殷玉潔， 倪培恩， 劉丹蕾， 張菊梅， 吳清平， 王大鵬,*

(1.上海交通大學(xué) 農(nóng)業(yè)與生物學(xué)院 食品科學(xué)與工程系, 上海 200240；2.廣東省微生物研究所/省部共建華南應(yīng)用微生物國家重點實驗室/廣東省菌種保藏與應(yīng)用重點實驗室/廣東省微生物應(yīng)用新技術(shù)公共實驗室， 廣東 廣州 510070)

沙門氏菌(Salmonella)是主要的食源性致病菌之一。據(jù)報道，全球每年因該菌感染導(dǎo)致約9.38億例腹瀉病例，約有15萬人死于由非傷寒沙門氏菌引起的疾病[1]。在我國，70%～80%的細菌性食物中毒事件是由沙門氏菌感染引發(fā)的[2]。豬肉是中國人餐桌上常見食材，也是食源性致病細菌生長的溫床，市售新鮮豬肉的沙門氏菌檢出率高達38.0%以上[3-5]。市售新鮮豬肉中所污染沙門氏菌的生長繁殖規(guī)律尚不清楚，政府管理部門很難對其進行有效防控。

食品中沙門氏菌的種類和豐度對該菌的消長有影響[6]。目前，關(guān)于沙門氏菌生長模型的研究主要采用單一菌種進行人工污染，故難以準(zhǔn)確反映出豬肉中細菌的實際生長狀況[7-8]。環(huán)境因素是影響豬肉中沙門氏菌等致病細菌消長的重要影響因子之一，其中，溫度變化是影響沙門氏菌生長的主要因素[9]。此外，沙門氏菌為適應(yīng)溫度的變化往往會表現(xiàn)出一系列反應(yīng)[6,9]。本團隊對上海市市售農(nóng)產(chǎn)品中沙門氏菌污染情況的調(diào)查結(jié)果顯示，豬肉中以腸炎沙門氏菌 (SalmonellaEnteritidis)、鼠傷寒沙門氏菌 (SalmonellaTyphimurium)和德爾卑沙門氏菌(SalmonellaDerby)3種血清型為主[10]；因此，本研究擬以這3種血清型沙門氏菌作為研究對象，人工污染新鮮豬肉，利用預(yù)測微生物學(xué)中的生長預(yù)測模型建立不同恒溫條件下沙門氏菌的生長模型，并驗證其有效性，為政府監(jiān)管部門防控沙門氏菌的污染提供理論支撐，降低因該菌污染所引起的食品安全風(fēng)險。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

新鮮豬肉(里脊肉)，購于上海市閔行區(qū)某大型超市；Luria-Bertani(LB)液/固體培養(yǎng)基，購于青島高科技工業(yè)園海博生物技術(shù)有限公司；無菌生理鹽水：稱取9.0 g的氯化鈉(NaCl)，以少量去離子水充分溶解后，定容至1 000 mL。分裝后，進行121 ℃滅菌(15 min)。

1.2 儀器與設(shè)備

MLS-3780型高壓滅菌鍋，日本SANYO公司；AES Chemunex型均質(zhì)機，法國Marcy- L’etoile公司；超純水機，美國Milli-Q公司；SW-CJ-1F型超凈工作臺，蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司；微波爐，韓國LG公司；電子天平，瑞士Mettler Toledo公司；微量移液器，德國Eppendorf公司；MS-2型渦旋振蕩器，德國IKA公司；HP-9272型恒溫培養(yǎng)箱，上海一恒科學(xué)儀器有限公司；HZ-8211K型恒溫搖床，太倉市科教儀器廠；LRH-150F型電熱鼓風(fēng)干燥箱，上海一恒科學(xué)儀器有限公司；Whirl-Park?型無菌均質(zhì)袋，深圳Nasco公司；MIR-154型培養(yǎng)箱，日本SANYO公司。

1.3 實驗方法

1.3.1菌株活化

用無菌接種環(huán)分別蘸取適量甘油冷凍管凍存的不同血清型沙門氏菌[10]，LB平板上劃線后，于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng)過夜。次日，用無菌接種環(huán)挑取單菌落接種于LB液體培養(yǎng)基中，于37 ℃恒溫搖床中振蕩培養(yǎng)10～12 h。

1.3.2菌懸液的制備

取不同菌株的LB培養(yǎng)液，調(diào)整OD600為0.6，等比例混合。用無菌生理鹽水將混合菌液梯度稀釋，最終制成濃度為103～104CFU/mL的菌懸液，以備后續(xù)接種使用。

1.3.3樣品制備

從超市購置新鮮豬里脊肉，在冷藏(0～4 ℃)條件下于1 h內(nèi)帶回實驗室。將豬肉置于紫外燈下滅菌30 min，用無菌手術(shù)刀將豬肉均勻分塊，每塊25.0 g，厚度3.0～5.0 mm。

1.3.4接種

將1.3.3制備的肉塊置于1.3.2中所制備的菌懸液中室溫浸泡20 min，瀝干肉塊多余水分。將肉塊分別放入不同的無菌保鮮盒(每個保鮮盒中放有一個無菌不銹鋼架，防止肉塊在恒溫放置過程中與產(chǎn)生的肉汁接觸而影響實驗結(jié)果)中并分別置于4、10、25、33、37 ℃培養(yǎng)箱，每組3份，進行平行實驗。

1.3.5沙門氏菌生長曲線測定

將1.3.4中的人工污染豬肉樣品分別置于5個設(shè)定溫度恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。每隔一段時間，每組分別取出3份25.0 g平行樣品，分別置于無菌均質(zhì)袋中，加入225 mL無菌生理鹽水，均質(zhì)機拍打3 min。用無菌生理鹽水對處理樣品的混合液進行10倍梯度稀釋。取3個適宜梯度的稀釋液(1.0 mL)涂布于LB平板上，37 ℃過夜培養(yǎng)，次日計數(shù)。具體方法參照GB 4789.2—2016[11]。

1.4 數(shù)據(jù)處理

所有數(shù)據(jù)均由Origin Pro 2017以及DMfit 3.5軟件進行分析。

1.4.1沙門氏菌初級模型建立

基于修正的Gompertz模型，利用DMfit 3.5軟件將沙門氏菌在不同溫度下生長量的變化情況進行曲線擬合，得到沙門氏菌的初級生長模型。

修正的Gompertz模型方程見式(1)。

(1)

式(1)中：t是培養(yǎng)時間，h；N(t)是t時的微生物數(shù)量，CFU/g；N0是t=0時的初始微生物數(shù)量，CFU/g；Nmax表示生長至穩(wěn)定期時的最大微生物數(shù)量，CFU/g；μmax表示微生物生長的最大比生長速率，h-1；λ表示微生物生長過程中的延滯期，h。

1.4.2溫度對沙門氏菌生長影響二級模型的建立

由1.4.1建立的初級模型得到μmax和λ等參數(shù)，根據(jù)參數(shù)建立沙門氏菌的二級生長模型。二級生長模型以初級模型為基礎(chǔ)，主要用于描述初級模型的參數(shù)(如λ、μmax等)與不同的環(huán)境參數(shù)(如溫度、水分活度、pH值等)之間的關(guān)系。本研究主要著重于溫度對初級模型參數(shù)(μmax和λ)的影響，利用平方根模型描述溫度與μmax和溫度與λ之間的變化關(guān)系。具體模型如式(2)和式(3)。

(2)

(3)

式(2)和式(3)中：T表示培養(yǎng)溫度，℃；Tmin表示最低生長溫度，℃；bμmax和bλ分別是兩個方程的常數(shù)。

1.4.3沙門氏菌生長模型的驗證

1.4.3.1 模型的內(nèi)部驗證

生長模型的內(nèi)部驗證主要基于各項數(shù)學(xué)參數(shù)。在本實驗中主要利用Af、Bf、均方根誤差(RMSE)、判定系數(shù)(R2)以及殘差分析對模型進行內(nèi)部驗證。Af(見式(4))表示預(yù)測值與觀測值之間的準(zhǔn)確程度，如果Af>1，并且值越接近1，說明預(yù)測值和觀測值越接近，該模型具有較高的準(zhǔn)確度[12]。Bf(見式(5))表示預(yù)測值與觀測值之間的偏差程度，若Bf<1，表示預(yù)測值比觀測值小，表示該模型的預(yù)測值處于一個合理的范圍內(nèi)[12]。RMSE(見式(6))可以用來衡量預(yù)測準(zhǔn)確度，說明該模型預(yù)測值的離散程度[12]。

(4)

(5)

(6)

在式(4)、式(5)中，μpre表示根據(jù)生長模型得到的微生物數(shù)量的預(yù)測值；μobs表示在相同時間，實際實驗中所觀察到的微生物數(shù)量；n表示實驗次數(shù)。

R2用來對模型方程的擬合優(yōu)度進行評價，如果R2越接近1，則表示該模型的擬合優(yōu)度越高。殘差分析指觀測值與預(yù)測值之間的差，即實際觀察值與模型預(yù)測值的差，并以此來分析模型的可靠性。

1.4.3.2 模型的外部驗證

選取20 ℃和28 ℃作為額外的驗證溫度，在相同環(huán)境下對沙門氏菌進行生長曲線的測定，對已建立的模型進行可靠性評估。實驗步驟同1.3。

1.4.4波動溫度下沙門氏菌生長模型的建立

模擬日常生活中消費者購買冷藏的新鮮豬肉，帶回家，再冷藏的過程。以4 ℃ 6 h，20 ℃ 3 h和4 ℃ 90 h作為波動溫度條件，建立沙門氏菌在鮮豬肉中的生長模型。以等效生長時間理論為基礎(chǔ)，用修正的Gompertz模型可以較好地描述波動溫度下微生物的生長過程。當(dāng)微生物在T1溫度下培養(yǎng)時間t1，該階段可用方程表示，見式(7)。

(7)

當(dāng)微生物在溫度T1下培養(yǎng)時間t1后，又進入溫度T2培養(yǎng)時間t2時，根據(jù)EGT原理，T1溫度下培養(yǎng)時長t1的過程，等效于在T2溫度時培養(yǎng)時長te的生長過程，可用方程表示，見式(8)。

(8)

將λ1、λ2、μ1、μ2代入式(7)和式(8)后，可以得到te值。在溫度T1培養(yǎng)t1后，溫度波動至溫度T2，這一過程可以用式(9)表述，其中Δt表示在溫度T2時培養(yǎng)的時間。

(9)

1.4.5波動溫度下沙門氏菌生長模型的驗證

在波動溫度下，該模型可靠性可以用Af、Bf等參數(shù)進行評價；但Af和Bf不再根據(jù)μmax進行計算，而是把同一時間點上觀測得到的細菌量和模型預(yù)測得到的細菌量進行比較，再計算得到Af和Bf。波動溫度下Af和Bf的計算公式見式(10)、式(11)。

(10)

(11)

2 結(jié)果與分析

2.1 市售新鮮豬肉中沙門氏菌初級生長模型分析

對在5個恒定溫度下人工污染豬肉樣品中的沙門氏菌進行計數(shù)，利用修正的Gompertz方程對結(jié)果進行擬合，得到沙門氏菌在豬肉中的生長曲線(圖1)。圖1顯示，沙門氏菌在不同溫度下生長曲線均能形成良好的“S”型，且溫度對其生長影響較大。限定溫度范圍內(nèi)，培養(yǎng)溫度越高，細菌生長速率越高。當(dāng)環(huán)境溫度控制在10 ℃以下時，可以有效限制沙門氏菌生長。研究結(jié)果提示：為了較好地降低沙門氏菌的污染風(fēng)險，需要盡早將食品低溫保存。

圖1 新鮮豬肉中沙門氏菌在不同溫度下的生長曲線Fig.1 Growth curves of Salmonella at different temperatures in fresh pork

沙門氏菌生長動力模型參數(shù)分析見表1。由表1可見，不同培養(yǎng)溫度下，各初級生長模型的判定系數(shù)R2均大于0.99，證明修正的Gompertz模型可以較好地反映出新鮮豬肉中沙門氏菌的生長規(guī)律。沙門氏菌的μmax和λ與溫度關(guān)系密切，沙門氏菌的μmax隨溫度的升高而升高。當(dāng)溫度在4 ℃時，沙門氏菌的μmax為0.017 28，生長十分緩慢；當(dāng)溫度為37 ℃時，該菌μmax為0.818 5，遠高于4 ℃時的μmax。沙門氏菌的λ隨著溫度的升高而不斷減小。當(dāng)溫度在4 ℃時，λ為77.471 9；當(dāng)溫度達到37 ℃時，λ僅為2.279 5。溫度對于沙門氏菌的最終濃度也有一定影響，25、33、37 ℃時的最終濃度均能達到108CFU/g以上，而在4 ℃和10 ℃這兩個較低溫度下，其最終濃度均低于108CFU/g。此結(jié)果與鄭婷等[7]研究結(jié)果相吻合，其在冷卻牛肉中沙門氏菌生長預(yù)測模型的建立研究中，同樣證實生長速率與遲滯期對溫度都具有很強的相關(guān)性。

表1 不同溫度下沙門氏菌的生長參數(shù)Tab.1 Growth parameters of Salmonella at different temperatures

2.2 沙門氏菌二級模型分析與驗證結(jié)果

2.2.1二級模型分析

圖2 溫度與μmax的關(guān)系Fig.2 Fitted curve of the maximum specific growth rate and temperature

圖3 溫度與λ的關(guān)系Fig.3 Fitted curve of lag phase and temperature

2.2.2沙門氏菌生長模型驗證結(jié)果分析

圖4 沙門氏菌生長速率平方根模型的殘差Fig.4 Residual error of Salmonella growth rate model

2)外部驗證結(jié)果分析。根據(jù)在20 ℃和28 ℃兩個溫度下的額外實驗所獲得的實驗數(shù)據(jù)，對已經(jīng)建立的溫度與μmax的關(guān)系進行二級模型的驗證。結(jié)果見表2。

Te Giffel等[14]認為，Bf值在0.75～1.25時，該模型可信度較高，可以被接受。Braun等[15]認為，Af值在1.1～1.9時，生長模型可被接受。由表2可知，外部驗證溫度為20 ℃和28 ℃時，Bf分別為0.936 9和0.846 3，Af為1.174 6和1.181 6，均在可接受的范圍內(nèi)。

表2 模型外部驗證中Af和BfTab.2 Af and Bf of external validation of model

2.3 波動溫度下沙門氏菌生長模型分析與驗證結(jié)果

在利用修正的Gompertz模型建立沙門氏菌初級生長模型的基礎(chǔ)上，根據(jù)平方根模型，建立沙門氏菌的二級模型，見式(12)、式(13)。

(12)

(13)

在波動溫度為4 ℃ 6 h，20 ℃ 3 h，4 ℃ 90 h的條件下，以恒定溫度下建立的二級模型為基礎(chǔ)，根據(jù)等效生長理論建立波動溫度下沙門氏菌的生長模型。對新鮮豬肉中沙門氏菌在該條件下的實際生長狀況進行定量測定。通過比較實測值與模型的預(yù)測值，評估該模型的可靠性，模型的建立與驗證見圖5。從圖5結(jié)果中可以看出，實測值的分布趨勢與模型曲線的趨勢基本一致，且都落在預(yù)測曲線附近，表明建立的預(yù)測模型與沙門氏菌實際生長情況較為吻合。隨溫度升高至20 ℃，沙門氏菌的濃度有一個明顯的上升趨勢，說明溫度的升高明顯加快了沙門氏菌的生長，所以消費者在購買完豬肉后應(yīng)及時將豬肉帶回家，盡早烹飪或置于低溫貯存。通過該預(yù)測模型還可以發(fā)現(xiàn)，在100 h內(nèi)，沙門氏菌在波動溫度下的生長量一直保持在103.8CFU/g以下，說明消費者從購買豬肉開始，再到將豬肉放在冰箱保存的4 d內(nèi)，在低溫條件下，沙門氏菌的生長量不大。在實驗過程中也發(fā)現(xiàn)，豬肉的表面也未出現(xiàn)明顯的腐敗現(xiàn)象，無異味產(chǎn)生，這也驗證了豬肉在該波動溫度下微生物生長速度緩慢。

圖5 波動溫度下沙門氏菌濃度的實測值與預(yù)測值Fig.5 Observed values and predicted curves of Salmonella grown in pork at fluctuating temperature

圖6表示在波動溫度下，同一時間點沙門氏菌生長量的實測值與預(yù)測值之間的相關(guān)性。其中R2=0.944，說明預(yù)測值與實測值之間的相關(guān)性較高。

圖6 波動溫度下同一時間點沙門氏菌濃度實測值與預(yù)測值的相關(guān)性比較Fig.6 Observed values and predicted values under variable temperatures

本實驗利用Af和Bf對波動溫度下所建立的沙門氏菌生長模型進行評價，結(jié)果見表3。由表3可知，Af=1.136 2，誤差在15%內(nèi)，屬于文獻[14-15]得到的可接受范圍；該模型的Bf=0.895 4，同樣在文獻[14-15]得到的可接受的范圍內(nèi)。因此，在波動溫度下建立的生長模型在預(yù)測沙門氏菌生長狀況方面可靠性較高。

表3 波動溫度下沙門氏菌生長模型的準(zhǔn)確性評價Tab.3 Af and Bf of predictive model at fluctuating temperatures

3 結(jié) 論

選取具有代表我國居民日常肉類膳食的市售新鮮豬肉為實驗對象，將前期研究中得到的豬肉中檢出率最高、分布最廣的3種血清型沙門氏菌混合物對豬肉進行人工污染。分別測定了4、10、25、33、37 ℃五個恒定溫度下細菌的生長規(guī)律，建立了市售新鮮豬肉中沙門氏菌的生長預(yù)測模型并利用DMfit 3.5軟件進行擬合分析。

1)所得5個恒定溫度下沙門氏菌的生長預(yù)測模型，R2均大于0.99，模型擬合程度高，結(jié)果可靠；μmax和λ分別隨溫度的升高而增大和縮短。在初級模型基礎(chǔ)上建立了沙門氏菌的二級模型，該模型能夠準(zhǔn)確地反映出溫度與μmax和λ間的關(guān)系，殘差絕對值均小于0.05，在置信水平α= 0.05上可信。用20 ℃和28 ℃對模型進行驗證，其Bf分別為0.936 9和0.846 3，Af為1.174 6和1.181 6，均在可接受的范圍內(nèi)，表明該模型能有效預(yù)測豬肉中沙門氏菌的生長狀況。

2)基于等效時間理論建立的波動溫度下沙門氏菌的生長預(yù)測模型，實測值的分布趨勢與模型曲線的趨勢基本一致。同一時間點沙門氏菌生長量的實測值與預(yù)測值之間的R2=0.944，模型擬合良好。利用Af和Bf對波動溫度下所建立的生長模型進行評價，Af=1.136 2，Bf=0.895 4，表明波動溫度下建立的生長模型在預(yù)測沙門氏菌生長狀況方面可靠性較高。

3)研究結(jié)果提示，消費者在購買豬肉后應(yīng)盡快食用或放在低溫環(huán)境下保存，以降低因沙門氏菌增殖而增加的食品安全風(fēng)險。

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