孫怡 李惠 吳頤 李健 申龍樹(shù) 王耀輝 王劍蓉 章宜芬
南京中醫(yī)藥大學(xué)附屬江蘇省中醫(yī)院1病理科/國(guó)家中醫(yī)藥管理局分子生物學(xué)三級(jí)實(shí)驗(yàn)室,2神經(jīng)外科(南京 210029)
膠質(zhì)瘤是最常見(jiàn)的顱內(nèi)惡性腫瘤,其發(fā)病率約占原發(fā)性腦腫瘤的40%~50%左右,而且呈逐年上升趨勢(shì)[1-2]。近年來(lái),分子標(biāo)記物檢測(cè)作為補(bǔ)充診斷依據(jù)、預(yù)測(cè)預(yù)后疾病的手段,極大推進(jìn)了原有的單純組織學(xué)分類。異檸檬酸脫氫酶1(isocitrate dehydrogenase 1,IDH1)、異檸檬酸脫氫酶 2(isocitrate dehydrogenase 2,IDH2)基因是膠質(zhì)瘤研究的熱點(diǎn),已有大量研究表明,該基因突變是膠質(zhì)瘤的一個(gè)獨(dú)特類型。國(guó)外研究報(bào)道IDH1突變好發(fā)于年輕膠質(zhì)瘤患者,早于p53基因突變的發(fā)生,是膠質(zhì)瘤發(fā)生發(fā)展中的早期分子事件,IDH1突變的患者預(yù)后相對(duì)較好;國(guó)內(nèi)研究報(bào)道IDH在少突膠質(zhì)細(xì)胞腫瘤和混合性膠質(zhì)瘤中突變較高,這均表明IDH基因可能成為新的治療靶點(diǎn)。傳統(tǒng)病理分型中的該基因型特征研究較少,本研究通過(guò)研究傳統(tǒng)病理分型中該基因的特征及分布規(guī)律,為膠質(zhì)瘤分子病理學(xué)分類提供新的依據(jù),也為臨床治療和新藥開(kāi)發(fā)提供新的靶點(diǎn)。
1.1 一般資料 收集2013年1月至2016年12月我院手術(shù)切除、臨床資料完整腦膠質(zhì)瘤樣本46例。其中男25例,女21例,年齡12~73歲,中位年齡50.0歲。根據(jù)2007年WHO中樞神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行組織學(xué)分類分級(jí),兩位高年資病理醫(yī)師復(fù)診,共有Ⅰ級(jí)1例,Ⅱ級(jí)10例,Ⅲ級(jí)12例,Ⅳ級(jí)23例。以5例同期手術(shù)的腦膜瘤樣本作為陰性對(duì)照。
1.2 方法
1.2.1 IDH1、IDH2基因,p53基因突變檢測(cè) 根據(jù)HE染色切片確認(rèn)膠質(zhì)瘤腫瘤區(qū)域并刮取相應(yīng)白片腫瘤組織,按操作手冊(cè)(Qiagen GeneRead DNA FFPE kit,德國(guó))提取DNA。PCR擴(kuò)增后凝膠電泳觀察產(chǎn)物是否為目的條帶,利用Bigdye Terminator(v3.1)進(jìn)行測(cè)序反應(yīng),產(chǎn)物上ABI 3500型基因分析儀(ABI公司,美國(guó))正反向測(cè)序,測(cè)序結(jié)果用Seqscape軟件與標(biāo)準(zhǔn)序列進(jìn)行比對(duì),檢測(cè)分析IDH1基因R132位點(diǎn)、IDH2基因R172位點(diǎn)以及p53基因第5~8外顯子突變狀態(tài),具體引物序列如下:IDH1上游:5′-TGTGGAAATCACCAAATGGCAC-3′;IDH1 下 游 :5′-ACATACAAGTTGGAAATTTCTGGGC-3′;IDH2 上游:5′-TCCCAATGGAACTATCCGGAAC-3′;IDH2 下 游 :5′-GACAAGAGGATGGCTAGGCG-3′;p53-exon5-6上游:5′-TACTCCCCTGCCCTCAACAAGA-3′;p53-exon5-6下游:5′-CAAATAAGCAGCAGGAGAAAGC-3′;p53-exon7上游:5′-TTGCCACAGGTCTCCCCAAG-3′;p53-exon7 下游:5′-GTCCCAAAGCCAGAGAAAAG-3′;p53-exon8上游:5′-AGGACAAGGGTGGTTGGGAG-3′;p53-exon8 下 游 :5′-TGGGCAGTGCTAGGAAAGAG-3′。
1.2.2 Ki-67蛋白表達(dá)檢測(cè) 鼠抗人Ki-67蛋白一抗、試劑盒及顯色液購(gòu)自福州邁新生物技術(shù)開(kāi)發(fā)有限公司,免疫組化染色采用SP法。樣本常規(guī)福爾馬林固定、石蠟包埋,切3 μm薄片,脫蠟水化,在微波爐中用檸檬酸鈉抗原修復(fù)液中100℃抗原修復(fù)15 min,PBS沖洗后用雙氧水阻斷15 min,沖洗后用羊血清室溫下阻斷40 min,加入一抗,4℃冰箱過(guò)夜,PBS沖洗后,加入二抗,37℃,40 min,PBS沖洗后,DAB顯色。結(jié)果判讀:由我院病理科醫(yī)師對(duì)免疫組織化學(xué)染色進(jìn)行評(píng)價(jià),參照《邁新免疫和分子病理學(xué)產(chǎn)品目錄》抗體表達(dá)特定,以細(xì)胞核中出現(xiàn)淺黃色至棕褐色信號(hào)為陽(yáng)性細(xì)胞,選取腫瘤細(xì)胞豐富、陽(yáng)性細(xì)胞較多的熱點(diǎn)區(qū)域,計(jì)數(shù)5個(gè)高倍鏡視野,計(jì)算視野內(nèi)腫瘤細(xì)胞中陽(yáng)性細(xì)胞平均占比(%),參考文獻(xiàn)[3]報(bào)道以≤30%判為低表達(dá),>30%判為高表達(dá)。
1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 所有計(jì)數(shù)資料表示為多個(gè)樣本率(構(gòu)成比),應(yīng)用SPSS 24.0軟件,采用χ2或Fisher精確概率法檢驗(yàn)IDH1突變與臨床特征(性別、年齡、腫瘤位置、腫瘤最大徑、WHO分級(jí)等)以及分子標(biāo)志物Ki-67表達(dá)的差異性分析,以P<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
2.1 膠質(zhì)瘤樣本W(wǎng)HO分類分級(jí) 包括胚胎發(fā)育不良性神經(jīng)上皮腫瘤(WHOⅠ級(jí))1例,星形細(xì)胞瘤(WHOⅡ級(jí))5例,少突膠質(zhì)細(xì)胞瘤(WHOⅡ級(jí))4例,少突星形細(xì)胞瘤(WHOⅡ級(jí))1例,間變型星形細(xì)胞瘤(WHOⅢ級(jí))7例,間變型少突膠質(zhì)細(xì)胞瘤(WHOⅢ級(jí))3例,間變型少突星形細(xì)胞瘤(WHOⅢ級(jí))2例,膠質(zhì)母細(xì)胞瘤(WHOⅣ級(jí))23例(其中3例為繼發(fā))。發(fā)生部位:額葉19例,其他部位27例。見(jiàn)圖1。
2.2 IDH1、IDH2突變檢測(cè)結(jié)果 檢測(cè)發(fā)現(xiàn)32.6%(15/46)的樣本發(fā)生IDH1基因突變,均位于第132位密碼子(c.G395A,p.R132H),見(jiàn)圖2,未發(fā)現(xiàn)IDH1基因其他突變類型和IDH2基因突變。IDH1基因突變與各項(xiàng)臨床病理特征間的關(guān)系見(jiàn)表1。統(tǒng)計(jì)顯示,較低年齡(P=0.028)、腫瘤位置發(fā)生于額葉(P=0.002)、WHOⅡ-Ⅳ級(jí)組織學(xué)分級(jí)(P=0.047)、Ki-67蛋白低表達(dá)(r=-0.313,P=0.034)均與IDH1基因突變顯著相關(guān)。而患者性別、腫瘤最大徑與IDH1基因是否突變無(wú)顯著性相關(guān)。突變型樣本中男10例,女5例,年齡12~62歲,中位年齡47.0歲;31例野生型樣本中男15例,女16例,年齡14~73歲,中位年齡53.0歲。不同WHO級(jí)別膠質(zhì)瘤之間IDH1基因突變陽(yáng)性率分別為:Ⅱ級(jí) 60%(6/10),Ⅲ級(jí) 41.7%(5/12),Ⅳ級(jí)17.4%(4/23,其中3例為繼發(fā)),突變率從低級(jí)別膠質(zhì)瘤到高級(jí)別膠質(zhì)瘤呈下降趨勢(shì),差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。73.3%(11/15)突變位于額葉。
2.3 p53基因突變檢測(cè)結(jié)果 檢測(cè)第5、6、7、8外顯子突變情況,發(fā)現(xiàn)4例標(biāo)本發(fā)生突變,突變位點(diǎn)主要位于第7、8外顯子,均診斷為膠質(zhì)母細(xì)胞瘤(WHOⅣ級(jí),25%),并伴IDH1野生型。見(jiàn)圖3。
2.4 Ki-67陽(yáng)性表達(dá)情況 Ki-67陽(yáng)性染色定位于細(xì)胞核,呈棕黃色顆粒狀。在46例膠質(zhì)瘤組織中,均有發(fā)現(xiàn)腫瘤細(xì)胞陽(yáng)性表達(dá),其中低表達(dá)65.2%(30/46),高表達(dá)34.8%(16/46)。不同級(jí)別膠質(zhì)瘤中Ki-67表達(dá)見(jiàn)表2,WHOⅡ~Ⅳ級(jí)膠質(zhì)瘤表達(dá)明顯升高,Ki-67表達(dá)與WHO分級(jí)成顯著線性正相關(guān)(r=0.700,P< 0.001)。
圖1 不同級(jí)別膠質(zhì)瘤HE染色圖(×100)Fig.1 HE staining of different levels of gliomas(×100)
圖2 IDH1基因395位堿基G/A雜合突變Fig.2 Heterozygous 395G/A IDH1 mutation
表1 納入本研究患者臨床病理特征以及IDH1-R132H突變分布情況Tab.1 The relationship between IDH1-R132H mutation and clinical pathology
神經(jīng)膠質(zhì)瘤在神經(jīng)上皮性腫瘤中占60%,是顱內(nèi)最常見(jiàn)的腫瘤。不同級(jí)別膠質(zhì)瘤有不同發(fā)生機(jī)制,預(yù)后差別大。尋找相關(guān)的分子生物學(xué)標(biāo)記有重要意義。2006年美國(guó)癌癥基因組圖譜計(jì)劃對(duì)206例膠質(zhì)母細(xì)胞瘤行高通量基因組學(xué)分析,發(fā)現(xiàn)IDH1或IDH2突變腫瘤生存期更長(zhǎng)[4-5]。2008年P(guān)ARSONS等[6]發(fā)現(xiàn) 12%的樣本發(fā)生 IDH1基因R132H突變;另有研究[7]發(fā)現(xiàn)IDH2同工酶基因R172位點(diǎn)也是膠質(zhì)瘤突變熱點(diǎn)。
圖3 p53基因突變圖Fig.3 Mutations in p53 gene
表2 Ki-67在WHOⅡ~Ⅳ級(jí)別膠質(zhì)瘤中的表達(dá)Tab.2 Ki-67 expression in WHOⅡ~Ⅳgliomas 例(%)
IDHl基因突變只在膠質(zhì)瘤的某些特定亞型中發(fā)生,其陽(yáng)性突變患者年齡更低,主要發(fā)生在彌漫性星形細(xì)胞瘤、少膠質(zhì)細(xì)胞瘤等(WHOⅡ級(jí))和繼發(fā)性膠質(zhì)母細(xì)胞瘤(WHOⅣ級(jí))[7-8],提示這幾種腫瘤可能具有相同的起源途徑,有助于膠質(zhì)瘤的診斷分型和鑒別診斷。在各級(jí)別膠質(zhì)瘤中,相對(duì)于IDH野生型,IDH基因突變的患者預(yù)后較好[9],IDH突變狀態(tài)可以輔助診斷腦膠質(zhì)瘤。本研究檢出32.6%的樣本發(fā)生IDH1-R132H突變,發(fā)生于WHOⅡ~Ⅲ級(jí)的膠質(zhì)瘤,3例繼發(fā)性膠質(zhì)母細(xì)胞瘤均發(fā)生突變,原發(fā)性膠質(zhì)母細(xì)胞瘤無(wú)一檢出。較低年齡、腫瘤位置發(fā)生于額葉、WHOⅡ~Ⅳ級(jí)組織學(xué)分級(jí)、Ki-67蛋白低表達(dá)均與IDH1基因突變顯著相關(guān)。IDH1突變陽(yáng)性率從低級(jí)別(WHOⅡ級(jí))到高級(jí)別(WHOⅣ級(jí))顯著下降,提示膠質(zhì)瘤患者的預(yù)后與IDH1基因突變存在密切聯(lián)系。IDH1突變與膠質(zhì)瘤病理分級(jí)、惡性程度及預(yù)后密切相關(guān),在疾病發(fā)生初始階段檢測(cè)IDH1基因突變狀態(tài),輔助病理醫(yī)師診斷分級(jí),協(xié)助臨床醫(yī)師制定合理治療方案,從而提高膠質(zhì)瘤治愈率。
WHO(2016)中樞神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤分類首次將分子檢測(cè)納入腦腫瘤診斷標(biāo)準(zhǔn),所有組織學(xué)級(jí)別均應(yīng)首先檢測(cè)IDH突變狀態(tài),以及1p/19q、ATPX、p53等基因變異情況。p53基因是一種抑癌基因[10],80%~90%的腫瘤p53基因突變發(fā)生在中間區(qū)域(95-288密碼子)[11]。原發(fā)性膠質(zhì)母細(xì)胞瘤p53陽(yáng)性率高于其他類型膠質(zhì)瘤,并與IDH1突變無(wú)相關(guān)性。本研究發(fā)現(xiàn)4例樣本p53基因突變,突變位點(diǎn)位于第7、8外顯子,均為膠質(zhì)母細(xì)胞瘤樣本伴IDH1野生型,或與腫瘤高度惡性相關(guān),根據(jù)其分子分型(IDH1/2野生型,p53突變型)預(yù)后最差[9]。目前p53基因突變主要檢測(cè)方法是用突變型p53抗體免疫組化檢測(cè),但p53免疫組化陽(yáng)性與p53基因突變二者之間的關(guān)系尚存爭(zhēng)議[11],不能完全用p53突變型免疫組化抗體陽(yáng)性取代p53基因突變檢測(cè)。與國(guó)外報(bào)道相比[12],本研究突變率偏低,或與中國(guó)人p53突變熱點(diǎn)差異性和入組樣本病理學(xué)分級(jí)有關(guān)。
Ki-67與細(xì)胞周期密切相關(guān),能直接反映細(xì)胞增殖情況,與腫瘤進(jìn)展、轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。Ki-67在正常腦組織中不表達(dá),在膠質(zhì)瘤細(xì)胞中異常高表達(dá),Ki-67陽(yáng)性標(biāo)記指數(shù)越高,則惡性程度(分級(jí))越高,預(yù)后越差[13]。本研究結(jié)果顯示Ki-67蛋白表達(dá)水平隨膠質(zhì)瘤病理分級(jí)的增高而顯著增高,高級(jí)別膠質(zhì)瘤表達(dá)水平明顯高于低級(jí)別膠質(zhì)瘤,Ki-67表達(dá)與WHO分級(jí)成顯著線性正相關(guān),提示Ki-67過(guò)表達(dá)可能是膠質(zhì)瘤形成過(guò)程中的晚期事件,隨腫瘤惡性程度升高而表達(dá)增高,反映較差預(yù)后。而本研究顯示Ki-67蛋白低表達(dá)與IDH1基因突變顯著相關(guān),與文獻(xiàn)[14]報(bào)道相似,均可作為膠質(zhì)瘤預(yù)后評(píng)估的指標(biāo)[15]。
綜上,本研究通過(guò)檢測(cè)膠質(zhì)瘤IDH1、IDH2基因、p53基因突變狀態(tài),檢測(cè)Ki-67表達(dá)水平,發(fā)現(xiàn)在各種類型中,中高級(jí)別(WHOⅡ/Ⅲ級(jí))膠質(zhì)瘤IDH1基因突變比率最高,提示該類型有特殊性,臨床需要高度關(guān)注,應(yīng)盡量對(duì)該類型進(jìn)行基因檢測(cè);p53基因突變主要發(fā)生于膠質(zhì)母細(xì)胞瘤中。IDH1基因突變、Ki-67表達(dá)水平與膠質(zhì)瘤額惡性程度密切相關(guān),IDH1、p53、Ki-67聯(lián)合檢測(cè)有利于膠質(zhì)瘤的診斷分級(jí)和預(yù)后評(píng)估,具有一定的臨床價(jià)值。IDH1基因突變與Ki-67表達(dá)在膠質(zhì)瘤的發(fā)展中是否存在內(nèi)在聯(lián)系以及相關(guān)臨床意義,尚需進(jìn)一步研究。
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