岳錦萍， 高 寒， 王丹丹， 李 強(qiáng)， 任 虹，*

(1.北京工商大學(xué) 食品學(xué)院/北京市食品風(fēng)味化學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/食品添加劑與配料北京市高等學(xué)校工程中心/食品質(zhì)量與安全北京實(shí)驗(yàn)室， 北京 100048； 2.陸軍勤務(wù)學(xué)院訓(xùn)練基地， 湖北 襄陽(yáng) 441000)

蜂蜜作為一種營(yíng)養(yǎng)價(jià)值高的天然甜味物質(zhì)，近年來(lái)國(guó)內(nèi)外市場(chǎng)需求量大增，蜂蜜供不應(yīng)求，價(jià)格大幅上漲，一些不法分子開(kāi)始制造、兜售假蜂蜜[1-3]。目前市場(chǎng)上主要的摻假方式是向蜂蜜中添加糖漿如高果糖漿、大米糖漿等[3]。蜂蜜摻假現(xiàn)象嚴(yán)重，已成為社會(huì)關(guān)注的焦點(diǎn)[4-5]。

目前，國(guó)內(nèi)外真假蜂蜜檢測(cè)技術(shù)有差示掃描量熱(DSC)法、核磁共振(NMR)法、色譜光譜法等[6-8]。陳梅蘭等[9]利用官能團(tuán)保留指數(shù)法鑒別摻淀粉糖漿的假蜂蜜，結(jié)果顯示，摻假蜂蜜及部分市售蜂蜜樣品均出現(xiàn)相同的官能團(tuán)保留指數(shù)值，而純蜂蜜樣品不存在此現(xiàn)象。趙杰文等[10]利用熒光光譜法對(duì)摻大米糖漿的蜂蜜進(jìn)行鑒別，利用PCA進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，從而實(shí)現(xiàn)蜂蜜的鑒別。Megherbi等[11]采用高效離子交換色譜- 脈沖安培檢測(cè)器檢測(cè)摻假蜂蜜，對(duì)玉米糖漿的最低檢出限為1%。但是，這些方法大多利用單一指標(biāo)進(jìn)行檢測(cè)，耗時(shí)多、設(shè)備貴。如何簡(jiǎn)單、快速地綜合區(qū)分蜂蜜與糖漿是目前蜂蜜真?zhèn)舞b別的主要任務(wù)。

文章檢測(cè)了我國(guó)北方地區(qū)常見(jiàn)的17種蜂蜜和10種糖漿的理化參數(shù)，使用主成分分析法對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理，建立了簡(jiǎn)單、快速、準(zhǔn)確、綜合的蜂蜜摻假鑒別方法。

1 材料與儀器

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

17種蜂蜜和10種糖漿由同仁堂蜂業(yè)有限公司提供，見(jiàn)表1。

表1 蜂蜜和糖漿樣品Tab.1 Varieties of honey and syrup

1.2 實(shí)驗(yàn)試劑

無(wú)水乙醇、乙腈、蘆丁、鹽酸、乙酸、葡萄糖、果糖、蔗糖、牛血清蛋白、考馬斯亮藍(lán)、沒(méi)食子酸，均為分析純。

1.3 實(shí)驗(yàn)儀器

RE- 5205型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器，上海亞榮生化儀器廠；Agilent 1260型高效液相色譜儀，安捷倫科技有限公司； BIO- RAD型蛋白質(zhì)電泳儀，北京君意東方電泳設(shè)備有限公司；TD5A型離心機(jī)，湖南赫西儀器裝備有限公司；754PC型紫外分光光度計(jì)，上海菁華科技儀器公司。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 葡萄糖、果糖和蔗糖含量測(cè)定

2.1.1色譜條件

Waters NH2氨基色譜柱：4.6 mm×250 mm,5.0 μm。流動(dòng)相:A為乙腈(體積分?jǐn)?shù)0.4%乙酸),B為超純水(體積分?jǐn)?shù)0.4%乙酸)。流速0.5 mL/min，柱溫45 ℃，檢測(cè)溫度35 ℃，進(jìn)樣量5 μL。

2.1.2標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

配制17 mg/mL的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液，20 mg/mL的果糖和蔗糖標(biāo)準(zhǔn)溶液。分別從3種標(biāo)準(zhǔn)溶液中吸取200 μL，配置成混合標(biāo)準(zhǔn)液。

2.2 蛋白質(zhì)含量及分子質(zhì)量的測(cè)定

標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制[12]：分別吸取1 mg/mL牛血清蛋白溶液0、0.02、0.04、0.06、0.08 mL和0.10 mL于6支試管中，各加水至0.10 mL，再加入5 mL考馬斯亮藍(lán)G- 250溶液，室溫放置2 min，在595 nm波長(zhǎng)下測(cè)定吸光度，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

樣品蛋白質(zhì)含量測(cè)定：樣品1.0 g溶于2.0 mL蒸餾水，準(zhǔn)確吸取樣品溶液0.1 mL，按上述步驟測(cè)定。

樣品蛋白質(zhì)分子質(zhì)量測(cè)定：參照張龍翔等[13]的方法,將樣品與0.1 mol/L pH值8.0的Tris-HCl緩沖液按1∶4比例混合均勻，加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)85%的硫酸銨，在冰箱保鮮室中放置8 h左右，離心(18 000r/min，10 min)，棄上清液，再用0.1 mol/L pH值8.0的Tris緩沖液溶解沉淀，置于4 ℃?zhèn)溆谩?/p>

2.3 多酚含量的測(cè)定

標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制[14]：吸取100 μg/mL沒(méi)食子酸標(biāo)準(zhǔn)溶液0、100、200、300、400、500、600、700、800 μL后，分別加入150 μL稀釋10倍的福林酚試劑，震蕩均勻后再加入2.2 mL 0.02 g/mL Na2CO3溶液，最后定容至2.5 mL。置于暗室30 min后在720 nm波長(zhǎng)下測(cè)量吸光度。重復(fù)測(cè)定3次，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

樣品多酚含量測(cè)定：配置質(zhì)量濃度為0.1 g/mL的樣品溶液，按上述步驟測(cè)定。

2.4 黃酮含量的測(cè)定

標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制[15]：配置質(zhì)量濃度為0.4 mg/mL蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液，取0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液于6個(gè)玻璃小瓶中。加入0.3 mL 0.05g/mL NaNO2溶液，混勻靜置5 min后加入0.3 mL 0.1 g/mL AlCl3溶液，靜置6 min，加入2 mL 1 mol/L NaOH溶液，定容至4.0 mL。在510 nm波長(zhǎng)下測(cè)定其吸光度。重復(fù)測(cè)定3次，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

樣品黃酮含量測(cè)定：配置質(zhì)量濃度為0.5 g/mL的樣品溶液，按上述步驟測(cè)定。

2.5 水分含量的測(cè)定

采用真空干燥法[16]測(cè)定水分含量。

2.6 pH值的測(cè)定

稱取10 g樣品于潔凈的玻璃燒杯中，用75 mL蒸餾水溶解樣品，待儀器讀數(shù)穩(wěn)定后記錄讀數(shù)。重復(fù)測(cè)定3次。

2.7 主成分分析

使用SPSS statistics 19進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

3 結(jié)果與分析

3.1 葡萄糖、果糖和蔗糖含量分析

圖1 標(biāo)準(zhǔn)品和樣品液相色譜圖Fig.1 HPLC spectra of standard product, chestnut honey and syrups S131017-1

葡萄糖、果糖和蔗糖是蜂蜜中的主要物質(zhì)，三者的含量是蜂蜜品質(zhì)的重要指標(biāo)[17]。但由于葡萄糖、果糖是同分異構(gòu)體，二者的分辨率低，優(yōu)化色譜條件后，分離度得到提高。果糖標(biāo)準(zhǔn)品的保留時(shí)間為11.711 min，葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品的保留時(shí)間為12.769 min，蔗糖標(biāo)準(zhǔn)品的保留時(shí)間為18.218 min(見(jiàn)圖1a)。由于樣品數(shù)量較多，選取同仁堂荊條蜂蜜和糖漿S131017-1的HPLC圖譜為蜂蜜和糖漿樣品的代表(見(jiàn)圖1b、圖1c)。

蜂蜜樣品中葡萄糖、果糖、蔗糖的質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別在34.0%～51.0%、46.0%～55.0%、 2.6%～5.0%，果糖與葡萄糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)比范圍為0.95～1.50。糖漿樣品中葡萄糖、果糖的質(zhì)量分?jǐn)?shù)范圍分別為9.0%～49.0%、 0～73.0%，不含蔗糖；果糖與葡萄糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)比范圍為0.13～2.80。與文獻(xiàn)[18]相比，大大提高了果糖和葡萄糖的分離度。因此，可以將葡萄糖、果糖和蔗糖的含量及相對(duì)含量作為區(qū)分蜂蜜和糖漿的指標(biāo)。

3.2 蛋白質(zhì)含量及分子質(zhì)量分析

蜂蜜中的蛋白質(zhì)主要來(lái)源于蜜蜂分泌產(chǎn)生的各種消化酶、代謝酶，小部分來(lái)自花蜜或花粉，蜂蜜中的蛋白質(zhì)受蜜蜂種類、蜜源植物、地理環(huán)境等因素的影響[19-21]。實(shí)驗(yàn)中，蛋白質(zhì)含量標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為y=6.128 6x+0.008 6，R2=0.996 8。蜂蜜樣品中蛋白質(zhì)質(zhì)量比范圍為1.12～5.09 μg/g，如圖2(樣品編號(hào)順序見(jiàn)表1)，糖漿樣品中不含蛋白質(zhì)。

圖2 蜂蜜樣品中的蛋白質(zhì)含量Fig.2 Protein content of honey samples

蜂蜜樣品電泳后出現(xiàn)了1～4條帶，蛋白質(zhì)分子質(zhì)量范圍在45.0～116.0 kDa；糖漿樣品電泳后沒(méi)有出現(xiàn)條帶(見(jiàn)圖3)。蜂蜜的蛋白質(zhì)分子質(zhì)量主要集中在50 kDa附近。不同蜂蜜的蛋白質(zhì)種類及組成存在較大的差異：棗花蜂蜜的蛋白質(zhì)種類最多，主要由4條蛋白質(zhì)譜帶構(gòu)成；枇杷蜂蜜蛋白質(zhì)種類最少，只有1條蛋白條帶。由于蜂蜜中蛋白質(zhì)的含量及類型取決于蜂蜜源產(chǎn)地和花的種類，因此，蛋白質(zhì)電泳實(shí)驗(yàn)所得到的蛋白質(zhì)分子質(zhì)量范圍及蛋白質(zhì)種類可以作為區(qū)分蜂蜜和糖漿的指標(biāo)之一。

3.3 多酚含量分析

多酚類物質(zhì)具有抗氧化活性，是蜂蜜中的主要功效成分。標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為y=0.130 1x+0.011 8，R2=0.998 8。蜂蜜樣品中多酚質(zhì)量比范圍為16.14～32.47 μg/g，糖漿A2015196、糖漿A2015197、糖漿A2015198、糖漿A2015199、江西南昌糖漿中不含多酚類物質(zhì)，其余糖漿樣品中多酚質(zhì)量比在5.03～15.11 μg/g (見(jiàn)圖4)。蜂蜜樣品中多酚含量高于糖漿的多酚含量，因此根據(jù)多酚含量可區(qū)分出大多數(shù)蜂蜜和糖漿。

圖3 樣品電泳圖Fig.3 Sample electrophoresis chart

3.4 黃酮含量分析

蜂蜜中的黃酮類物質(zhì)主要來(lái)自蜜源植物的花蜜、花粉或蜂膠。不同種類蜂蜜中的黃酮類化合物種類和含量差別很大，黃酮類物質(zhì)具有極好的抗氧化、抗菌等功效[22]。標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為y=0.007 7x+0.007 3，R2=0.999。蜂蜜樣品中黃酮質(zhì)量比范圍在32.4～174.4 μg/g，糖漿樣品中黃酮質(zhì)量比范圍在15.2～89.3 μg/g(見(jiàn)圖5)。蜂蜜樣品中黃酮含量高于糖漿的黃酮含量，依據(jù)黃酮含量可區(qū)分出大部分蜂蜜和糖漿。

圖4 蜂蜜和糖漿樣品的多酚含量Fig.4 Phenol content of honey and syrup

圖5 蜂蜜和糖漿樣品中的黃酮含量 Fig.5 Flavonoid content of honey and syrup

3.5 水分含量分析

蜂蜜中的含水量對(duì)于蜂蜜的品質(zhì)、物理特性有重要作用。蜂蜜樣品的ω(水)范圍在15.13%～19.88%，糖漿樣品的ω(水)范圍在22.13%～28.50%(見(jiàn)圖6)，糖漿含水量均高于蜂蜜含水量。這與文獻(xiàn)報(bào)道一致[23]，在蜂蜜的后熟階段，蜂蜜中的含水量會(huì)降低，純蜂蜜的ω(水)不應(yīng)超過(guò)25%，否則會(huì)導(dǎo)致微生物的生長(zhǎng)，但也不應(yīng)低于14%。

圖6 蜂蜜和糖漿樣品的水分含量Fig.6 Water contents of honey and syrup

3.6 pH值分析

蜂蜜的酸性與其所含的礦物元素和酸性物質(zhì)有關(guān)[24-25]。實(shí)驗(yàn)中，所有檢測(cè)樣品都呈酸性，范圍在3.77～5.65，如圖7。蜂蜜樣品的pH值范圍在3.78～5.50，大多數(shù)蜂蜜樣品的pH值在3.78～4.12，只有椴樹(shù)蜂蜜(pH值4.50)、益母草蜂蜜(pH值4.63)、棗花蜂蜜(pH值4.74)高于4.50。糖漿的pH值范圍在3.77～5.65，大多數(shù)糖漿的pH值在4.30～5.65，只有糖漿S131017-5(pH值3.77)、糖漿A2015195(pH值3.90)的pH值低于4.00。

圖7 蜂蜜和糖漿樣品pH值Fig.7 pH value of honey and syrup

3.7 主成分分析結(jié)果

對(duì)27個(gè)樣品(17個(gè)蜂蜜、10個(gè)糖漿)的理化指標(biāo)進(jìn)行主成分分析，結(jié)果如圖8。前2個(gè)主成分蛋白質(zhì)含量(PC1)、果糖相對(duì)含量(PC2)的累積貢獻(xiàn)率占89.543%，其中PC1、PC2的方差貢獻(xiàn)率分別為70.839%、18.704%。由主成分得分圖，可以看出蜂蜜和糖漿樣品已完全區(qū)分開(kāi)。通過(guò)理化指標(biāo)鑒別法可以區(qū)分出大多數(shù)蜂蜜和糖漿，此方法為真假蜂蜜的鑒別提供了理論依據(jù)。

圖8 主成分分析Fig.8 Principle component analysis

4 結(jié) 論

實(shí)驗(yàn)對(duì)蜂蜜和糖漿的理化指標(biāo)進(jìn)行了測(cè)定，包括水分、酚類、糖、蛋白質(zhì)等，并結(jié)合化學(xué)計(jì)量學(xué)分析對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理。主成分綜合得分顯示,蛋白質(zhì)含量、果糖相對(duì)含量對(duì)蜂蜜真假鑒別的影響最大。文章采用HPLC方法分析蜂蜜中單糖組成及含量，在色譜柱、流動(dòng)相的選擇上進(jìn)行優(yōu)化，提高了果糖和葡萄糖的分離度。同時(shí)，采用比色法測(cè)定蜂蜜中的抗氧化活性物質(zhì)——多酚類和黃酮類，并將蛋白質(zhì)含量與蛋白質(zhì)分子質(zhì)量分析相結(jié)合，使分析蛋白質(zhì)鑒別真假蜂蜜的方法更完善。多種理化指標(biāo)綜合分析是鑒別真假蜂蜜的主要方法，為進(jìn)一步驗(yàn)證蜂蜜真?zhèn)翁峁┝丝茖W(xué)依據(jù)，在蜂蜜質(zhì)量監(jiān)督、產(chǎn)品檢驗(yàn)方面有廣闊的應(yīng)用前景。

參考文獻(xiàn)：

[1] 杜宗緒.蜂蜜摻假鑒別檢測(cè)方法研究進(jìn)展[J]. 保鮮與加工, 2015,15(5):67-71.

DU Z X. Honey adulteration detection method research [J]. Storage and Process, 2015, 15(5) : 67-71.

[2] 雷鳴, 何晉浙, 孫培龍.摻假蜂蜜檢測(cè)技術(shù)的研究綜述[J]. 食品科技, 2012,30(7):283-287.

LEI M, HE J Z, SUN P L.A review of researches on detection technology of adulterated honey[J].Food Technology,2012,30(7):283-287.

[3] 裴高璞, 史波林, 趙鐳,等.蜂蜜質(zhì)量市場(chǎng)動(dòng)態(tài)及摻假檢測(cè)方法現(xiàn)狀分析[J]. 食品科學(xué),2013, 34(15): 329-336.

PEI G P, SHI P L, ZHAO L,et al. Current situation analysis of quality market dynamics and detection methods for honey adulteration[J]. Food Science,2013, 34(15): 329-336.

[4] 林慧, 馮云, 顏春榮,等.糖類化合物的分析方法研究進(jìn)展[J]. 食品與藥品,2014,16(6): 448-452.

LIN H, FENG Y, YAN C R, et al. Progress on analysis methods for carbohydrates[J].Food and Drug,2014,16(6)：448-452.

[5] 葉夢(mèng)迪, 顧振宇,林陳芳.油菜蜂蜜中蛋白質(zhì)及酶的研究[J]. 中國(guó)食品學(xué)報(bào)，2017,17(1)：246-252.

YE M D, GU Z Y, LIN C F. Studies on proteins and enzymes in rape honey [J]. Journal of Chinese Institute of Food Science and Technology, 2017,17(1): 246-252.

[7] BENTABOL M A, GARCA Z H, GALDN B R, et al. Differentiation of blossom and honeydew honeys using multivariate analysis on the physicochemical parameters and sugar composition[J]. Food Chemistry, 2011, 126(2):664-672.

[8] KERKVLIET J D, MEIJER H A J. Adulteration of honey: relation between microscopic analysis and δ13C measurements[J]. Apidologie, 2000, 31(6):717-726.

[9] 陳梅蘭,梁世君,雷鳴,等.官能團(tuán)保留指數(shù)鑒別摻淀粉糖漿蜂蜜的研究[J].現(xiàn)代食品科技,2015,31(5):272-277.

CHEN M L,LIANG S J,LEI M, et al.Detecting starch syrup in adulterated honey via retention index[J]. Modern Food Science and Technology, 2015,31(5):272-277.

[10] 趙杰文,韓小燕,陳全勝,等.基于三維熒光光譜技術(shù)對(duì)摻假蜂蜜無(wú)損鑒別研究[J].光譜學(xué)與光譜分析,2013,33(6):1626-1630.

ZHAO J W, HAN X Y,CHEN Q S, et al.Identification of adulterated honey based on three-dimensional fluorescence spectra technology[J]. Spectroscopy and Spectral Analysis,2013,33(6):1626-1630.

[11] MEGHERBI M,HERBRETEAU B,FAURE R,et al.Polysaccharides as a marker for detection of corn sugar syrup addition in honey[J].Journal of Agricultural & Food Chemistry,2009,57(6):2105-2111.

[12] 宋鳳艷, 周超君. 蜂蜜中蛋白質(zhì)及氨基酸含量的測(cè)定[J].糧食流通技術(shù),2016(20): 108-110.

SONG F Y, ZHOU C J. The determination of protein and amino acids in honey[J].Grain Distribution Technology, 2016(20):108-110.

[13] 張龍翔， 張庭芳， 李令媛. 生化實(shí)驗(yàn)方法和技術(shù)[M]. 北京：高等教育出版社， 1997:92-100.

[14] 王畢妮. 紅棗多酚的種類及抗氧化活性研究[D].西安：西北農(nóng)林科技大學(xué), 2011.

[15] 徐賢. 蜂蜜種類與品質(zhì)的鑒別研究[D].杭州：浙江工商大學(xué), 2014.

[16] 顏偉玉,鄭宇.蜂蜜的理化指標(biāo)測(cè)定[J].養(yǎng)蜂科技,2006,12(3):39-40.

YAN W Y, ZHENG Y. Identify physical indicators of honeybee[J].Apicultural Science and Technology, 2006,12(3):39-40.

[17] 張書(shū)芬,史萍萍,王全林,等.液相色譜示差折光法測(cè)定蜂蜜中的果糖、葡萄糖、蔗糖和麥芽糖[J]. 食品科學(xué),2008, 29(6):280-283.

ZHANG S F,SHI P P, WANG Q L, et al. Determination of fructose, glucose, sucrose and maltose in honey by liquid chromatography refractive index detector[J].Food Science,2008,29(6):280-283.

[18] 盛文勝,江軍山,王訓(xùn)斌,等.不同蜂蜜中果糖、葡萄糖和蔗糖含量的測(cè)定[J]. 安徽農(nóng)業(yè)科學(xué), 2010, 38(30):17182-17183.

SHENG W S, JIANG J S , WANG X B , et al. Determination of fructose, glucose and sucrose content in honey[J] . Anhui Agricultural Science,2010,38(30):17182-17183.

[19] 周厚報(bào), 鄧建軍,胡苗苗,等. 基于蛋白質(zhì)差異鑒別蜂蜜真?zhèn)蔚难芯窟M(jìn)展[J]. 食品與發(fā)酵工業(yè), 2013, 39(6): 116-119.

ZHOU H B, DENG J J, HU M M, et al. Development of authenticity identification of honey based on protein differences[J].Food and Fermentation Industry, 2013, 39(6): 116-119.

[20] 鮑會(huì)梅. 真假蜂蜜理化指標(biāo)的分析[J]. 食品科技，2010(4): 284-288.

BAO H M. Analysis on physical and chemical indicators of genuine honey and artifical honey[J]. Food Science and Technology, 2010(4): 284-288.

[21] 權(quán)英， 戴夏羚， 丁建英， 等. 蜂蜜種類與其理化參數(shù)的關(guān)系[J]. 食品與發(fā)酵工業(yè)， 2015, 41(11): 152-156.

QUAN Y, DAI X L, DING J Y, et al. Relationship of honeys species and their physicochemical parameters[J]. Food and Fermentation Industries, 2015, 41(11): 152-156.

[22] 譚洪波. 云南四種蜂蜜中主要成分及其抗氧化性的研究[D].福州：福建農(nóng)林大學(xué), 2016.

[23] 王錦梅. 洋槐蜜、油菜蜜和荊條蜜花源標(biāo)識(shí)物的確定及應(yīng)用[D].西安：西北大學(xué), 2014.

[24] 王文靜. 洋槐蜂蜜HPLC指紋圖譜的研究[D].重慶：西南大學(xué), 2008.

[25] 劉玉峰， 李黎， 李東, 等.高效液相色譜法測(cè)定食品中的單糖、雙糖[J]. 食品科學(xué),2007, 28(3): 293-296.

LIU Y F, LI L, LI D, et al. Determination of mono-saccharide and disaccharide in foods by HPLC method[J].Food science,2007,28(3):293-296.