水清洗3次并放置在真空干燥箱，烘干至恒重，通過分析天平稱重并計算其生物量。

1.2.3 鼠李糖脂含量的測定 鼠李糖脂含量的測定采用蒽酮-硫酸法［21］。將粗提取的鼠李糖脂加蒸餾水復溶到合適的濃度，取1 mL復溶樣品加入5 mL蒽酮硫酸試劑，沸水浴15 min后，冷卻至室溫，測定OD620值，得到的鼠李糖含量乘以系數(shù)3即可得到鼠李糖脂含量。

1.2.4 臨界膠束濃度（CMC）的測定 用鉑金環(huán)法測定一系列不同濃度鼠李糖脂溶液的表面張力，以其濃度為橫坐標，表面張力為縱坐標繪制曲線，曲線的拐點處即為此體系中表面活性劑的CMC值［22］。

1.2.5 乳化能力（E24）的測定 在平底試管中加入2 mL的烷烴和鼠李糖脂溶液（1 g/L），混合液37℃預熱后高速漩渦震蕩2 min，乳化液37℃放置24 h后測定乳化相體積，并以乳化相體積與總體積比值（%）表示乳化能力［23］。

1.2.6 鼠李糖脂組成結(jié)構(gòu)的測定 本實驗使用MALDI-TOF MS 分析發(fā)酵所得鼠李糖脂組成［24］。使用氮氣激光波長（337 nm），基質(zhì)為2，5-二羥基苯甲酸，控制軟件為flexControl，分析軟件為flexAnalysis versison 3.3，試驗方法為RP200-1500（反射模式：正離子）。

2 結(jié)果

2.1 抽油煙機廢油濃度對發(fā)酵產(chǎn)鼠李糖脂的影響

在搖瓶中測試不同濃度抽油煙機廢油對P.aeruginosaWB505發(fā)酵鼠李糖脂的影響，結(jié)果如圖1所示。當抽油煙機廢油為40 g/L時，鼠李糖脂的產(chǎn)量最大，可達到7.9±0.29 g/L。當碳源繼續(xù)增加鼠李糖脂的產(chǎn)量下降，可能是碳源過量，形成油包水體系抑制菌體的代謝。

圖 1 抽油煙機廢油濃度對鼠李糖脂發(fā)酵的影響

2.2 NaNO3濃度對發(fā)酵產(chǎn)鼠李糖脂的影響

以40 g/L的抽油煙機廢油為碳源，研究不同NaNO3濃度對發(fā)酵產(chǎn)鼠李糖脂的影響。從圖2可以看出，不同的NaNO3濃度對產(chǎn)鼠李糖脂有一定的影響，當NaNO3濃度為6 g/L時，鼠李糖脂的產(chǎn)量最高，可達到8.5±0.24 g/L。隨后隨著NaNO3濃度的增大鼠李糖脂的產(chǎn)量在逐漸的降低。

圖 2 NaNO3濃度對鼠李糖脂發(fā)酵的影響

2.3 鼠李糖脂發(fā)酵的過程曲線

將培養(yǎng)好的種子按10%的接種量接入7 L的發(fā)酵罐中，過程曲線如圖3所示。菌體經(jīng)過短暫的停滯期，培養(yǎng)12 h后開始進入對數(shù)生長期；隨著菌體的生長，發(fā)酵液的pH值開始降低并在生物量達到最大時降至最低，隨后又逐步增加并趨于穩(wěn)定，這可能與生長的過程有機酸產(chǎn)生有關(guān)。鼠李糖脂的生成與菌體的生長并不平行，鼠李糖脂的生成滯后于菌體生長，當菌體進入對數(shù)期時鼠李糖脂的增長速度較穩(wěn)定期和衰亡期緩慢，說明鼠李糖脂作為銅綠假單胞桿菌的次級代謝產(chǎn)物在穩(wěn)定期后生成速率最大，并在80 h達到最高12.3±0.52 g/L。發(fā)酵48 h之后，發(fā)酵液的上清液的表面張力由60.5±0.81 mN/m降至26.2±0.79 mN/m，之后表面張力有稍微的上升趨勢，但是基本趨于穩(wěn)定，說明此時上清液的濃度已達到其臨界膠束濃度。

圖 3 銅綠假單胞菌WB505發(fā)酵鼠李糖脂的過程曲線

2.4 鼠李糖脂的結(jié)構(gòu)分析

微生物發(fā)酵生產(chǎn)所得到的鼠李糖脂通常以混合物形式存在。本實驗中利用MALDI-TOF MS 確定鼠李糖脂混合物的組成并利用不同結(jié)構(gòu)鼠李糖脂的相對豐度估算其含量。從圖4中可以發(fā)現(xiàn)，鼠李糖脂在m/z為673.3有最高峰，代表雙鼠李糖脂Rha2-C10-C10的［M+Na］+加合離子。而單鼠李糖脂含量較高的峰出現(xiàn)在m/z 527.2處，對應產(chǎn)物為Rha-C10-C10，最終得到的單鼠李糖脂和雙鼠李糖脂的主要成分、組成及相對豐度如圖4和表1所示。

圖4 銅綠假單胞菌發(fā)酵生產(chǎn)鼠李糖脂質(zhì)譜圖

表1 銅綠假單胞菌WB505利用油煙機廢油產(chǎn)鼠李糖脂的主要同系物分析

2.5 鼠李糖脂的臨界膠束濃度

隨著鼠李糖脂濃度的上升，溶液表面張力逐漸下降，當表面張力下降到一定值后繼續(xù)增加鼠李糖脂濃度溶液表面張力也不再下降，說明此時已達到臨界膠束濃度。從圖5可以看出，以抽油煙機廢油為底物所產(chǎn)鼠李糖脂CMC為45.0 mg/L，能將其表面張力降低至25.3±0.68 mN/m。

圖5 銅綠假單胞菌所產(chǎn)生物表面活性劑CMC測定曲線

2.6 鼠李糖脂乳化性能

鼠李糖脂與實驗中的幾種烴類物質(zhì)充分混合后形成乳白色的乳化液，剛開始乳化相體積并不穩(wěn)定，隨著時間的延長，乳化體積趨于穩(wěn)定，穩(wěn)定時間大約是24 h。從圖6可以看出，鼠李糖脂對幾種常見的烴類物質(zhì)的乳化系數(shù)均超過了60%，其中對苯的乳化系數(shù)最高達到了80.3±0.85%，具有優(yōu)越的工業(yè)應用價值。

圖6 銅綠假單胞菌發(fā)酵所產(chǎn)得鼠李糖脂對烴類物質(zhì)的乳化能力

3 討論

本研究從環(huán)保和低成本兩個角度考慮，首次以抽油煙機廢油為碳源生產(chǎn)生物表面活性劑鼠李糖脂。抽油煙機廢油是油煙冷凝而成的，成分十分復雜，含有大量的固體物質(zhì)和雜質(zhì)。本研究采用過濾、離心等方法進行處理，過濾后，于8 000 r/min離心15 min后取上清液即可去除固體物質(zhì)。廢油中主要含有一些醛類，烴類等致癌物質(zhì)，有害物質(zhì)對鼠李糖脂的發(fā)酵會產(chǎn)生很大的影響，通過研究發(fā)現(xiàn)可使用活性炭吸附去除部分有害物質(zhì)，有利于銅綠假單胞菌生長和鼠李糖脂發(fā)酵。Lotfabad等［25］研究不同碳氮源的濃度對鼠李糖脂的影響發(fā)現(xiàn)，當C/N在1/10-1/30之間時，鼠李糖脂維持在較高的水平，而本實驗分別以抽油煙機廢油和NaNO3為碳氮源且比例為3/20時鼠李糖脂的產(chǎn)量最高，此實驗結(jié)果也反映了銅綠假單胞菌產(chǎn)鼠李糖脂性能受菌株差異和培養(yǎng)條件的影響［26］。在7 L罐進行小試，發(fā)酵80 h時鼠李糖脂產(chǎn)量達到最高，且pH上升，這可能是發(fā)酵后期培養(yǎng)基中氮源耗盡，細胞死亡釋放堿性物質(zhì)致使發(fā)酵液pH升高。

臨界膠束濃度（CMC）是表面活性劑分子在溶劑中締合形成膠束的最低濃度，是評價表面活性劑性能的一個重要指標。臨界膠束濃度越低，說明該表面活性劑達到界面飽和吸附所需的濃度越低，因此較低濃度的該表面活性劑即能發(fā)揮其乳化、起泡、增溶、潤濕等表面活性作用。鼠李糖脂的臨界膠束濃度一般5 mg/L-200 mg/L［27］，發(fā)酵所產(chǎn)鼠李糖脂CMC為45.0 mg/L，能將其表面張力降低至25.3±0.68 mN/m，低的界面張力可以增加乳狀液的穩(wěn)定性［28］，從而間接的表明了所產(chǎn)鼠李糖脂的乳化能力增加。鼠李糖脂的臨界膠束濃度很大程度上取決于鼠李糖脂的組成，微生物發(fā)酵生產(chǎn)所得到的鼠李糖脂通常以混合物形式存在。鼠李糖脂混合物的組成對其性質(zhì)有很大的影響，組成上微小的變化也可能改變其理化性質(zhì)。如雙鼠李糖脂抑菌效果更好，而單鼠李糖脂的臨界膠束濃度更低［29］。并且鼠李糖脂的脂肪酸鏈越長其CMC越低，本實驗獲得產(chǎn)物中單雙鼠李糖脂的比例接近1∶1，使其疏水性更強［30］，對于實際應用更有意義。

4 結(jié)論

本研究驗證了銅綠假單胞菌可以利用中式抽油煙機廢油合成生物表面活性劑鼠李糖脂，在培養(yǎng)基中加入40 g/L抽油煙機廢油和6 g/L NaNO3可以獲得較高鼠李糖脂產(chǎn)量，結(jié)構(gòu)分析表明其主要組成為含Rha-C10-C10和Rha2-C10-C10，鼠李糖脂同系物的結(jié)構(gòu)與文獻報道相似，且具有良好的表面活性和乳化性。

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