高 媛，孫 旭，劉云云，馬曉昱，程艷芹，陳 瑤

白癜風(fēng)是一種常見的后天性局限性或泛發(fā)性皮膚色素脫失病，由于皮膚的黑素細(xì)胞功能消失引起，機(jī)制尚不清楚。海軍官兵急性和長期暴露于太陽光，陽光中超強(qiáng)的紫外線所致光毒性反應(yīng)、光變態(tài)反應(yīng)，皮膚中產(chǎn)生大量的自由基，如單線態(tài)氧、過氧化氫和氮等，使黑色素細(xì)胞受損或轉(zhuǎn)運(yùn)發(fā)生障礙，可致白癜風(fēng)的發(fā)生率增高。藥物治療有激素類、免疫調(diào)節(jié)劑、大劑量維生素等，但效果多不佳?？税佐墙夥跑姷?01醫(yī)院研制，以補(bǔ)骨脂為主藥，紅花、荊芥、鹽酸異丙嗪等組成的復(fù)方制劑，具有溫經(jīng)活血，軟堅透絡(luò)的作用，用于治療白癜風(fēng)并取得良好的治療效果。為了進(jìn)一步完善該品種的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，該研究建立HPLC測定克白酊中補(bǔ)骨脂素、異補(bǔ)骨脂素［1］和鹽酸異丙嗪［2］含量的方法，操作簡單，結(jié)果準(zhǔn)確，重現(xiàn)性好，能有效控制該制劑質(zhì)量。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 ZF-6型三用紫外分析儀；METTLER AE240電子天平；島津LC-20AT高效液相色譜儀；AS-B超聲波清洗儀；HG-B電熱恒溫干燥箱。

1.2 試藥 甲醇為色譜純；對照品補(bǔ)骨脂素（批號110739-201115，中國食品藥品檢定所，純度：99．3%）、異補(bǔ)骨脂素（批號110738-201313，中國食品藥品檢定所，純度：100．0%）、鹽酸異丙嗪（批號 100422-201002，中國食品藥品檢定所，純度：99．4%）；克白酊（批號 20140910、20140911、20140912）。

2 方法與結(jié)果

2.1 補(bǔ)骨脂素和異補(bǔ)骨脂素的含量測定［1，3］

2.1.1 色譜條件及系統(tǒng)適用性試驗 以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑；以甲醇-水（52∶48）為流動相；檢測波長為246 nm，柱溫為25℃；流速1.0 ml/min；補(bǔ)骨脂素峰保留時間為5.926 min，分離度為1.749，理論板數(shù)為3026；異補(bǔ)骨脂素峰保留時間為7.965 min，分離度為2.043，理論板數(shù)為3595。陰性對照、對照品以及供試品的HPLC色譜圖見圖1A，1B，1C和 1D。

圖1 陰性對照、對照品以及供試品的HPLC色譜圖

2.1.2 對照品溶液的制備 分別取補(bǔ)骨脂素和異補(bǔ)骨脂素對照品適量，精密稱定，加甲醇制成每1 ml含補(bǔ)骨脂素1.819 mg的對照品溶液和每1 ml含異補(bǔ)骨脂素1.704 mg的對照品溶液（對照品儲備液），精密量取適量于容量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，濾過，即得40 μg/ml的對照品溶液。

2.1.3 供試品溶液的制備 精密量取克白酊20 ml，蒸干，殘渣加入甲醇50 ml，稱定重量，超聲處理30 min，放冷，再稱定重量，用甲醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液25 ml置于50 ml量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，搖勻，即得。

2.1.4 陰性對照品溶液的制備 取缺補(bǔ)骨脂的樣品，按“2.1.3”項下方法制備成陰性對照品溶液。

2.1.5 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 分別取“2.1.2”項下補(bǔ)骨脂素、異補(bǔ)骨脂素對照品儲備液適量，以甲醇為溶劑稀釋，得系列標(biāo)準(zhǔn)溶液。含補(bǔ)骨脂素和異補(bǔ)骨脂素為 10、20、40、80、100 μg/ml，分別取 20 μl注入液相色譜儀，記錄色譜圖。以峰面積值為縱坐標(biāo)（Y），濃度（μg/ml）為橫坐標(biāo)（X）繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。計算得補(bǔ)骨脂素回歸方程：Y=16525X+29868，R2=0.9999；異補(bǔ)骨脂素回歸方程：Y=15873X+44765，R2=1，實驗表明補(bǔ)骨脂素和異補(bǔ)骨脂素在10～100 μg/ml的范圍內(nèi)與峰面積呈良好線性關(guān)系。

2.1.6 精密度試驗 分別精密吸取 “2.1.5”項下40 μg/ml補(bǔ)骨脂素和異補(bǔ)骨脂素對照品溶液20 μl，按“2.1.1”項下色譜條件重復(fù)進(jìn)樣6次，記錄峰面積值，計算RSD分別為0.13%和0.10%。說明儀器的精密度良好。

2.1.7 重現(xiàn)性試驗 取克白酊（批號20140912），按“2.1.3”項下方法分別制備6份供試品溶液，分別進(jìn)樣20 μl，記錄補(bǔ)骨脂素和異補(bǔ)骨脂素峰面積值，計算RSD（n=6）分別為0.80%和1.76%，表明方法重復(fù)性良好。

2.1.8 穩(wěn)定性試驗 取克白酊（批號20140912），按“2.1.3”項下方法配制供試品溶液，分別于0，2，4，6，8，12 h 進(jìn)樣 20 μl，按“2.1.1”項下色譜條件，測定補(bǔ)骨脂素、異補(bǔ)骨脂素的峰面積，計算RSD分別為2.11%和2.40%，表明供試品溶液在12 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.1.9 加樣回收率試驗 取已知含量的克白酊樣品（批號20140912）12份，在線性范周內(nèi)分別加入一定量的補(bǔ)骨脂素、異補(bǔ)骨脂素對照品溶液各6份，按“2.1.1”項下色譜條件測定，結(jié)果詳見表1、表2。說明本方法回收率良好。

2.1.10 樣品含量測定 按“2.1.1”項下色譜條件，分別精密吸取“2.1.2”“2.1.3”項下溶液各 20 μl，按照 2015 年版《中國藥典》四部 0512［3］），進(jìn)樣 3 批克白酊樣品（批號 20140910、20140911、20140912），每批樣品測定3份，以外標(biāo)法計算各個樣品中補(bǔ)骨脂素和異補(bǔ)骨脂素的含量，結(jié)果詳見表3。

2.2 鹽酸異丙嗪的含量測定［2，3］

2.2.1 色譜條件及系統(tǒng)適用性試驗 以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑；以甲醇-水（用冰醋酸調(diào)節(jié)pH 至 2.3）（45∶55）為流動相；檢測波長為 254 nm，柱溫為25℃；流速1．0 ml/min；鹽酸異丙嗪峰保留時間為 9．918 min， 分離度為 1．544， 理論板數(shù)為2223。陰性對照、對照品以及供試品的HPLC色譜圖見2A，2B和2C。

表1 補(bǔ)骨脂素加樣回收率試驗測定結(jié)果

表2 異補(bǔ)骨脂素加樣回收率試驗測定結(jié)果

表3 克白酊樣品中補(bǔ)骨脂素和異補(bǔ)骨脂素含量（mg/100 ml）測定結(jié)果（n=2）

圖2 陰性對照、對照品以及供試品的HPLC色譜圖

2.2.2 對照品溶液的制備 取鹽酸異丙嗪對照品適量，精密稱定，加0．1 mol/L鹽酸溶液制成每1 ml含鹽酸異丙嗪1．056 mg（對照品儲備液），精密量取適量于容量瓶中，加0．1 mol/L鹽酸溶液至刻度，搖勻，即得20 μg/ml的對照品溶液。

2.2.3 供試品溶液的制備 精密量取克白酊40 ml，蒸干，殘渣加入0．1 mol/L鹽酸溶液50 ml，稱定重量，超聲處理 30 min，放冷，再稱定重量，用 0．1 mol/L鹽酸補(bǔ)足減失的重量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液10 ml置100 ml量瓶中，用0．1 mol/L鹽酸稀釋至刻度，搖勻，即得。

2.2.4 陰性對照品溶液的制備 取缺制鹽酸異丙嗪的樣品，按“2．2．3”項下方法制備成陰性對照品溶液。

2.2.5 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 取“2．2．2”項下鹽酸異丙嗪對照品儲備液適量，以0．1 mol/L鹽酸為溶劑稀釋，得系列標(biāo)準(zhǔn)溶液。含鹽酸異丙嗪為10、20、40、60、80 μg/ml，分別取 20 μl注入液相色譜儀，記錄色譜圖。 以峰面積值為縱坐標(biāo)（Y），濃度（μg/ml）為橫坐標(biāo) （X）繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。計算得回歸方程，Y=94716X-13730，R2=0．9994。 實驗表明鹽酸異丙嗪在10～80 μg/ml的范圍內(nèi)與峰面積呈良好線性關(guān)系。

2.2.6 精密度試驗 精密吸取“2．2．5”項下 20μg/ml鹽酸異丙嗪對照品溶液 20 μl，按“2．2．1”項下色譜條件重復(fù)進(jìn)樣6次，記錄峰面積值，計算RSD為1．04%。說明儀器的精密度良好。

2.2.7 重現(xiàn)性試驗 取克白酊（批號20140912），按“2．2．3”項下方法分別制備 6 份供試品溶液，分別進(jìn)樣20 μl，記錄鹽酸異丙嗪峰面積值，計算 RSD（n=6）為 1．52%，表明方法重復(fù)性良好。

2.2.8 穩(wěn)定性試驗 取克白酊（批號20140912），按“2．2．3”項下方法配制供試品溶液，分別于 0，2，4，6，8，12 h 進(jìn)樣 20 μl，按“2．2．1”項下色譜條件，測定鹽酸異丙嗪的峰面積，計算RSD為2．82%，表明供試品溶液在12 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.2.9 加樣回收率試驗 取已知含量的克白酊樣品（批號20140912）6份，在線性范周內(nèi)分別加入一定量的鹽酸異丙嗪對照品溶液，按“2．2．1”項下色譜條件測定，結(jié)果詳見表4?；厥章柿己?。

表4 鹽酸異丙嗪加樣回收率試驗測定結(jié)果

2.2.10 樣品含量測定 按“2．2．1”項下色譜條件，分別精密吸取 “2．2．2”“2．2．3” 項下溶液各 20μl，照2015 年版《中國藥典》四部 0512［3］），進(jìn)樣 3 批克白酊樣品（批號 20140910、20140911、20140912），每批樣品測定3份，以外標(biāo)法計算各個樣品中鹽酸異丙嗪的含量，結(jié)果詳見表5。

表5 克白酊樣品中鹽酸異丙嗪含量（mg/100 ml）測定結(jié)果（n=2）

3 討論

克白酊是由補(bǔ)骨脂為主藥，紅花、荊芥和鹽酸異丙嗪等組成的復(fù)方制劑，《中國藥典》記載其外用可以消風(fēng)祛斑。該制劑在中藥之中添加了少量化學(xué)藥鹽酸異丙嗪，鹽酸異丙嗪為H1受體拮抗藥，具有抗過敏和鎮(zhèn)靜作用。因此，筆者采用HPLC法對方中補(bǔ)骨脂主要活性成分補(bǔ)骨脂素和異補(bǔ)骨脂素［1，3-5］以及鹽酸異丙嗪［2，3，6，7］的含量進(jìn)行測定。補(bǔ)骨脂素和異補(bǔ)骨脂素在246 nm波長有最大吸收，因此該波長作為其檢測波長；用流動相稀釋鹽酸異丙嗪后進(jìn)行紫外掃描，其最大吸收在254 nm，故選擇254 nm為鹽酸異丙嗪含量測定的檢測波長。實驗表明，在分別設(shè)定的色譜條件下，克白酊中的補(bǔ)骨脂素、異補(bǔ)骨脂素和鹽酸異丙嗪與相鄰色譜峰能有效分離，樣品含量穩(wěn)定。

該方法操作簡單，專屬性強(qiáng)，重現(xiàn)性較好，結(jié)果準(zhǔn)確等優(yōu)點，可作為克白酊的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，控制本品的質(zhì)量。

參考文獻(xiàn)

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