謝志軍 嚴(yán)瑤琦 苗麗麗 邵 豐 孫 靜 李海昌 溫成平△

（1.浙江中醫(yī)藥大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，浙江 杭州 310053；2.浙江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第二醫(yī)院，浙江杭州 310005）

祛濁通痹復(fù)方是本課題組承擔(dān)的國(guó)家科技部 “十一五”支撐項(xiàng)目“血液免疫科常見病的中醫(yī)臨床治療研究”中的基本方劑。臨床研究表明本方對(duì)間歇期痛風(fēng)具有較強(qiáng)的抑制尿酸生成和促進(jìn)排泄作用，長(zhǎng)期使用未見明顯不良反應(yīng)。其處方主要由土茯苓、萆薢、姜黃、桑寄生等組成［1］。方中土茯苓為百合科植物光葉菝葜Smilax glabra Roxb.的干燥根莖，其味甘、淡，性平，據(jù)《本草綱目》記載，能“健脾胃，強(qiáng)筋骨，祛風(fēng)濕，利關(guān)節(jié)，止泄瀉”。現(xiàn)代藥理研究發(fā)現(xiàn)其含落新婦苷、異黃杞苷、胡蘿卜苷、鞣質(zhì)、樹脂己糖、淀粉、琥珀酸、棕櫚酸、白藜蘆醇、菝葜皂苷類等成分［2］，其所含落新婦苷具有鎮(zhèn)痛、利尿、抗菌、抗癌、解毒等藥理作用［3-5］；萆薢出自《神農(nóng)本草經(jīng)》，性味苦、平，歸肝、胃、膀胱經(jīng)，現(xiàn)代藥理研究發(fā)現(xiàn)其主要含有甾體皂苷、二芳基庚烷類及木脂素類等成分，能祛風(fēng)濕、利濕濁，其所含薯蕷皂苷元有消炎、抗菌、抗癌以及降血脂等多種作用［6-7］，其乙醇提取物能上調(diào)動(dòng)物腎臟中尿酸轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān)基因和蛋白的表達(dá)［8］；姜黃出自《唐本草》，性溫，味苦、辛，能破血行氣，通經(jīng)止痛，主含姜黃素、去甲氧基姜黃素、去二甲氧基姜黃素等成分，現(xiàn)代藥理研究表明其具有抗炎、抗氧化、抗腫瘤、降血脂、抗血管粥樣硬化等藥理作用［9-11］；桑寄生源于《神農(nóng)本草經(jīng)》，味苦、甘，性平，歸肝、腎經(jīng)，能祛風(fēng)濕、補(bǔ)肝腎、強(qiáng)筋骨、安胎等，現(xiàn)代藥理研究表明，桑寄生有降壓、抗病毒等作用，對(duì)中樞神經(jīng)系統(tǒng)有一定鎮(zhèn)靜作用，其主要成分槲皮素具有免疫增強(qiáng)、鎮(zhèn)痛、抗菌、抗氧化、抗病毒、抗腫瘤等藥理作用［12-14］。以上提示：落新婦苷、薯蕷皂苷元、姜黃素、槲皮素等可能是本方的主要有效成分，因此選擇此4種成分作為本復(fù)方質(zhì)控的主要成分。

快速液相色譜法（RPLC）是近年來發(fā)展起來的一種全新的液相色譜方法，與傳統(tǒng)的高效液相色譜法相比具有分離時(shí)間短，分離效率、靈敏度以及分辨率高，試劑消耗量少等特點(diǎn)［15］。因此，本研究采用RPLC測(cè)定祛濁通痹復(fù)方中落新婦苷、薯蕷皂苷元、姜黃素、槲皮素等的含量。

1 儀器與試劑

Agilent Technologies 1290 infinity快速液相色譜儀，Sartorius電子分析天平，SK5210LHC超聲清洗儀。落新婦苷標(biāo)準(zhǔn)品（A0102）由上海寶曼生物科技有限公司提供，薯蕷皂苷元標(biāo)準(zhǔn)品（110773-200911）、槲皮素標(biāo)準(zhǔn)品（110731-201011）、姜黃素標(biāo)準(zhǔn)品（110728-200941）均由中國(guó)藥品生物制品檢定所提供。祛濁通痹復(fù)方（批號(hào)：101128，101130，101201）及陰性復(fù)方均由浙江中醫(yī)藥大學(xué)飲片廠提供。甲醇、乙腈為色譜純，水為去離子雙蒸水，其他試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件 1）落新婦苷。液相色譜柱為Eclipse Plus C18，流動(dòng)相為甲醇∶水∶冰醋酸＝30∶70∶0.2，進(jìn)樣量1 μL，流速 0.2 mL/min，柱溫 25 ℃，DAD 檢測(cè)器：檢測(cè)波長(zhǎng)290 nm。2）薯蕷皂苷元。液相色譜柱為Eclipse Plus C18 柱，流動(dòng)相為乙腈-水（90∶10），流速 0.2 mL/min，柱溫35℃，DAD檢測(cè)器：檢測(cè)波長(zhǎng)210 nm。3）姜黃素。液相色譜柱為Eclipse Plus C18，流動(dòng)相為乙腈-4%冰醋酸溶液（48∶52），流速 0.2 mL/min，柱溫 25 ℃，DAD檢測(cè)器：檢測(cè)波長(zhǎng)430 nm。4）槲皮素。液相色譜柱為Eclipse Plus C18，以甲醇-0.4%磷酸（50∶50）為流動(dòng)相；流速0.2 mL/min，柱溫25℃，DAD檢測(cè)器：檢測(cè)波長(zhǎng)為360 nm。

2.2 供試品溶液的制備 1）落新婦苷和姜黃素供試品溶液的制備。取祛濁通痹復(fù)方粉末約2 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，加甲醇25 mL，稱定質(zhì)量。超聲提取30 min，放冷，再稱定質(zhì)量，用甲醇補(bǔ)足丟失的質(zhì)量，搖勻，經(jīng)0.22 μm濾膜過濾，濾液即為供試液。2）薯蕷皂苷元供試品溶液的制備。取祛濁通痹復(fù)方粉末約2 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，加甲醇25 mL，稱定質(zhì)量。超聲提取30 min，放冷，再稱定質(zhì)量，用甲醇補(bǔ)足丟失的質(zhì)量，過濾。濾液中加入2 mol/L的鹽酸25 mL，加熱回流1 h，放冷后，用石油醚（60～90℃）30 mL萃取 3次，合并石油醚層，揮干石油醚后，殘?jiān)?5 mL乙腈溶解即得。3）槲皮素供試品溶液的制備。取祛濁通痹復(fù)方粉末約2 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，加甲醇25 mL，稱定質(zhì)量。超聲提取30 min，放冷，再稱定質(zhì)量，用甲醇補(bǔ)足丟失的質(zhì)量，過濾。濾液中加入2 mol/L的鹽酸25 mL，加熱回流1 h，放冷后，用乙酸乙酯30 mL萃取2次，合并乙酸乙酯層，揮干乙酸乙酯后，殘?jiān)?5 mL甲醇溶解即得。

2.3 對(duì)照品溶液的制備 精密稱取經(jīng)五氧化二磷干燥過夜的落新婦苷、槲皮素、姜黃素的對(duì)照品適量，用甲醇溶解，分別配成質(zhì)量濃度為0.105、0.0625、0.021 mg/mL的對(duì)照品溶液；精密稱取經(jīng)五氧化二磷干燥過夜的薯蕷皂苷元對(duì)照品適量，用乙腈溶解，配成質(zhì)量濃度為0.0637 mg/mL的對(duì)照品溶液。

2.4 陰性對(duì)照品溶液的制備 制備方法均參照“2.2”項(xiàng)。1）落新婦苷陰性對(duì)照品溶液的制備。取不含土茯苓的“復(fù)方”粉末2 g。2）姜黃素陰性對(duì)照品溶液的制備。取不含姜黃的“復(fù)方”粉末2 g。3）槲皮素陰性對(duì)照液的制備。取不含桑寄生的“復(fù)方”粉末2 g。因復(fù)方中的姜黃也含有薯蕷皂苷元，因此萆薢的陰性復(fù)方按“2.2”項(xiàng)下方法制備后，也會(huì)發(fā)生酸水解產(chǎn)生薯蕷皂苷元，故不設(shè)薯蕷皂苷元的陰性實(shí)驗(yàn)。

2.5 落新婦苷專屬性考察 將落新婦苷對(duì)照品溶液、祛濁通痹復(fù)方供試品溶液、土茯苓陰性復(fù)方溶液，放入快速液相色譜儀中，依次進(jìn)樣，進(jìn)樣量為1 μL。供試品溶液圖譜與對(duì)照品溶液圖譜相同保留時(shí)間處有同樣色譜峰，色譜峰分離度良好，基線穩(wěn)定，整個(gè)分析在20 min內(nèi)完成，陰性樣品無干擾。結(jié)果見圖1。

圖1 土茯苓RPLC圖

2.6 薯蕷皂苷元專屬性考察 將薯蕷皂苷元對(duì)照品溶液、祛濁通痹復(fù)方供試品溶液、萆薢陰性復(fù)方溶液，放入快速液相色譜儀中，依次進(jìn)樣，進(jìn)樣量為1 μL。供試品溶液圖譜與對(duì)照品溶液圖譜相同保留時(shí)間處有同樣色譜峰，色譜峰分離度良好，基線穩(wěn)定，整個(gè)分析在10 min內(nèi)完成。見圖2。

圖2 萆薢RPLC圖

2.7 槲皮素專屬性考察 將槲皮素對(duì)照品溶液、祛濁通痹復(fù)方供試品溶液、桑寄生陰性復(fù)方溶液，放入快速液相色譜儀中，依次進(jìn)樣，進(jìn)樣量為1 μL。供試品溶液圖譜與對(duì)照品溶液圖譜相同保留時(shí)間處有同樣色譜峰，色譜峰分離度良好，基線穩(wěn)定，整個(gè)分析在15 min內(nèi)完成，陰性樣品無干擾。見圖3。

圖3 桑寄生RPLC圖

2.8 姜黃素專屬性考察 將姜黃素對(duì)照品溶液、祛濁通痹復(fù)方供試品溶液、姜黃陰性復(fù)方溶液，放入快速液相色譜儀中，依次進(jìn)樣，進(jìn)樣量為1 μL。供試品溶液圖譜與對(duì)照品溶液圖譜相同保留時(shí)間處有同樣色譜峰，色譜峰分離度良好，基線穩(wěn)定，整個(gè)分析在10 min內(nèi)完成，陰性樣品無干擾。見圖4。

圖4 姜黃素RPLC圖

2.9 線性關(guān)系考察 取“2.3”中配置好的對(duì)照品溶液，依次進(jìn)樣 1、2、3、4、5 μL，記錄峰面積，以峰面積為縱坐標(biāo)，進(jìn)樣量（μg）為橫坐標(biāo)，進(jìn)行線性回歸。得4種成分的回歸方程、相關(guān)系數(shù)和線性范圍，結(jié)果見表1。

表1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的回歸方程

2.10 精密度試驗(yàn) 取“2.2”項(xiàng)中制備好的各供試品溶液，進(jìn)樣1 μL，重復(fù)5次，以峰面積計(jì)算RSD值。結(jié)果落新婦苷、薯蕷皂苷元、姜黃素、槲皮素的RSD分別為1.55%、0.66%、0.33%、1.53%。

2.11 重復(fù)性試驗(yàn) 取同一批號(hào)（101130）的復(fù)方各5份，按照“2.2”項(xiàng)下制備各供試品溶液，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果落新婦苷、薯蕷皂苷元、姜黃素、槲皮素的RSD分別為1.79%、3.36%、1.67%、2.24%。

2.12 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取“2.2”中制備好的各供試品溶液，在 0、2、4、8、10、12、14、16 h 分別進(jìn)樣 1 μL，結(jié)果落新婦苷在16 h內(nèi)穩(wěn)定，薯蕷皂苷元和姜黃素在12 h內(nèi)穩(wěn)定，槲皮素在8 h內(nèi)穩(wěn)定，落新婦苷、薯蕷皂苷元、姜黃素和槲皮素的RSD分別為1.47%、2.91%、2.87%、2.41%。

2.13 加樣回收試驗(yàn) 取批號(hào)為101130的復(fù)方各5份，分別加入落新婦苷0.105 mg、薯蕷皂苷元0.255 mg、姜黃素0.21mg、槲皮素0.19 mg，按“2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，重復(fù)5次，結(jié)果落新婦苷、薯蕷皂苷元、姜黃素、槲皮素的平均加樣回收率分別為101.29%、97.35%、101.97%、99.18%，RSD分別為2.76%、2.41%、2.78%、2.71%。

2.14 含量測(cè)定 取批號(hào)分別為 101128、101130、101201的3批復(fù)方，按“2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，進(jìn)行含量測(cè)定，結(jié)果見表2。

表2 祛濁通痹復(fù)方中落新婦苷、薯蕷皂苷元、姜黃素、槲皮素的測(cè)定

3 討 論

3.1 色譜條件的選擇 1）落新婦苷。流動(dòng)相的選擇曾使用過甲醇-水-冰醋酸溶液、乙腈-0.05%磷酸水溶液等進(jìn)行等度及梯度洗脫，由于干擾峰因素，以及保留時(shí)間、峰型、拖尾等因素的影響，最后根據(jù)分離情況，采取了甲醇∶水∶冰醋酸=30∶70∶0.2 作為流動(dòng)相進(jìn)行等度洗脫，在此條件下，落新婦苷的峰型及分離度均較好，能為復(fù)方中落新婦苷的定性、定量分析提供較好的RPLC條件。2）薯蕷皂苷元。色譜條件曾采用過甲醇-水，室溫下進(jìn)行、乙腈-水不同比例，室溫或者35℃等多種條件進(jìn)行等度及梯度洗脫，由于干擾峰因素，以及保留時(shí)間、峰型、拖尾等因素的影響，最后根據(jù)分離情況，采取了乙腈-水=90∶10，35℃進(jìn)行梯度洗脫。在此條件下，薯蕷皂苷元能得到很好的分離。3）姜黃素。檢測(cè)姜黃素時(shí)，色譜條件按《中國(guó)藥典》05版中規(guī)定的方法進(jìn)行，峰型和分離度都比較好，理論塔板數(shù)≥4000。4）槲皮素。單味桑寄生藥材中，槲皮素在流動(dòng)相為甲醇-0.4%磷酸=35∶65時(shí)，可以得到較好的分離，而在復(fù)方中，在上述條件下，槲皮素的峰型、分離度不是很好。多次改變流動(dòng)相比例后發(fā)現(xiàn)，甲醇-0.4%磷酸=50∶50時(shí)，槲皮素可以得到較好的分離。

3.2 復(fù)方中有效成分的選擇 由于復(fù)方所含成分太多，且復(fù)方是各單味藥共同起作用，與單味藥的作用機(jī)理有些不同，因此復(fù)方的有效成分很難確定。祛濁通痹復(fù)方主要用于治療間歇期痛風(fēng)，而間歇期痛風(fēng)常見肝郁脾虛、濁瘀內(nèi)阻之證。治宜疏肝運(yùn)脾、泄?jié)犰铕鰹橹鳌＝Y(jié)合祛濁通痹復(fù)方的臨床應(yīng)用目的以及間歇期痛風(fēng)的病因、病機(jī)特點(diǎn)，因此選擇了落新婦苷、薯蕷皂苷元、姜黃素、槲皮素4種成分作為復(fù)方的主要有效成分測(cè)定。RPLC法測(cè)定祛濁通痹復(fù)方中落新婦苷、薯蕷皂苷元、姜黃素、槲皮素的含量，可以更好的排除復(fù)方中其他成分的干擾，各成分峰能得到較好的分離，直接采用峰面積定量，方法簡(jiǎn)單，重現(xiàn)性好。因此，本方法可用于祛濁通痹復(fù)方中落新婦苷、薯蕷皂苷元、姜黃素和槲皮素含量的測(cè)定，為其質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提供依據(jù)。

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