蘆紅云， 吳天祥,2,*， 湯慶莉， 鐘 敏， 聶文強(qiáng)

(1.貴州大學(xué) 釀酒與食品工程學(xué)院， 貴州 貴陽(yáng) 550025； 2.貴州大學(xué) 明德學(xué)院， 貴州 貴陽(yáng) 550025)

目前，絕大多數(shù)具有多種生物活性的多糖都來(lái)源于真菌，尤其是食用真菌，如香菇、灰樹(shù)花、革蓋菌屬、裂褶菌屬等[1]。韓建濤[2]對(duì)灰樹(shù)花胞外多糖單糖組成進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)其單糖組分為甘露糖、葡萄糖和木糖，物質(zhì)的量比為16.87∶1∶2.99。體內(nèi)實(shí)驗(yàn)研究表明，灰樹(shù)花多糖對(duì)提高免疫力和抑瘤效果顯著[3]。Konno[4]利用灰樹(shù)花胞外多糖與維生素C聯(lián)用，發(fā)現(xiàn)灰樹(shù)花D-組分對(duì)癌細(xì)胞表現(xiàn)出生長(zhǎng)抑制。

研究表明，藥用真菌在發(fā)酵轉(zhuǎn)化中藥時(shí)，中藥成分不僅能刺激微生物生長(zhǎng)，同時(shí)能參與到微生物的代謝之中，增加其次級(jí)代謝產(chǎn)物的生物活性[5-6]。本課題組前期研究結(jié)果表明，在灰樹(shù)花液體發(fā)酵體系中添加天麻醇提物及其主要成分天麻素、對(duì)羥基苯甲醛、對(duì)羥基苯甲醇可顯著促進(jìn)灰樹(shù)花產(chǎn)胞外多糖和菌絲體生長(zhǎng)[7-10]，其促胞外多糖增產(chǎn)的機(jī)理與有效提高灰樹(shù)花胞外多糖合成酶酶活有關(guān)。本文希望通過(guò)研究加入了天麻醇提物的灰樹(shù)花發(fā)酵的變化，進(jìn)一步探明灰樹(shù)花合成代謝產(chǎn)物胞外多糖變化機(jī)理、抑瘤活性、天麻醇提物對(duì)灰樹(shù)花代謝增效等的影響。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑及培養(yǎng)基

灰樹(shù)花菌株(Grifolafrondosa，菌種編號(hào)：5.404)，中國(guó)普通微生物菌種保藏管理中心；天麻(Rhizomagastrodiae)，貴州省德江縣天麻種植基地。

透析袋，Solarbio公司；甘露糖、鼠李糖、葡萄糖、半乳糖、阿拉伯糖、巖藻糖單糖標(biāo)準(zhǔn)品，上海源葉生物科技有限公司；其余試劑均為市售分析純。

斜面培養(yǎng)基：馬鈴薯葡萄糖瓊脂(PDA)培養(yǎng)基。液體種子培養(yǎng)基(g/L)：葡萄糖30，蛋白胨2，酵母膏6，KH2PO40.5，MgSO4·7H2O 0.5。發(fā)酵培養(yǎng)基(g/L)：葡萄糖50，蛋白胨5，酵母膏10，KH2PO42，MgSO4·7H2O 2。

1.2 儀器與設(shè)備

BXM-30R型立式滅菌鍋，上海博訊實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠；RE-2000A型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器，上海亞榮生化儀器廠；SW-CJ-1D型凈化工作臺(tái)，蘇州凈化設(shè)備有限公司；TGL-20M型臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)，長(zhǎng)沙邁佳森儀器設(shè)備有限公司；ZWY-C2112B型雙層旋轉(zhuǎn)式可編程恒溫恒濕搖床，上海智誠(chéng)分析儀器制造有限公司；Nicolet is50型原位漫反射傅里葉交換紅外光譜儀，美國(guó)賽默飛世爾科技有限公司；CTFD-12S型真空冷凍干燥機(jī)，青島永合創(chuàng)信電子科技有限公司；Agilent 1100型高效液相色譜儀及檢測(cè)器、Agilent 5TC-C18型色譜柱，美國(guó)Agilent公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1灰樹(shù)花培養(yǎng)方法

1)灰樹(shù)花菌株斜面培養(yǎng)。從母種試管中挑取黃豆粒大小菌絲塊接種于PDA斜面中部，25 ℃恒溫培養(yǎng)，至菌絲長(zhǎng)滿整個(gè)斜面，轉(zhuǎn)置4 ℃保存。

2)灰樹(shù)花液體種子培養(yǎng)。用接種勺在斜面菌種管中取1勺細(xì)小菌絲體，接種于液體種子培養(yǎng)基中，500 mL三角瓶裝液量為200 mL，加入少許細(xì)小玻璃珠，于25 ℃、150 r/min搖床中培養(yǎng)6 d。

3)灰樹(shù)花發(fā)酵培養(yǎng)。無(wú)菌條件下，按10%的接種量，用移液槍取10 mL種子液接于發(fā)酵培養(yǎng)基中，250 mL三角錐形瓶裝液量為100 mL，150 r/min搖床25 ℃培養(yǎng)。

1.3.2天麻醇提物制備與添加

天麻洗凈，55 ℃烘干，粉碎后過(guò)80目備用。準(zhǔn)確稱取上述10 g的天麻粉末，加入100 mL體積分?jǐn)?shù)為75%的乙醇。25 ℃浸提48 h后過(guò)濾，60 ℃減壓除去乙醇。加25 mL蒸餾水重溶后過(guò)濾，即得到2.5 mL/g的天麻醇提物(RG)。向灰樹(shù)花發(fā)酵培養(yǎng)基中添加7 g/L的天麻醇提物，經(jīng)高壓高溫滅菌冷卻后，接入種子液，發(fā)酵培養(yǎng)12 d。

1.3.3灰樹(shù)花胞外粗多糖制備

取2 mL的去菌絲體發(fā)酵液，加入4倍體積95%無(wú)水乙醇，于4 ℃冰箱中醇析24 h，取出后4 000 r/min離心15 min，取沉淀物加體積分?jǐn)?shù)95%乙醇沉淀3次后，于60 ℃數(shù)顯鼓風(fēng)干燥箱中烘干即為粗多糖(CEPS)。

1.3.4灰樹(shù)花胞外粗多糖純化處理

上述醇析出的粗多糖用體積分?jǐn)?shù)3%三氯乙酸脫蛋白，大孔吸附樹(shù)脂D303脫色，經(jīng)流水透析2 d，再經(jīng)蒸餾水透析1 d后，于真空冷凍干燥機(jī)中干燥，得到純化后的灰樹(shù)花胞外多糖樣品(PEPS)。

1.3.5灰樹(shù)花胞外多糖樣品中多糖及蛋白質(zhì)含量測(cè)定

取10 mg多糖樣品，用蒸餾水定容至50 mL，利用硫酸苯酚法[9]、考馬斯亮比色法[11]分別對(duì)樣品中多糖及蛋白質(zhì)含量進(jìn)行分析。葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線線性回歸方程為：y=0.554 2x-0.003 5，R2=0.998 7。蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線為y=8.740 5x+0.009 3，R2=0.999 2。

1.3.6灰樹(shù)花多糖單糖組成測(cè)定

1)多糖樣品酸水解。分別稱取30 mg多糖樣品，用蒸餾水準(zhǔn)確配成30 mg/mL的溶液，加入4 mol/L的三氯乙酸1 mL，充氮?dú)夂竺芊?，?10 ℃下水解2 h，冷卻后，加入甲醇2 mL，混勻后于50 ℃旋轉(zhuǎn)蒸干，重復(fù)3次，蒸干后加1 mL去離子水做衍生化反應(yīng)。

2)多糖樣品及單糖標(biāo)準(zhǔn)品1-苯基-3-甲基-5-吡啶碄酮(PMP)衍生化。參照文獻(xiàn)[12]，稱取甘露糖、鼠李糖、葡萄糖、半乳糖、阿拉伯糖、巖藻糖標(biāo)準(zhǔn)品各2 mg，加入去離子水于5 mL容量瓶中定容，取等體積單糖標(biāo)準(zhǔn)液配成濃度為0.4 mg/mL的單糖標(biāo)準(zhǔn)混合液。

取灰樹(shù)花多糖水解液及單糖標(biāo)準(zhǔn)品混合液各1 mL于10 mL離心管，加入1 mL 0.3 mol/L的NaOH，混勻后取上述混合液1 mL，添加1 mL 0.3 mol/L的PMP甲醇溶液，旋渦震勻后在70 ℃下反應(yīng)100 min，冷卻后用0.5 mL 0.3 mol/L HCl中和反應(yīng)液。加2.5 mL氯仿萃取，震搖、靜置，小心吸取水相(上層)，重復(fù)3次除凈PMP(此時(shí)氯仿層為無(wú)色)。0.45 μm濾膜過(guò)濾水相反應(yīng)液后用HPLC檢測(cè)。

3)多糖樣品HPLC檢測(cè)。色譜柱：Agilent 5TC-C18柱。流動(dòng)相：0.1 mol/L磷酸鹽緩沖溶液(pH值6.7)-乙腈，體積比為83∶17；柱溫30 ℃，流速為1 mL/s。進(jìn)樣量20 μL，波長(zhǎng)245 nm。

1.3.7紅外光譜實(shí)驗(yàn)

取1～1.5 mg樣品與200～300 mg KBr(樣品與KBr質(zhì)量比約為1∶200)于瑪瑙研缽中研磨成混合均勻的粉末，用小藥匙轉(zhuǎn)入制片模具中于油壓機(jī)10 t壓力下保持2 min，撤去壓力后取出制成的供試片，目視檢測(cè)，應(yīng)呈透明狀，然后裝入樣品架上待檢。

1.3.8灰樹(shù)花胞外多糖生物活性檢測(cè)

抗腫瘤活性物質(zhì)篩選模型的檢測(cè)方法采用磺酰羅丹蛋白染色法(SRB法)，小鼠脾淋巴細(xì)胞增殖模型的檢測(cè)方法采用四氮唑鹽還原法(MTT法)。灰樹(shù)花胞外多糖生物活性檢測(cè)實(shí)驗(yàn)由貴州省中國(guó)科學(xué)院天然產(chǎn)物化學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室藥理與生物活性研究中心完成。

1.4 統(tǒng)計(jì)方法

采用SPSS 17.0軟件分析實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)顯著性，Origin 7.5軟件作圖。在生物活性檢測(cè)實(shí)驗(yàn)中樣品每個(gè)濃度平行3次，重復(fù)2次，結(jié)果以M±SD表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 多糖樣品中多糖及蛋白質(zhì)含量分析

灰樹(shù)花胞外多糖樣品主要由多糖組成(見(jiàn)表1)。經(jīng)提取純化后，使多糖成分進(jìn)一步純化，其中蛋白質(zhì)成分無(wú)檢出，說(shuō)明純化工序中脫蛋白徹底。

表1 胞外多糖樣品中多糖及蛋白質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)Tab.1 Polysaccharide and protein content of exopolysaccharide samples %

2.2 灰樹(shù)花胞外多糖的結(jié)構(gòu)特征分析

圖1 灰樹(shù)花胞外粗多糖、精多糖紅外光譜Fig.1 IR spectrum of CEPS and PEPS from G. frondosa

圖2 添加天麻的灰樹(shù)花胞外粗多糖、精多糖紅外光譜Fig.2 IR spectrum of CEPS-RG and PEPS-RG from Grifola frondosa

2.3 單糖混合標(biāo)準(zhǔn)品分析

甘露糖、鼠李糖、葡萄糖、半乳糖、阿拉伯糖、巖藻糖標(biāo)準(zhǔn)品的HPLC色譜圖和相應(yīng)的保留時(shí)間分別見(jiàn)圖3和表2。

圖3 單糖標(biāo)準(zhǔn)品色譜Fig.3 HPLC spectrum of mixed monosaccharides standards

2.4 灰樹(shù)花胞外粗多糖、精多糖單糖組成分析

添加天麻醇提物于灰樹(shù)花發(fā)酵體系為實(shí)驗(yàn)組，未添加任何外源物的為對(duì)照組。添加天麻醇提物后灰樹(shù)花胞外粗多糖未產(chǎn)生新的單糖組成，但單糖物質(zhì)的量比改變顯著，見(jiàn)圖4、圖5及表3。樣品CEPS、CEPS-RG單糖組成中，葡萄糖含量最多，其次為甘露糖，同時(shí)檢出含量相對(duì)較少半乳糖，或還含有鼠李糖。這也進(jìn)一步從單糖組成的角度解釋了紅外光譜中胞外粗多糖未檢測(cè)出明顯的α構(gòu)型的原因。

圖4 CEPS樣品色譜Fig.4 HPLC spectrum of CEPS from Grifola frondosa

圖5 CEPS-RG樣品色譜Fig.5 HPLC spectrum of CEPS-RG from Grifola frondosa

通過(guò)對(duì)比胞外多糖純品實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組，發(fā)現(xiàn)檢測(cè)得到的灰樹(shù)花胞外多糖純品主要由甘露糖、鼠李糖、葡萄糖、半乳糖、阿拉伯糖、巖藻糖等單糖組分構(gòu)成(見(jiàn)圖6、圖7)。其中，添加天麻醇提物對(duì)灰樹(shù)花胞外多糖單糖組分產(chǎn)生明顯變化，PEPS樣品中上述6種單糖物質(zhì)的量比依次為13.8∶3.9∶5∶3.7∶1∶1.7，而PEPS-RG樣品單糖組分物質(zhì)的量比12.7∶3.2∶5.6∶3.5∶1∶1.6(見(jiàn)表4)。通過(guò)對(duì)比單糖峰面積可知，天麻醇提物的加入能促進(jìn)灰樹(shù)花分泌鼠李糖、半乳糖、阿拉伯糖、巖藻糖等單糖成分。同時(shí)，由圖7可知，天麻醇提物的加入并未使灰樹(shù)花多糖產(chǎn)生新單糖組分。

表3 灰樹(shù)花胞外粗多糖單糖組成物質(zhì)的量比Tab.3 Monosaccharide mole ratio of crude exopolysaccharide in Grifola frondosa

圖6 PEPS樣品色譜Fig.6 HPLC spectrum of PEPS from Grifola frondosa

2.5 小鼠巨噬細(xì)胞(RAW264.7)活化實(shí)驗(yàn)結(jié)果

篩選方法：酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定法(ELISA法)檢測(cè)巨噬細(xì)胞腫瘤壞死因子(TNF-α)的分泌表達(dá)。

圖7 PEPS-RG樣品色譜Fig.7 HPLC spectrum of PEPS-RG from Grifola frondosa

表4 灰樹(shù)花胞外精多糖單糖組成物質(zhì)的量比Tab.4 Monosaccharide mole ratio of pure exopolysaccharide in Grifola frondosa

模型原理：巨噬細(xì)胞在相關(guān)因素刺激下會(huì)活化，并分泌表達(dá)TNF-α。將樣品或脂多糖(LPS)加入巨噬細(xì)胞中培養(yǎng)一定時(shí)間后，取細(xì)胞上清液測(cè)定TNF-α的含量，判斷樣品對(duì)細(xì)胞的活化作用，計(jì)算公式見(jiàn)式(1)。

活化指數(shù)=ρ樣品(TNF-α)/ρ正常(TNF-α)。

(1)

PEPS-RG對(duì)巨噬細(xì)胞有明顯的活化作用，PEPS、CEPS-RG對(duì)巨噬細(xì)胞有一定的活化作用，CEPS對(duì)巨噬細(xì)胞無(wú)明確的活化作用(見(jiàn)表5)。由結(jié)果可知，添加天麻醇提物能促進(jìn)灰樹(shù)花胞外多糖對(duì)巨噬細(xì)胞的免疫調(diào)節(jié)能力，Kim等[17]研究表明添加人參提取物能提高靈芝多糖對(duì)巨噬細(xì)胞的活化能力。這可能與天麻醇提物改變灰樹(shù)花胞外多糖單糖組成有關(guān)。通過(guò)對(duì)比經(jīng)純化和未經(jīng)純化的胞外多糖對(duì)小鼠巨噬細(xì)胞RAW264.7的作用可知，經(jīng)純化后的灰樹(shù)花胞外多糖對(duì)小鼠巨噬細(xì)胞有更強(qiáng)的活化作用，這可能與多糖經(jīng)純化后，具有生物活性的單糖含量增加有關(guān)。有研究表明多糖的單糖組成也與抗腫瘤活性相關(guān)，通常含有葡萄糖和甘露糖的多糖抗腫瘤活性較好，這主要是因?yàn)樵谌祟?lèi)巨噬細(xì)胞中已發(fā)現(xiàn)有葡萄糖和甘露糖受體，因而此種多糖具有高度特異性[18]。

表5 胞外多糖對(duì)小鼠巨噬細(xì)胞的作用Tab.5 Effect of exopolysaccharide on mouse macrophages cell

LPS為陽(yáng)性對(duì)照。樣品標(biāo)準(zhǔn)稱量，按送樣方要求用生理鹽水溶解。

2.6 灰樹(shù)花胞外多糖抗腫瘤活性篩選實(shí)驗(yàn)結(jié)果

篩選模型：人肝癌細(xì)胞HepG 2。篩選方法：四氮唑鹽還原法(MTT法)。

模型原理：活細(xì)胞的線粒體中存在與NADP相關(guān)的脫氫酶，可將黃色的MTT還原為不溶性的藍(lán)紫色Formanzan；死細(xì)胞此酶消失，MTT不被還原。本模型根據(jù)MTT的還原程度，來(lái)檢測(cè)樣品對(duì)腫瘤細(xì)胞的作用情況，計(jì)算公式見(jiàn)式(2)。

抑制率=[(對(duì)照組OD值-樣品組OD值)/

對(duì)照組OD值]×100%。

(2)

所得的灰樹(shù)花胞外多糖樣品對(duì)人肝癌細(xì)胞HepG 2無(wú)體外抑制作用，見(jiàn)表6。造成該實(shí)驗(yàn)結(jié)果的原因一方面可能是因?yàn)榛钚远嗵堑膩?lái)源、產(chǎn)地、提取方法不同，體外抑瘤的效果會(huì)有差別，同一種多糖的不同級(jí)分或亞級(jí)分也會(huì)有不同的抑瘤效果[16]；另一方面或是因?yàn)榕c其他真菌多糖制劑類(lèi)似，灰樹(shù)花多糖抗癌的機(jī)理并非是直接殺死腫瘤細(xì)胞，而是通過(guò)激活機(jī)體免疫系統(tǒng)，增加巨噬細(xì)胞的吞噬作用，促進(jìn)免疫球蛋白的形成，提高淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化率并提高機(jī)體本身的抗病能力，從而達(dá)到抵抗癌細(xì)胞生長(zhǎng)，防止腫瘤轉(zhuǎn)移，預(yù)防正常細(xì)胞癌變的目的[19]。許多動(dòng)物實(shí)驗(yàn)表明抑制腫瘤轉(zhuǎn)移的生物效應(yīng)調(diào)節(jié)物與激活免疫有關(guān)[20]。一般認(rèn)為，藥用真菌的抗癌機(jī)理是多糖類(lèi)成分，它可以調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng)而間接地抑制腫瘤細(xì)胞[21-24]。多糖作為一種免疫增強(qiáng)劑，臨床上常與其他化療藥物聯(lián)用，用于治療腫瘤，如巖藻多糖與順鉬、泰莫西芬、紫杉醇聯(lián)用能增強(qiáng)對(duì)乳腺癌MCF-7和MDA-MB-231細(xì)胞的抗腫瘤活性[25]。Kim等[26]發(fā)現(xiàn)在靈芝深層發(fā)酵體系中加入人參提取物后分離得到的多糖，能刺激免疫系統(tǒng)抑制腫瘤轉(zhuǎn)移，其體外抑制腫瘤細(xì)胞的活性可能與激活巨噬細(xì)胞，脾細(xì)胞和淋巴集結(jié)細(xì)胞有關(guān)。

表6 灰樹(shù)花胞外多糖對(duì)人肝癌細(xì)胞HepG 2的作用Tab.6 Effect of exopolysaccharide on human hepatoma HepG 2 cells

阿霉素為陽(yáng)性對(duì)照，分子質(zhì)量為579.99。樣品準(zhǔn)確稱量，按送樣方要求用生理鹽水溶解。

3 結(jié) 論

實(shí)驗(yàn)對(duì)天麻醇提物加入至灰樹(shù)花液體發(fā)酵培養(yǎng)基后，所得到的胞外多糖單糖組成變化及抗腫瘤生物活性開(kāi)展了研究。利用傅里葉紅外光譜對(duì)所得到的4種胞外多糖樣品進(jìn)行結(jié)構(gòu)分析，發(fā)現(xiàn)與未經(jīng)純化的灰樹(shù)花胞外粗多糖相比，經(jīng)純化的胞外精多糖在875 cm-1、805 cm-1處有明顯的特征吸收。這可能是灰樹(shù)花多糖經(jīng)純化除雜后具有α構(gòu)型的單糖增加的緣故。

利用HPLC對(duì)4種胞外多糖樣品進(jìn)行單糖組成分析，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，未純化的多糖樣品主要由葡萄糖、甘露糖及少量的半乳糖等單糖構(gòu)成，純化后的多糖由甘露糖、鼠李糖、葡萄糖、半乳糖、阿拉伯糖、巖藻糖等單糖構(gòu)成。同時(shí)，根據(jù)檢測(cè)結(jié)果可知，添加天麻醇提物對(duì)灰樹(shù)花胞外多糖單糖組分含量產(chǎn)生明顯變化，但并未使灰樹(shù)花多糖產(chǎn)生新單糖組分；PEPS樣品中其單糖物質(zhì)的量比甘露糖∶鼠李糖∶葡萄糖∶半乳糖∶阿拉伯糖∶巖藻糖依次為13.8∶3.9∶5∶3.7∶1∶1.7，而PEPS-RG單糖組分物質(zhì)的量比12.7∶3.2∶5.6∶3.5∶1∶1.6。通過(guò)對(duì)比單糖峰面積可知，天麻醇提物的加入，能促進(jìn)灰樹(shù)花分泌鼠李糖、半乳糖、阿拉伯糖、巖藻糖等單糖成分。

對(duì)多糖生物活性進(jìn)行檢測(cè)，由小鼠巨噬細(xì)胞(RAW264.7)活化實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知，PEPS-RG對(duì)巨噬細(xì)胞有明顯的活化作用，PEPS、CEPS-RG對(duì)巨噬細(xì)胞有一定的活化作用，CEPS對(duì)巨噬細(xì)胞無(wú)明確的活化作用。通過(guò)體外實(shí)驗(yàn)檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)4種多糖樣品對(duì)人肝癌細(xì)胞HepG 2無(wú)抑制作用。

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