康 婕

（陜西省產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)研究院，陜西西安 710048）

0 引言

檢測(cè)方法是一項(xiàng)檢測(cè)技術(shù)程序，是實(shí)驗(yàn)室管理體系中技術(shù)要求的一個(gè)重要要素，是實(shí)驗(yàn)室管理體系中過程要求的一項(xiàng)核心要素。實(shí)驗(yàn)室可以選擇的檢測(cè)方法有標(biāo)準(zhǔn)方法和非標(biāo)方法。標(biāo)準(zhǔn)方法需要進(jìn)行驗(yàn)證工作，而非標(biāo)方法則需要開展確認(rèn)工作。然而，許多實(shí)驗(yàn)室的檢測(cè)人員不能完全理解方法確認(rèn)和方法驗(yàn)證的概念，所以對(duì)方法驗(yàn)證和方法確認(rèn)進(jìn)行系統(tǒng)性論述，旨在為檢測(cè)實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行驗(yàn)證和確認(rèn)提供參考。

1 方法驗(yàn)證和方法確認(rèn)的區(qū)別

1.1 概念

ISO/IEC 99—2007指南，2.44中規(guī)定“方法驗(yàn)證是實(shí)驗(yàn)室通過核查，提供客觀有效證據(jù)證明滿足檢測(cè)方法規(guī)定的要求”；ISO/IEC 99—2007指南，2.45中規(guī)定“實(shí)驗(yàn)室通過試驗(yàn)，提供客觀有效證據(jù)證明特定檢測(cè)方法滿足預(yù)期的用途”[1]。準(zhǔn)確地講，方法驗(yàn)證著重于檢測(cè)方法會(huì)不會(huì)用，方法確認(rèn)則著重于該檢測(cè)方法能不能用。

1.2 目的

由概念可以看出，方法驗(yàn)證旨在實(shí)驗(yàn)室是否有能力按標(biāo)準(zhǔn)方法開展實(shí)驗(yàn)室活動(dòng)（包括檢測(cè)、校準(zhǔn)和抽樣），主要著重于能否出具充分的客觀依據(jù)。方法確認(rèn)則主要看該非標(biāo)方法是否能合理、合法使用。

1.3 范圍

方法驗(yàn)證是實(shí)驗(yàn)室內(nèi)方法驗(yàn)證。方法確認(rèn)包括實(shí)驗(yàn)室內(nèi)方法確認(rèn)和實(shí)驗(yàn)室間方法確認(rèn)。方法確認(rèn)的研究領(lǐng)域要比方法驗(yàn)證廣得多。

1.4 時(shí)機(jī)

方法驗(yàn)證是在實(shí)驗(yàn)室引入檢測(cè)與校準(zhǔn)之前證實(shí)運(yùn)用標(biāo)準(zhǔn)方法的正確性，方法確認(rèn)應(yīng)在首次使用非標(biāo)方法（書、期刊、一起） 之前確認(rèn)，方法實(shí)施（新的基質(zhì)、檢測(cè)儀器變化、樣品前處理變化等）或者工作環(huán)境發(fā)生了改變，或長期停用后的再確認(rèn)，當(dāng)方法偏倚時(shí)也應(yīng)當(dāng)進(jìn)行確認(rèn)。

1.5 對(duì)象

方法驗(yàn)證適用于標(biāo)準(zhǔn)方法，標(biāo)準(zhǔn)方法是由公認(rèn)機(jī)構(gòu)通過評(píng)價(jià)確認(rèn)之后向社會(huì)公開頒布的技術(shù)規(guī)范文件，包括：①國內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)（國家標(biāo)準(zhǔn)、行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)和地方標(biāo)準(zhǔn)）；②國際標(biāo)準(zhǔn)（如ISO，IEC，ITU等頒布的標(biāo)準(zhǔn)）；③區(qū)域標(biāo)準(zhǔn)（如歐洲標(biāo)準(zhǔn)化委員會(huì)（CEN）等頒布的標(biāo)準(zhǔn)）；④國外標(biāo)準(zhǔn)（如ANSI，DIN，BSI等頒布的標(biāo)準(zhǔn)）。

方法確認(rèn)適用于：①非標(biāo)方法；②實(shí)驗(yàn)室設(shè)計(jì)（制定）的方法；③超出其預(yù)定范圍使用的標(biāo)準(zhǔn)方法（例如，當(dāng)檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)要求測(cè)定物含量需小于1%，而實(shí)際待測(cè)物為8%～12%，實(shí)驗(yàn)室采用該標(biāo)準(zhǔn)對(duì)待測(cè)物進(jìn)行了檢測(cè)，這就是超出標(biāo)準(zhǔn)要求范圍進(jìn)行的檢測(cè)，所獲得的結(jié)果依然是準(zhǔn)確且有效的）；④擴(kuò)充和修改過的標(biāo)準(zhǔn)方法[2]（例如，一則標(biāo)準(zhǔn)是應(yīng)用于飲料中某項(xiàng)指標(biāo)的檢測(cè)，細(xì)微修改后用來當(dāng)作白酒中某項(xiàng)指標(biāo)的檢測(cè)，對(duì)檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行有效性評(píng)估后發(fā)現(xiàn)測(cè)試數(shù)據(jù)準(zhǔn)確有效，則此修改過的標(biāo)準(zhǔn)方法可靠有效）。方法確認(rèn)應(yīng)盡可能全面，以滿足預(yù)定用途或應(yīng)用領(lǐng)域的需要。但是以下幾種情況不需要再進(jìn)行確認(rèn)：①知名技術(shù)組織公布的、國際上普遍采用、行業(yè)廣泛認(rèn)可的某些公司或者行業(yè)協(xié)會(huì)的標(biāo)準(zhǔn)，通?？梢圆贿M(jìn)行確認(rèn)而直接使用；②對(duì)于獲得政府、行業(yè)組織承認(rèn)的非標(biāo)準(zhǔn)方法可直接證實(shí)使用，不需進(jìn)行確認(rèn)；③對(duì)科學(xué)書籍和期刊公布的方法，若是國際普遍采用或行業(yè)廣泛認(rèn)可的，可以直接證實(shí)使用；④對(duì)于儀器供應(yīng)商提供的方法，若檢測(cè)與校準(zhǔn)對(duì)象跟其描述的類型、范圍相同，且該方法為行業(yè)內(nèi)公認(rèn)，則可直接證實(shí)使用。

2 方法驗(yàn)證和方法確認(rèn)的內(nèi)容

2.1 方法驗(yàn)證

通常而言，實(shí)驗(yàn)室在新檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)投入使用前或者已經(jīng)確認(rèn)過的方法出現(xiàn)微小改動(dòng)時(shí)（如改變稀釋了濃度指標(biāo)，選用不同廠家的柱子等） 需要進(jìn)行方法驗(yàn)證，進(jìn)行驗(yàn)證時(shí)需要從人力資源、設(shè)備、環(huán)境條件、試劑等幾個(gè)方面去驗(yàn)證是否有能力開展實(shí)驗(yàn)室活動(dòng)（包括檢測(cè)、校準(zhǔn)和抽樣），當(dāng)綜合考量上述條件均滿足檢測(cè)的要求后，還需進(jìn)一步驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)室是否有能力滿足標(biāo)準(zhǔn)方法的要求。如何進(jìn)行實(shí)驗(yàn)室驗(yàn)證依賴于檢測(cè)目標(biāo)物的種類和實(shí)驗(yàn)室手段的性質(zhì)。關(guān)注基礎(chǔ)參數(shù)（如回收率、線性、精密度、不確定度等）是否能達(dá)到實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)要求。

2.2 方法確認(rèn)

方法確認(rèn)工作不是一項(xiàng)偶然行動(dòng)，是經(jīng)過計(jì)劃和準(zhǔn)備的。方法確認(rèn)的內(nèi)容應(yīng)該廣泛且全面，以滿足預(yù)定用途或應(yīng)用領(lǐng)域的需要。標(biāo)準(zhǔn)方法的確認(rèn)準(zhǔn)則是：所用的人員、設(shè)備、試劑、環(huán)境等以證明實(shí)驗(yàn)室能夠正確使用該新標(biāo)準(zhǔn)實(shí)施檢測(cè)過程，確定技術(shù)路線和相關(guān)參數(shù)。非標(biāo)方法的確認(rèn)通常從以下5個(gè)方面確認(rèn)。

（1）使用標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)進(jìn)行比較或者評(píng)定偏差和精度。應(yīng)選擇合適的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)（標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)應(yīng)該滿足其準(zhǔn)確度，應(yīng)該優(yōu)于擬確認(rèn)方法的準(zhǔn)確度；標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的種類、濃度范圍應(yīng)該與擬確認(rèn)方法相符合），采用不確定度檢驗(yàn)法和t檢驗(yàn)法和回收率檢驗(yàn)法進(jìn)行方法確認(rèn)。在用回收率試驗(yàn)進(jìn)行評(píng)價(jià)時(shí)應(yīng)該注意：加標(biāo)量應(yīng)該小于待測(cè)物含量的3倍；測(cè)定含量在mg/kg級(jí)時(shí)，回收率含量應(yīng)該在90%以上，測(cè)定含量在μg/kg級(jí)時(shí)，回收率含量應(yīng)該在80%以上，如果檢測(cè)方法復(fù)雜可以低至70%。

（2）與其他方法所得的結(jié)果進(jìn)行比較?？梢圆捎胻檢驗(yàn)（應(yīng)用t檢驗(yàn)時(shí)，要求被檢驗(yàn)的2組數(shù)據(jù)具有相同或者相近的方差）或F檢驗(yàn)法進(jìn)行檢驗(yàn)和判斷方法的顯著性問題。但是應(yīng)該注意進(jìn)行t檢驗(yàn)之前必須先進(jìn)行F檢驗(yàn)。

（3）實(shí)驗(yàn)室間比對(duì)。利用實(shí)驗(yàn)室間比對(duì)進(jìn)行方法確認(rèn)，即在同樣條件下利用相同方法進(jìn)行重復(fù)性檢測(cè)和改變測(cè)試條件時(shí)利用不同方法進(jìn)行復(fù)現(xiàn)性檢測(cè)，得出重復(fù)性限r(nóng)和復(fù)現(xiàn)性限R。

（4）對(duì)影響結(jié)果的因素作系統(tǒng)性評(píng)審。利用對(duì)結(jié)果的因素做系統(tǒng)性評(píng)價(jià)——加強(qiáng)性檢驗(yàn)，對(duì)抵御外來影響的穩(wěn)健度或抵御來自樣品（或檢測(cè)物）集體干擾的交互靈敏度進(jìn)行方法確認(rèn)。在作系統(tǒng)性評(píng)審進(jìn)行方法確認(rèn)時(shí)可進(jìn)行配對(duì)比較，即固定一因素從而消除其他因素的影響，兩側(cè)測(cè)量結(jié)果用配對(duì)數(shù)據(jù)差值D來進(jìn)行顯著性檢驗(yàn)分析。

（5）根據(jù)對(duì)方法的理論原理和實(shí)踐經(jīng)驗(yàn)的科學(xué)理解，對(duì)所得結(jié)果不確定度進(jìn)行的評(píng)定。

3 方法驗(yàn)證和方法確認(rèn)的參數(shù)

對(duì)于化學(xué)實(shí)驗(yàn)室而言，方法驗(yàn)證的技術(shù)參數(shù)有檢出限、回收率、方法標(biāo)準(zhǔn)曲線和精密度試驗(yàn)。方法確認(rèn)的技術(shù)參數(shù)除了有檢出限、回收率、方法標(biāo)準(zhǔn)曲線和精密度試驗(yàn)外，還需要進(jìn)行方法特異性（區(qū)分同分異構(gòu)體）、抗干擾性、耐用性和測(cè)量不確定度評(píng)估[3]。實(shí)驗(yàn)室可在綜合考慮成本、風(fēng)險(xiǎn)技術(shù)可行性基礎(chǔ)上，并根據(jù)預(yù)期的用途進(jìn)行方法確認(rèn)，實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行方法確認(rèn)的內(nèi)容應(yīng)盡可能全面且完整，包括但不限于以下方法特性，方法選擇性、方法適用性、回收率、測(cè)量范圍或線性范圍、檢出限或定量限，正確度、穩(wěn)健度、靈敏度、精密度（重復(fù)性或復(fù)現(xiàn)性）、測(cè)量不確定度等。

3.1 檢出限（LOD）

當(dāng)被檢組分的濃度不是很高，且特性不是很明顯時(shí)，基于結(jié)果具有最大不確定度的期望時(shí)，通過方法檢測(cè)所能達(dá)到的最低含量叫做檢出限（LOD）。檢出限（LOD）包括方法檢出限（MDL） 和儀器檢出限（IDL），這2個(gè)概念不能相互混淆，信噪比可用來考查儀器性能但不適用于評(píng)估方法檢出限。方法檢出限是某特定分析方法在給定的置信度內(nèi)（如95%，99%或99.7%）能檢出待測(cè)樣組分的最低含量（最小濃度或者最小量）。這里說的檢出是指定性檢出，即判定樣品中存有濃度高于空白的待測(cè)物質(zhì)，檢出限是一種定性判斷依據(jù)。

（1）基于空白標(biāo)準(zhǔn)偏差評(píng)估法。當(dāng)空白樣本的標(biāo)準(zhǔn)偏差不等于0時(shí)，獨(dú)立測(cè)試樣品空白，測(cè)定不少于10次，計(jì)算檢測(cè)結(jié)果的標(biāo)準(zhǔn)偏差（S），空白+3倍標(biāo)準(zhǔn)偏差（3S） 即為方法檢出限（MDL）。當(dāng)空白樣本的標(biāo)準(zhǔn)偏差等于0時(shí)，在空白樣品中添加最低可接受的濃度（添加量不少于10次），檢測(cè)待測(cè)物的濃度，計(jì)算標(biāo)準(zhǔn)偏差（S），3倍標(biāo)準(zhǔn)偏差（3S）即為方法檢出限（MDL）。

（2）校準(zhǔn)公式適用范圍評(píng)估法。利用校準(zhǔn)方程的參數(shù)來確定檢出限，如果空白平均值+3倍標(biāo)準(zhǔn)偏差（3S），校準(zhǔn)方程的截距a為儀器對(duì)于空白的響應(yīng)，儀器響應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)偏差是校準(zhǔn)的標(biāo)準(zhǔn)誤差（Sy/x），利用校準(zhǔn)方程：yLOD=a+3Sy/x=a+bxLOD，則xLOD=3Sy/x/b（校準(zhǔn)曲線的斜率）得到檢出限。

（3） 確定檢出限的方法。在某些分光光度法中，以口出空白后與0.01吸光度對(duì)應(yīng)的濃度可為檢出限，氣相色譜分析的最小檢測(cè)量是指檢測(cè)器剛能產(chǎn)生與噪音相區(qū)別的響應(yīng)信號(hào)時(shí)進(jìn)入色譜柱的物質(zhì)的最小量，通常認(rèn)為剛能辨別的響應(yīng)信號(hào)是噪音的2倍，最小檢測(cè)濃度為最小檢測(cè)量與進(jìn)樣量體積的比。

3.2 定量限（LQD）

定量限（LQD） 是指某特定分析方法在給定置信度和允許誤差范圍內(nèi)能夠從樣品中定量檢出待測(cè)組分的最低濃度或最低量。定量限（LQD） 也成定量檢測(cè)下限或者報(bào)告限，其結(jié)果能保證一定的正確度和精密度。但是當(dāng)待測(cè)物的最低濃度或者最低量在檢出限（LOD） 和定量限（LQD） 之間時(shí)，準(zhǔn)確度就沒有保障，此時(shí)檢測(cè)結(jié)果不一定準(zhǔn)確。美國國家標(biāo)準(zhǔn)局定義10倍空白標(biāo)準(zhǔn)偏差（即10σ空）。

痕量分析準(zhǔn)則見表1。

表1 痕量分析準(zhǔn)則

3.3 線性

對(duì)于任何定量的方法，都需要確定被分析物濃度的適用范圍，因此實(shí)驗(yàn)室應(yīng)該確定檢測(cè)方法校準(zhǔn)曲線的線性范圍。在線性范圍內(nèi)信號(hào)反應(yīng)與被分析物的濃度呈線性相關(guān)，實(shí)驗(yàn)室建立標(biāo)準(zhǔn)曲線應(yīng)覆蓋不同濃度（或數(shù)量級(jí)），6個(gè)及其以上（包括空白）校準(zhǔn)點(diǎn)，以操作反應(yīng)信號(hào)為y軸，以操作濃度為x軸，制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，確定各種濃度的最大和最小的線性范圍。對(duì)于篩選方法，線性回歸方程的相關(guān)系數(shù)要不低于0.98；對(duì)于準(zhǔn)確定量的方法，線性回歸方程的相關(guān)系數(shù)要不低于0.99。相性范圍確定時(shí)應(yīng)該盡量滿足以下要求：①校準(zhǔn)用的校準(zhǔn)點(diǎn)應(yīng)該覆蓋目標(biāo)物濃度的50%～150%，如果需要做空白試驗(yàn)，則應(yīng)該覆蓋目標(biāo)物濃度的50%～150%；②校準(zhǔn)用的校準(zhǔn)點(diǎn)應(yīng)盡可能均勻分布在目標(biāo)物濃度內(nèi)，不同濃度應(yīng)該獨(dú)立配制，不能通過稀釋高濃度校準(zhǔn)點(diǎn)配制；③每個(gè)校準(zhǔn)點(diǎn)至少重復(fù)測(cè)定2次，建議3次或者更多次。

3.4 精密度

精密度是在規(guī)定條件下，獨(dú)立檢測(cè)結(jié)果間的一致程度。精密度說明檢測(cè)人員檢測(cè)結(jié)果的穩(wěn)定性。精密度的度量通常以不精密度表達(dá)，量值用檢測(cè)結(jié)果的標(biāo)準(zhǔn)差來表示，精密度越低，標(biāo)準(zhǔn)差越大。精密度與真值或者可接受的參考值無關(guān)，僅取決于隨機(jī)誤差的分布。禁用物質(zhì)在進(jìn)行精密度試驗(yàn)時(shí)，應(yīng)在LOD、2倍LOD和10倍LOD 3個(gè)水平進(jìn)行，對(duì)于已經(jīng)制定最高殘留量（MRL） 的，應(yīng)在LOD，MRL選擇合適的點(diǎn)三水平進(jìn)行，對(duì)于沒有制定最高殘留量（MRL） 的，應(yīng)在LOD、常見限量指標(biāo)選擇合適的點(diǎn)三水平進(jìn)行。每個(gè)點(diǎn)的重復(fù)測(cè)定次數(shù)不得小于6次。測(cè)試結(jié)果通過實(shí)驗(yàn)室內(nèi)變異系數(shù)表達(dá)，標(biāo)準(zhǔn)偏差（S） 可用Bessel公式計(jì)算得到（CV=標(biāo)準(zhǔn)偏差/平均值）。

3.5 重復(fù)性限或復(fù)現(xiàn)性限

重復(fù)性限（r） 是指重復(fù)性條件下由同一操作者測(cè)定2次，2次測(cè)試結(jié)果的絕對(duì)差值不超過此數(shù)的概率為95%，再現(xiàn)性限（R）是指在不同的實(shí)驗(yàn)室，由不同的操作者使用不同的設(shè)備，按相同的測(cè)試方法，對(duì)統(tǒng)一被測(cè)對(duì)象獨(dú)立進(jìn)行測(cè)試，2次測(cè)試結(jié)果的絕對(duì)差值不超過此數(shù)的概率為95%。r和R均通過實(shí)驗(yàn)室協(xié)作獲得，一般要求協(xié)作實(shí)驗(yàn)室不少于8家。

4 結(jié)語

為確保檢測(cè)數(shù)據(jù)結(jié)果準(zhǔn)確性、可靠性，方法確認(rèn)和驗(yàn)證是一項(xiàng)不容忽視的工作，結(jié)合實(shí)驗(yàn)室實(shí)際情況做好確認(rèn)和驗(yàn)證工作，以得到準(zhǔn)確的測(cè)量結(jié)果[4-5]。

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