薛晶晶 陳松筆

（中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院熱帶作物品種資源研究所 農(nóng)業(yè)部木薯種質(zhì)資源保護(hù)與利用重點實驗室，儋州 571737）

DNA甲基化是表觀遺傳學(xué)的重要內(nèi)容之一，在植物生長發(fā)育、防御、逆境脅迫等方面起著極其重要的作用［1］。DNA甲基化現(xiàn)象在高等植物中普遍存在，但不同植物種類甲基化水平存在差異，一般基因組DNA的30%-50%胞嘧啶處于甲基化狀態(tài)［2］。其中大部分的甲基化都發(fā)生在CpG二核苷酸和CpNpG 三核苷酸中，其他位點較少［1］。植物中DNA甲基化修飾主要發(fā)生在轉(zhuǎn)座子和重復(fù)序列上，主要作為基因組防御系統(tǒng)來維持基因組的穩(wěn)定，一方面沉默內(nèi)源的轉(zhuǎn)座子等“自私元件（Selfish DNA elements）”，另一方面可以抵抗外源病毒的入侵［3］。作為表觀遺傳的重要修飾途徑之一，DNA甲基化與基因表達(dá)調(diào)控［4］、基因組印記［5］和轉(zhuǎn)基因沉默［6］等生物學(xué)過程密切相關(guān)。Zilberman等［3］指出基因轉(zhuǎn)錄受甲基化影響，輕度甲基化的基因適量表達(dá)，本身發(fā)生去甲基化的基因表達(dá)將會增強(qiáng)。DNA甲基化在植物中的研究已有大量報道，其中擬南芥的研究最深入，為其他作物的DNA甲基化研究提供了參考。

木薯（Manihot esculentaCrantz） 是大戟科（Euphorbiaceae）木薯屬（MaihotP. Mill.）多年生植物，貯藏根淀粉含量在27%-34%之間，被譽(yù)為“淀粉之王”，是世界三大薯類作物之一，也是世界第六大糧食作物，具有重要的實用價值和經(jīng)濟(jì)價值，為熱帶、亞熱帶近10億人口提供基本食糧，是我國重要的工業(yè)淀粉和生物質(zhì)能源原料［7］。提高塊根淀粉含量，揭示淀粉合成機(jī)理是木薯研究的重點之一。DNA甲基化在植物生長發(fā)育過程中起著重要作用，本研究通過分析木薯塊根不同發(fā)育時期的基因組DNA甲基化變化情況，旨為木薯塊根淀粉合成機(jī)理提供表觀方面的依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

本研究采用生長于中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院熱帶作物品種資源研究所國家木薯種質(zhì)資源圃的華南5號（SC5）和Cas36-12兩個木薯（Manihot esculentaCrantz）種質(zhì)。其中，SC5塊根淀粉含量較高，而Cas36-12的淀粉含量較低。SC5和Cas36-12種植于2016年3月，分別選取其形成期（植后4個月）、膨大期（植后7個月）及成熟期（植后10個月）塊根作為研究材料。每個材料每個生育期隨機(jī)選取3個塊根，洗干凈切成小塊混合保存于-80℃冰箱中，取 3個重復(fù)。

1.2 方法

1.2.1 DNA提取與甲基化敏感擴(kuò)增多態(tài)性（MSAP）分析 木薯塊根總DNA采用TianGen植物基因組DNA提取試劑盒進(jìn)行提取，提取方法參考說明書。MSAP分析中酶切、連接、預(yù)擴(kuò)和選擴(kuò)參照薛晶晶等［8］的方法分析，采用EcoRⅠ、MspⅠ和HpaⅡ作為限制性內(nèi)切酶，雙酶切組合分別選用EcoRⅠ/MspⅠ和EcoRⅠ/HpaⅡ（NEB），接頭和引物序列如表1所示。

表1 接頭和引物序列

1.2.2 微流控毛細(xì)管電泳系統(tǒng)檢測甲基化條帶 采用PerkinElmer公司的LabChip GX Touch 24微流控毛細(xì)管電泳系統(tǒng)，使用HT DNA 1K微流控芯片進(jìn)行DNA甲基化條帶的分離，操作步驟參照DNA 1K Reagent Kit說明書進(jìn)行。具體操作流程如下：

（1）芯片準(zhǔn)備。使用前將芯片及試劑盒置于室溫20 min；制備膠-染料溶液（Gel-Dye），向 1管DNA Gel Matrix 中加入 13 μL DNA Dye Concentrate，旋渦混勻并將混合液轉(zhuǎn)入兩個帶有濾膜的離心管（Spin filters），室溫9 300 r/min離心7.5 min，丟棄濾膜，已過濾好的膠-染料混合液在4℃避光保存，可放置不超過三周。用去離子水分別清洗芯片上的孔1，3，4，7，8，10兩次。往孔3，7，8，10中加入50 μL Gel-Dye， 往 孔 4 中 加 入 50 μL 的 DNA Marker。用70%的異丙醇清潔芯片窗口的兩面，將芯片放入LabChip GX Touch儀器前確?？?是空的。

（2）DNA ladder 和Buffer Tube準(zhǔn)備。在0.2 mL Ladder Tube 中先后加入 108 μL 的 1X PCR buffer和 12 μL HT DNA ladder， 混勻 ；往 0.75 mL Buffer Tube中加入 750 μL 1X PCR Buffer；將 Ladder Tube，Buffer Tube分別放入LabChip GX Touch樣品板托架上的 ladder和buffer管槽中。

（3）DNA樣品的準(zhǔn)備。將本研究獲得的選擴(kuò)增 PCR 產(chǎn)物 20 μL 與 20 μL 1 X PCR buffer等 量 混合加入到96孔板中，并將96孔板置于LabChip GX Touch 樣品板上。

（4）按照儀器的操作說明進(jìn)行儀器的運行。儀器運行結(jié)束后采用LabChip GX Reviewer 5.2分析軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，將獲到的峰圖轉(zhuǎn)化為條帶，有峰位點“Yes”記為“1”，無峰位點“No”記為“0 ”。根據(jù)“1，0”統(tǒng)計結(jié)果，利用Excel分析其發(fā)育過程中的甲基化變化情況。

2 結(jié)果

2.1 SC5和Cas36-12不同發(fā)育期基因組DNA甲基化水平分析

本研究利用MSAP技術(shù)分析木薯SC5和Cas36-12的形成期、膨大期及成熟期的塊根基因組DNA 5'-CCGG位點胞嘧啶的甲基化水平和甲基化遺傳模式。MSAP方法的關(guān)鍵在于胞嘧啶的甲基化狀態(tài)會影響同裂酶HpaⅡ、MspⅠ的酶切反應(yīng)，經(jīng)PCR擴(kuò)增出的多態(tài)性片段能夠反映該位點的甲基化狀態(tài)及程度（表2和表3）。因此，此方法被廣泛用于動植物基因組甲基化分析。

表2 SC5不同發(fā)育期的甲基化水平

表3 Cas36-12不同發(fā)育期的甲基化水平

利用E1、E2分別與HM1-HM7配對組成的14對選擇性引物對SC5、Cas36-12的形成期、膨大期及成熟期的塊根進(jìn)行MSAP分析。結(jié)果顯示：SC5中共檢測到345個DNA甲基化位點，Cas36-12中共檢測到339個DNA甲基化位點。SC5中DNA甲基化水平（MSAPR%）隨著塊根的生長緩慢下降，由形成期的59.1%下降到成熟期的54.8%，全甲基化率（FMR%）呈現(xiàn)上升趨勢，由39.7%上升至45.8%，且膨大期與成熟期相同（表2，圖1）。而Cas36-12的MSAPR%和FMR%在膨大期時最大，達(dá)到49.3%和41.3%，至成熟期下降為48.7%和36.9%，但整體水平高于形成期的40.4%和34.2%（表3，圖1）。SC5整個發(fā)育期的MSAPR%和FMR%均比Cas36-12高，且兩個木薯品種在整個發(fā)育期的甲基化水平變化存在很大差異，推測可能與這兩個木薯品種的塊根淀粉含量差異巨大有關(guān)，且膨大期是整個塊根形成的關(guān)鍵期。

圖1 SC5、Cas36-12不同發(fā)育期塊根DNA甲基化水平變化

2.2 SC5和Cas36-12不同發(fā)育期甲基化狀態(tài)變化情況

甲基化狀態(tài)變化主要是指甲基化帶型的多態(tài)性變化，即SC5和Cas36-12塊根發(fā)育過程中的甲基化模式發(fā)生改變。將統(tǒng)計的多態(tài)性帶型分為3種類型，第一類（A-C）為不發(fā)生變化帶型，表明整個發(fā)育過程中，甲基化模式保持不變。第二類（D-I）為去甲基化類型，表明隨著塊根不斷生長，基因組DNA甲基化水平降低，其中 D、E、F為完全去甲基化，即所有被甲基化的胞嘧啶均發(fā)生去甲基化，G、H、I為部分去甲基化，即部分被甲基化的胞嘧啶發(fā)生去甲基化。第三類（J-O）為甲基化帶型，表明隨著塊根生長，基因組DNA甲基化水平升高，其中J、K、L為重新甲基化，即前一個生長期沒有甲基化，下一個生長期出現(xiàn)甲基化位點；M為全甲基化，即前一個生長期為單鏈外甲基化，下一個生長期變?yōu)殡p鏈內(nèi)甲基化；N、O為超甲基化，即在前一個生長期甲基化位點的基礎(chǔ)上，下一個生長期又有新的位點被甲基化（表4和表5）。

SC5塊根生長過程中，膨大期和成熟期不發(fā)生變化的甲基化狀態(tài)占49%和49.3%，分別有14.8%和15.7%的多態(tài)性帶型發(fā)生了去甲基化，25.5%和9.6%的多態(tài)性帶型發(fā)生了甲基化。其中，在整個發(fā)育過程中，全甲基化（0 1）帶型和半甲基化（1 0）帶型間沒有變化。第二類（去甲基化類型）中，從形成期到膨大期過程中，發(fā)生變化的甲基化模式主要以完全去甲基化為主；從膨大期到成熟期過程中，發(fā)生變化的甲基化模式主要以部分去甲基化為主。在第三類（甲基化類型）中，發(fā)生變化的甲基化模式主要以超甲基化為主。比較SC5塊根發(fā)育三個關(guān)鍵時期的甲基化變化情況，從形成期到膨大期，主要以發(fā)生甲基化為主；而從膨大期到成熟期，主要以去甲基化為主。

Cas36-12塊根生長過程中，膨大期和成熟期不發(fā)生變化的甲基化狀態(tài)占42.5%和47.5%，發(fā)生去甲基化的多態(tài)性帶型有13.3%和15.3%，發(fā)生甲基化的有24.5%和9.4%。其中，在整個發(fā)育過程中全甲基化（0 1）帶型和半甲基化（1 0）帶型間的轉(zhuǎn)變基本為0。第二類（去甲基化類型）中，膨大期與形成期相比，甲基化模式主要以完全去甲基化為主；而膨大期到成熟期的甲基化模式主要以部分去甲基化為主。第三類（甲基化類型）中，形成期到膨大期發(fā)生變化的甲基化模式主要以超甲基化為主，而膨大期到成熟期既有重新甲基化也有超甲基化的發(fā)生。比較Cas36-12塊根發(fā)育3個關(guān)鍵時期的甲基化變化情況，從形成期到膨大期，主要以發(fā)生甲基化為主；從膨大期到成熟期，主要以去甲基化為主。

比較SC5和Cas36-12塊根發(fā)育3個關(guān)鍵時期的甲基化變化情況，發(fā)現(xiàn)兩份材料甲基化變化的整體趨勢是一致的。形成期到膨大期主要以發(fā)生甲基化為主；而膨大期到成熟期，主要以去甲基化為主。推測在木薯生長過程中，基因組DNA的表觀修飾具有普遍規(guī)律性。

3 討論

真核生物中，表觀遺傳通過調(diào)控染色質(zhì)構(gòu)象進(jìn)而影響基因表達(dá)來調(diào)控植物的發(fā)育，其調(diào)控機(jī)制主要包括DNA甲基化、組蛋白修飾和小RNA干擾等，在植物的生長發(fā)育過程中起著至關(guān)重要的作用。種子萌發(fā)、開花、植株生長、程序性死亡等不同生長階段、不同生長特性的植物DNA甲基化變化是不

同的。因此，研究不同植物不同生長狀態(tài)下的DNA甲基化變化對表觀遺傳學(xué)在植物中的功能都具有重要意義。研究表明：基因的甲基化會受轉(zhuǎn)錄水平影響，基因甲基化抑制基因表達(dá)，而基因的去甲基化會使轉(zhuǎn)錄水平增加［6］。而高等植物DNA甲基化在不同植物和組織中差異較大，一般基因組DNA有30%-50%的胞嘧啶處于甲基化狀態(tài)，大多數(shù)低于50%［9，10］。本研究以兩份淀粉含量差異較大的木薯品種（SC5和Cas36-12）的不同生長期的塊根作為實驗材料，分析其不同生長期的DNA甲基化水平，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，SC5的DNA甲基化水平高于Cas36-12，且超過了50%，與茶樹［11］、牡丹［12］等的DNA甲基化水平相近，高于水稻［9］、擬南芥（35%-43%）［13］、棉花（41%）［10］等所報道的 DNA 甲基化水平。與Wang等［14］通過BS-seq測序?qū)δ臼砼c擬南芥的整體甲基化水平比較結(jié)果是一致的（木薯的甲基化水平高于擬南芥）。SC5和Cas36-12兩個品種的DNA甲基化水平在3個生長期的差異較大，與呂亞［15］對這兩個品種塊根代謝相關(guān)蛋白的表達(dá)趨勢是一致的，這可能和木薯基因組高度雜合的特性有關(guān)，與不同木薯品種塊根淀粉代謝機(jī)理有關(guān)。

表4 SC5生長過程中的DNA甲基化狀態(tài)變化情況

表5 Cas36-12生長過程中的DNA甲基化狀態(tài)變化情況

本研究采用的甲基化敏感擴(kuò)增多態(tài)性（MSAP）技術(shù)是一種改良的AFLP技術(shù)，主要根據(jù)對甲基化敏感性不同的2種限制性內(nèi)切酶HpaⅡ和MspⅠ對5'-CCGG-3'位點進(jìn)行酶切，2 種酶均能識別并切割 CCGG 序列，但是 2 種酶對該位點的敏感性不同，可切割產(chǎn)生不同片段，通過擴(kuò)增這些片段來揭示基因組的甲基化情況，是一種DNA甲基化檢測的經(jīng)典方法。該方法優(yōu)點是簡單易操作，使用方便，缺點是分辨率較低、假陽性較高且只能調(diào)查CCGG位點甲基化，獲得的甲基化位點數(shù)較少，未能覆蓋整個基因組，且選擇性引物的多少對獲得的甲基化位點也有一定影響。毛細(xì)管電泳（CE）具有高的分析效率、速度、微量、自動化和可定量等優(yōu)勢。利用MSAP技術(shù)結(jié)合毛細(xì)管電泳分析木薯塊根的甲基化情況，可靠性較好。為了準(zhǔn)確了解木薯塊根發(fā)育過程中的甲基化變化，本實驗下一步需要合成更多選擇性引物，來檢測其擴(kuò)增結(jié)果，同時利用液相色譜法、亞硫酸鹽測序、免疫共沉淀等方法驗證。

4 結(jié)論

本研究采用MSAP技術(shù)結(jié)合CE分析SC5和Cas36-12的DNA甲基化水平。SC5的DNA甲基化水平高于Cas36-12，且超過了50%。SC5和Cas36-12塊根發(fā)育3個關(guān)鍵期的甲基化變化趨勢一致。形成期到膨大期主要以發(fā)生甲基化為主；而膨大期到成熟期，主要以去甲基化為主。

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