□ 張曉蕊 范翠翠 徐長隆 王雅麗 漢臣氏（沈陽）兒童制品有限公司

益生菌是指對人、動物有益影響的活性微生物，攝入一定數(shù)量后，對宿主產(chǎn)生一種或多種特殊且經(jīng)論證確實(shí)存在的健康益處。目前益生菌的作用機(jī)制還在探索之中，但已經(jīng)有一定的共識：益生菌分泌或代謝過程中產(chǎn)生的一些化學(xué)物質(zhì)抑制殺死病原菌；益生菌占據(jù)腸道粘膜上皮有害菌結(jié)合位點(diǎn)，形成保護(hù)屏障；益生菌調(diào)節(jié)免疫應(yīng)答，防止感染等。益生菌在體內(nèi)和體外的發(fā)酵過程中，會產(chǎn)生有益的代謝產(chǎn)物，如抑菌蛋白類、多肽類、有機(jī)酸類、細(xì)菌素類等，這些產(chǎn)物對益生菌抑制有害菌增殖有其至關(guān)重要的作用。益生菌的抑菌作用在解決藥物殘留、抗藥性方面有著廣闊的應(yīng)用前景。因此本文采用牛津杯法，以金黃色葡萄球菌等8種菌作為指示菌對是漢臣氏（沈陽）兒童制品有限公司自主分離的發(fā)酵乳桿菌HCS08-020及其代謝產(chǎn)物進(jìn)行了體外抑菌活性的研究，以此收集相關(guān)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，為后續(xù)公司菌種產(chǎn)品的開發(fā)奠定基礎(chǔ)。

1 材料與試劑

1.1 菌種

益生菌：發(fā)酵乳桿菌HCS08-020，由漢臣氏（沈陽）兒童制品有限公司分離和保存。指示菌：大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、鼠傷寒沙門氏菌、志賀氏菌、白色念珠菌、牙齦卟啉單胞菌、變異鏈球菌、單增李斯特菌。

1.2 儀器與設(shè)備

恒溫培養(yǎng)箱、厭氧恒溫培養(yǎng)箱、冰箱、微量移液器及吸頭、無菌錐形瓶、無菌試管、無菌培養(yǎng)皿、 高壓滅菌鍋、涂布棒、牛津杯、恒溫水浴鍋。

1.3 培養(yǎng)基與試劑

LB培養(yǎng)基、沙堡瓊脂培養(yǎng)基、營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基、TSA + 5%脫纖維羊血、TSA-YE 培養(yǎng)基、BHI培養(yǎng)基、MRS培養(yǎng)基、無菌水、NAOH、HCL標(biāo)定液。

2 實(shí)驗(yàn)與方法

2.1 菌種發(fā)酵液濃縮

取冰箱保存的發(fā)酵乳桿菌HCS08-020凍存管1支室溫條件迅速溶化，用微量移液器取菌液以1%的接種量于MRS培養(yǎng)基中，37 ℃培養(yǎng)24 h后擴(kuò)大培養(yǎng)至100 mL，10 000 rpm離心10 min，取上清，加熱濃縮至3倍、5倍，放4 ℃?zhèn)溆谩?/p>

2.2 指示菌株活化處理

各個指示菌培養(yǎng)條件。28 ℃恒溫振蕩培養(yǎng)箱：培養(yǎng)白色念珠菌（轉(zhuǎn)速100 rpm，48 h）。30 ℃恒溫培養(yǎng)箱：培養(yǎng)牙齦卟啉單胞菌（厭氧）、乳雙歧桿菌。37 ℃恒溫培養(yǎng)箱：培養(yǎng)大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、鼠傷寒沙門氏菌、志賀氏菌、單增李斯特菌、變異鏈球菌（厭氧）。

2.3 牛津杯法抑菌實(shí)驗(yàn)

2.3.1 制備含菌平板

制備用于培養(yǎng)各指示菌的固體培養(yǎng)基平板，將培養(yǎng)至對數(shù)期的各指示菌稀釋至菌液濃度為105CFU/mL，取菌懸液100 μL均勻涂布于培養(yǎng)基上，每株指示菌涂布3個平板（為一組）。

2.3.2 添加抑菌物質(zhì)

用鑷子將無菌牛津杯豎于涂有菌液的平皿中，每皿三平行，每組平板分別加入200 μL原倍上清液、3倍濃縮和5倍濃縮上清液。

2.3.3 測量抑菌圈直徑

將平皿正置于適宜溫度的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)相應(yīng)時間，觀察抑菌圈形成情況并拍照，同時用游標(biāo)卡尺計(jì)量抑菌圈直徑。

3 結(jié)果與分析

3.1 結(jié)果

發(fā)酵乳桿菌HCS08-020抑菌結(jié)果見表1。

表1 發(fā)酵乳桿菌HCS08-020抑菌結(jié)果

3.2 分析

通過試驗(yàn)結(jié)果可以得出：發(fā)酵乳桿菌HCS08-020的代謝產(chǎn)物對大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、鼠傷寒沙門氏菌和福氏志賀氏菌有抑菌作用，且隨著發(fā)酵液濃縮倍數(shù)的遞增抑菌效果增強(qiáng)；但對單增李斯特菌、白色念珠菌、牙齦卟啉單細(xì)胞菌和變異鏈球菌未表現(xiàn)出抑制作用。

本文初步對發(fā)酵乳桿菌HCS08-0201代謝產(chǎn)物的抑菌效果進(jìn)行了評價(jià)，由結(jié)果可以看出發(fā)酵液濃縮倍數(shù)越大對人體某些常見致病菌的抑菌效果越顯著。這可能是代謝產(chǎn)物中抑菌成分被濃縮引起的，之后還需要對抑菌成分進(jìn)行提取分析，并提高該菌分泌抑菌成分的能力，以期對該菌種進(jìn)行更好的開發(fā)。