胡進玲，古麗君，曹 師，成鳳花，李彥忠，2

(1.蘭州大學草地農業(yè)生態(tài)系統(tǒng)國家重點實驗室 農業(yè)農村部草地畜牧業(yè)創(chuàng)新重點實驗室 蘭州大學草地農業(yè)科技學院，甘肅 蘭州 730020; 2.中國農業(yè)科學院草原研究所，內蒙古 呼和浩特 010010)

微生物實驗室是指進行微生物研究的場所，主要用以檢測、分離、培養(yǎng)、保存各類有致病性的真菌、細菌、病毒等微生物或植物內生真菌、根瘤菌等有益微生物。微生物實驗室要求無菌環(huán)境，除研究人員目標菌種之外的其他真菌和細菌均統(tǒng)稱為雜菌。實驗室培養(yǎng)的微生物一旦被雜菌污染，輕者需要重新培養(yǎng)，嚴重則延緩試驗進程，重者丟失寶貴的菌種，致使科研失敗[1-2]。

隨著國家和社會對科學研究的大力投入，越來越多的工作者加入到科學研究的隊伍中，因此各院校辦學規(guī)模不斷擴大，學生人數(shù)逐年增加，但高校實驗教學硬件滯后，實驗室普遍存在著人員密集、實驗室空間狹小、實驗用品使用頻率極高等情況,造成其污染系數(shù)增加[3-4]。我國首部《病原微生物實驗室生物安全管理條例》已于2004年11月12日經國務院發(fā)布實施，這標志著我國對病原微生物相關實驗室的生物安全管理的高度重視[5]，廣大學者在實驗室微生物污染管理等方面也進行了大量有意義的探索[6-7]，但主要還是集中于臨床醫(yī)學，而對于植物病原微生物實驗室中雜菌的污染及來源研究較少，目前就植物病原微生物實驗室污染雜菌種類及預防措施知之甚少。

蘭州大學草地農業(yè)科技學院某微生物實驗室某一時期也出現(xiàn)了雜菌嚴重污染培養(yǎng)的微生物的情況，為確定雜菌種類及其來源，本研究以該微生物實驗室為研究場所，對植物病原微生物實驗室的雜菌進行檢測，并且結合形態(tài)學和分子生物學對主要污染物進行鑒定，確定其種類。通過將檢測到的菌種與空氣中常見微生物進行對比以及將無菌間和常規(guī)操作間菌物種類進行對比，分析雜菌來源，以期做到有針對性的預防。本研究旨在為微生物實驗室微生物污染的預防、科研環(huán)境的改善提供科學依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 房間布局及采樣點安排

微生物實驗室由兩部分組成，無菌間和常規(guī)操作間。無菌間并排放置3臺超凈工作臺，每個超凈工作臺臺面和工作臺下地面設為采樣點，各采樣點3個重復；常規(guī)操作間主要由15 m2的長方形試驗臺組成，設置4個采樣點，分別位于試驗臺的每個角上。

1.2 實驗室污染菌檢測

采用平皿暴露法收集實驗室污染的雜菌[8]，在無菌間的3臺超凈臺內部和超凈臺地面分別隨機擺放3皿馬鈴薯瓊脂培養(yǎng)基(potato dextrose agar,PDA)，在常規(guī)操作間的試驗臺4個拐角分別放一皿PDA，同時揭開培養(yǎng)皿蓋子，放置5 min后蓋上蓋子。

1.3 除菌與再次檢測

用滅菌后的潮濕抹布徹底擦拭超凈臺內外，噴灑75%的酒精于超凈臺內部，并用滅菌濾紙再次擦拭，然后用干凈的拖把將無菌間內的地面充分拖2遍，隨后打開3臺超凈工作臺電源開關，將風速調為中檔吹10 min，關掉電源之后收集超凈臺內和地面的微生物，方法同1.2。

1.4 微生物培養(yǎng)與鑒定

1.4.1微生物培養(yǎng) 將收集微生物的培養(yǎng)皿封口，于微生物培養(yǎng)箱內在22 ℃的環(huán)境下培養(yǎng)48 h，按照菌落顏色和菌落形態(tài)統(tǒng)計每個平板中所見菌落數(shù)，并按采樣點分類登記，純化雜菌的菌落，再培養(yǎng)6 d后觀察菌落特征，采用形態(tài)學和分子生物學鑒定菌種。

1.4.2主要污染菌物鑒定 選擇菌落總數(shù)大于等于2的菌物進行形態(tài)學和分子生物學鑒定[9]。細菌的16 S序列擴增參考胡進玲等[10]的方法。真菌全基因組使用真菌 DNA 提取試劑盒(型號為D3195-1)，用引物ITS1(AGGAGAGTCGTAACAAGGT)和ITS4(TCCTCCGCTTATTGATAT GC)[11-12]，PCR擴增程序為:體系20 μL體系，具體為0.5 μL模板DNA，0.5 μL引物ITS1，0.5 μL引物ITS4，10 μL Eco taq mixture，8.5 μL ddH2O。反應條件為裂解95 ℃，2 min，退火至53 ℃，20 s，復性72 ℃，1 min 40 s，重復35個循環(huán)，最終延伸72 ℃，7 min，擴增結束后以4 ℃保存[12]。然后基于BLAST軟件對所測得序列和NCBI中的核酸序列進行比對分析，找出與目的序列同源性高且通過正式發(fā)表的序列用于系統(tǒng)發(fā)育分析，再采用MEGA6以鄰接法(neighbor-joining,NJ)對其構建系統(tǒng)發(fā)育樹。設置1 000次隨機抽樣，計算自引導值(bootstrap)，以評估系統(tǒng)發(fā)育樹的置信度[10,13]。

2 結果與分析

2.1 實驗室污染微生物統(tǒng)計與鑒定

將雜菌進行純化，并在培養(yǎng)箱中培養(yǎng)6 d，通過菌落顏色和形態(tài)特征統(tǒng)計出現(xiàn)的雜菌種數(shù)和菌落數(shù)。結果顯示，供試培養(yǎng)皿中菌落總數(shù)大于等于2的微生物有11種，通過其在PDA中的形態(tài)特征(如圖1)，可以判斷，其中有3種真菌、8種細菌，將其編號為1～11號，通過菌落形態(tài)和顯微觀察，確定1號污染物為青霉(Penicilliumsp.)，而其他雜菌未知，故對2～11號微生物進行進一步鑒定。通過觀察2、3號真菌的分生孢子和分生孢子梗形態(tài)(圖2)，結合其分子生物學鑒定結果(圖3)，確定2號真菌為殼皮盤菌(Pezizaostracoderma)，3號真菌為枝孢樣枝孢霉(Cladosporiumcladosporioides)。通過分子生物學鑒定，確定4～11號細菌分別為解淀粉芽孢桿菌(Bacillusamyloliquefaciens)、海迪茨氏菌(Dietziamaris)、球形節(jié)桿菌(Arthrobacterglobiformis)、微球菌屬(Micrococcussp.)、馬西利亞菌屬(Massiliasp.)、玫瑰色庫克菌(Kocuriarosea)、嗜根考克氏菌(K.rhizophila)、萎蔫短小桿菌(Curtobacteriumflaccumfaciens) (圖4)。

圖1 1～11號污染菌物在培養(yǎng)皿里的菌落形態(tài)Fig. 1 Colony morphology of No.1～No.11 fungal contaminants in petri dish

a～k分別代表1～11號污染物菌落。

a～k represents the microorganism colony of No.1～No11.

圖2 2號、3號真菌孢子和分生孢子梗Fig. 2 Spores and conidiophores of No.2 and No.3 fungal contaminants

a、b為2號真菌的分生孢子和分生孢子梗；c、d為3號真菌分生孢子和分生孢子梗。

a, b for no.2 fungi conidium and conidiophore; c, d for no.3 fungi conidium and conidiophores.

圖3 2、3號真菌污染物與相關菌種的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig. 3 Phylogenetic tree of No.2, No.3 fungi and their relatives

圖4 4～11號細菌污染物與相關菌種的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig. 4 Phylogenetic tree of No.4～No.11 bacteria and their relatives

通過統(tǒng)計與鑒定，本研究發(fā)現(xiàn)(表1)，病原微生物實驗室中造成污染的優(yōu)勢菌種依次為玫瑰色庫克菌、球形節(jié)桿菌、海迪茨氏菌、青霉、微球菌屬，菌落總數(shù)分別為28、28、23、15、13個，是最主要的防范對象。通過形態(tài)和顯微鏡觀察，本研究發(fā)現(xiàn)，3種污染真菌生長速度快，產孢迅速且孢子量極大，對微生物實驗室的環(huán)境威脅極大。通過對實驗室中無菌間和試驗臺空間的污染物檢測，本研究發(fā)現(xiàn)，無菌間的雜菌種類遠多于試驗臺空間，且包含了所有試驗臺空間的污染菌種類。因此，結果表明，造成微生物試驗污染最嚴重的地方為無菌間，在日常試驗過程中應對其進行嚴格滅菌。

2.2 無菌間除菌操作效果評估

對無菌間的超凈臺進行無菌抹布擦拭、噴灑酒精、開機吹風等操作后，超凈工作臺面5種優(yōu)勢菌中，4種徹底消失，剩余1種平均菌落數(shù)減少了66.67%；對于超凈工作臺面全部雜菌而言，處理前后雜菌種類下降了64%，處理前后均有的3種菌(枝孢樣枝孢霉、球形節(jié)桿菌、馬西利亞菌屬)經處理后菌落數(shù)量分別下降了50%、67%和0；超凈工作臺地面擦拭后雜菌種類減少了9%，未徹底清除的菌中，青霉、枝孢樣枝孢霉、解淀粉芽孢桿菌等7種雜菌的平均菌落數(shù)減少，減少范圍為29.73%～80.36%(表2)。因此，徹底擦拭超凈工作臺、噴灑酒精等操作可有效減少微生物培養(yǎng)中的污染。

表1 微生物菌落在供試培養(yǎng)基中出現(xiàn)情況Table 1 Microbial colonies in the test medium

〇表示該種菌在超凈臺或試驗臺被檢測到。

〇 indicates this kind of microorganism was detected in benchtop or experiment table.

表2 除菌操作前后超凈臺11種菌平均菌落數(shù)Table 2 The average colony count of 11 strains before and after sterile operation

同列不同小寫字母表示不同處理在0.05水平上差異顯著(P<0.05)。

Different lowercase letters within the same column indicate significant difference at the 0.05 level.

3 討論與結論

本研究采用PDA平板暴露法結合微生物形態(tài)學和分子生物學鑒定，可以快速準確地統(tǒng)計出實驗室的污染菌，通過將檢測到的菌種與空氣中常見微生物對比，分析雜菌來源，在對污染物充分了解的情況下進行有針對性的預防。本研究在微生物實驗室檢測到的菌中，青霉和馬西利亞菌被報道廣泛分布于自然界空氣中[14]，其余菌種均不是空氣中常見微生物[15-16],說明該實驗室污染的主要原因不是由實驗室內外空氣流通引起的。據(jù)報道，球形節(jié)桿菌、微球菌屬、海迪茨氏菌主要分布于土壤中，分別用于修復污染農田、硝酸還原、降解原油污染[17-19]；殼皮盤菌、枝孢樣枝孢霉為腐生真菌，主要存在于土壤，枯萎植物及糞便中[20-21]；玫瑰色庫克菌、嗜根考克氏菌、萎蔫短小桿菌為3種病原菌，主要危害植物種子、根部和葉片[22-24]；解淀粉芽孢桿菌為一種植物內生細菌，生防效果明顯[10,25]。因此可以確定，這些雜菌可能是研究人員在微生物研究過程中操作不當引起的污染。從雜菌來源來看，嚴格規(guī)范試驗操作是減少污染最主要的途徑，因為污染菌中也有空氣中常見兩種菌，因此減少實驗室的內外空氣流動也十分必要。

對于目前實驗室已有雜菌，應采用有效除菌操作。本研究中的除菌操作雖為常規(guī)除菌操作，但可以將超凈臺內青霉、殼皮盤菌、解淀粉芽孢桿菌、海迪茨氏菌、微球菌屬、玫瑰色庫克菌和萎蔫短小桿菌完全清除，將枝孢樣枝孢霉等兩種菌的菌落數(shù)減少，可見除菌效果明顯。因此在日常微生物試驗中，常規(guī)除菌操作必不可少。本研究發(fā)現(xiàn)，該方法操作不僅簡單，而且能高效除菌，其原因在于試驗前打開超凈工作臺吹風，使用滅菌濕抹布擦拭超凈臺內外，用滅菌拖把清潔超凈臺周圍地面，這些操作可將一些生長于儀器表面或地面的污染物清除，且制造相對潮濕的試驗環(huán)境，減少真菌孢子的飛濺傳播[26-27]，同時，超凈臺吹風可將浮游在空氣中的微生物或孢子吸附進入超凈臺下方的過濾器中[28]，避免造成試驗污染；試驗前噴灑75%的酒精于超凈臺內，可同時殺死空氣中和儀器表面的微生物[29-30]。

雖然通過超凈臺擦拭、酒精噴霧、拖地等常規(guī)除菌操作可以使超凈臺內9種雜菌的平均菌落數(shù)減少，但在除菌操作前后差異不顯著，因此在微生物試驗過程中，必須結合其他滅菌措施，比如紫外滅菌。紫外線對微生物的DNA 及RNA具有強大破壞力，使微生物喪失生存和繁殖能力從而消滅細菌、病毒，達到消毒滅菌成效[31-34]。據(jù)夏祖英和汪國珍[35]報道，距離1 m，15 W紫外線照射空氣2 h，可以完全消滅超凈臺里的污染菌，因此在試驗人員晚上離開實驗室時，可以打開無菌間和常規(guī)操作間的紫外燈，對實驗室的空氣進行徹底滅菌。因為在本研究中，被檢測到的11種主要污染菌種中，其中8種為細菌污染物，因此在試驗允許的前提下，可以在培養(yǎng)基中加一定量的抗生素，比如青霉素、鏈霉素等，來預防細菌的污染[36-37]。其次，正確的試驗操作方法也可避免試驗污染，如在靠近酒精燈周圍空間進行微生物試驗，酒精燈外焰的加熱溫度為400～500 ℃，可殺死其周圍空氣里的浮游微生物及孢子[38-39]。

綜上所述，采用PDA平板暴露法結合微生物形態(tài)學和分子生物學進行鑒定，可以快速準確地鑒定出實驗室的污染菌種類，分析出雜菌主要來源，做出有針對性的預防。該方法不僅適用于微生物實驗室，在醫(yī)學實驗室、分子實驗室和植物組織培養(yǎng)室的微生物污染檢測、鑒定、預防等方面都具有重要的借鑒意義[40-42]。

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