徐曉明

摘 要：隨著經(jīng)濟(jì)的快速發(fā)展，化妝品行業(yè)也迎來了發(fā)展高峰期。目前化妝品的種類繁多，其品質(zhì)也是參差不齊，但是都在一定程度上對(duì)皮膚有一定的刺激性。本文綜述了目前法規(guī)認(rèn)可的國(guó)內(nèi)外化妝品刺激性評(píng)價(jià)的體內(nèi)和體外替代方法，重點(diǎn)從原理、方法、應(yīng)用等方面介紹了眼睛、皮膚刺激、腐蝕性評(píng)價(jià)體外替代方法，共包括9種眼刺激、腐蝕性、3種皮膚腐蝕性、1種皮膚刺激性評(píng)價(jià)方法。最后提出體外替代方法雖然有待進(jìn)一步成熟，但已經(jīng)成為全球發(fā)展趨勢(shì)，而我國(guó)應(yīng)結(jié)合國(guó)情積極建立相應(yīng)的體外替代方法。

關(guān)鍵詞：化妝品；刺激性評(píng)價(jià)；方法；研究

1前言

刺激性物質(zhì)作用于機(jī)體后可能引發(fā)機(jī)體產(chǎn)生刺激、過敏等一系列的生理、生化反應(yīng)，其中最主要的是刺激反應(yīng)，可導(dǎo)致水腫、紅斑、瘙癢、疼痛等癥狀。包括歐美國(guó)家在內(nèi)的多國(guó)化妝品法規(guī)均明確規(guī)定了化妝品原料和產(chǎn)品應(yīng)進(jìn)行相應(yīng)的眼睛、皮膚的刺激性安全評(píng)價(jià)。我國(guó)《化妝品安全技術(shù)規(guī)范》（2015版）中“毒理學(xué)試驗(yàn)方法”規(guī)定，化妝品新原料需進(jìn)行皮膚和急性眼刺激性、腐蝕性試驗(yàn)，同時(shí)化妝品產(chǎn)品在投放市場(chǎng)前，對(duì)于每天使用的化妝品需進(jìn)行多次皮膚刺激性試驗(yàn)；對(duì)于間隔1日或數(shù)日使用或使用后沖洗的化妝品需進(jìn)行急性皮膚刺激性試驗(yàn)；使用時(shí)可能與眼睛接觸的產(chǎn)品需進(jìn)行急性眼刺激試驗(yàn)。長(zhǎng)期以來，皮膚、眼睛刺激性試驗(yàn)主要依賴動(dòng)物試驗(yàn)，Draize兔眼試驗(yàn)是測(cè)定急性眼刺激的國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)方法，Draize試驗(yàn)也是國(guó)際公認(rèn)的動(dòng)物皮膚刺激性試驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)。

近年來，以歐盟為首的全球眾多國(guó)家和地區(qū)紛紛呼吁禁止在化妝品安全評(píng)價(jià)中使用動(dòng)物試驗(yàn)：歐盟2004年開始禁止化妝品成品動(dòng)物試驗(yàn)和禁止銷售經(jīng)過動(dòng)物試驗(yàn)的化妝品成品，2013年3月全面禁止化妝品動(dòng)物試驗(yàn)并禁止銷售經(jīng)過動(dòng)物試驗(yàn)的化妝品；新西蘭自2015年5月起禁止在化妝品及成分研究、制造、測(cè)試和教學(xué)中使用動(dòng)物試驗(yàn)；印度自2014年11月起禁止進(jìn)口經(jīng)過動(dòng)物試驗(yàn)的化妝品等。禁止動(dòng)物試驗(yàn)在化妝品安全性評(píng)價(jià)中的使用已成為全球趨勢(shì)，推動(dòng)了替代動(dòng)物試驗(yàn)的體外評(píng)價(jià)方法的開發(fā)和應(yīng)用。

2眼刺激評(píng)價(jià)

在某些情況下，眼睛可能成為化妝品及其成分作用的靶器官或吸收途徑，從而引起眼刺激、腐蝕，故眼刺激、腐蝕性的評(píng)價(jià)是化妝品及其成分安全性評(píng)價(jià)的必要內(nèi)容。目前，常用的方法有體內(nèi)和體外替代法，體內(nèi)方法已使用多年，近幾十年對(duì)體外替代方法進(jìn)行了大量的研究與驗(yàn)證。

2.1體內(nèi)試驗(yàn)方法

兔眼試驗(yàn)在2008年前是測(cè)定急性眼刺激的國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)方法，目前仍是我國(guó)化妝品法規(guī)中規(guī)定的眼刺激性、腐蝕性評(píng)價(jià)的標(biāo)準(zhǔn)。雖然長(zhǎng)期以來，兔眼試驗(yàn)被認(rèn)為是評(píng)估眼刺激性、腐蝕性的唯一標(biāo)準(zhǔn)方法，但該方法試驗(yàn)周期長(zhǎng)、成本高，且動(dòng)物試驗(yàn)結(jié)果與人體仍有一定的差異性，其科學(xué)性及合理性有待進(jìn)一步驗(yàn)證。

2.2體外試驗(yàn)方法

至今，已有多種動(dòng)物替代試驗(yàn)的體外方法被開發(fā)和應(yīng)用。其中已有5種方法得到了OECD的認(rèn)可，2種經(jīng)過了ECVAM的驗(yàn)證。

2.2.1牛角膜渾濁和滲透性試驗(yàn)

BCOP法利用離體牛眼角膜，將受試物直接與牛角膜接觸，刺激物可導(dǎo)致角膜上皮屏障功能破損和基質(zhì)蛋白變性，將牛角膜的渾濁度和滲透性作為毒理學(xué)的評(píng)價(jià)指標(biāo)，根據(jù)公式計(jì)算與兩個(gè)指標(biāo)數(shù)值相關(guān)的體外刺激分?jǐn)?shù)（InVitroIrritancyScore，IVIS），通過評(píng)分進(jìn)行分類：若IVIS>55，則受試物具有嚴(yán)重眼刺激性，不需要其他方法驗(yàn)證；IVIS≤3，則無刺激性；若3

2.2.2離體雞眼試驗(yàn)

ICE法利用短期離體培養(yǎng)的雞眼球進(jìn)行眼刺激檢測(cè)。取雞眼球固定于夾持器，暴露受試物，通過肉眼檢查、測(cè)量角膜厚度、表面灌流和熒光素滲透評(píng)價(jià)角膜損傷程度，將角膜膨脹度、角膜渾濁度和熒光素滯留度的數(shù)值作為毒理學(xué)終點(diǎn)，根據(jù)終點(diǎn)數(shù)值分別對(duì)三個(gè)評(píng)價(jià)維度進(jìn)行ICE分類，包括I、II、III、IV，最后通過三個(gè)評(píng)價(jià)指標(biāo)的終點(diǎn)組合分析：（1）若終點(diǎn)組合為3×I、2×I和I×II，則無刺激性；（2）若終點(diǎn)組合為3×IV、2×IV和I×II、2×IV和1×II、2×IV和IV×I、30min時(shí)角膜渾濁度≥3（至少兩只眼球）、任何時(shí)間點(diǎn)角膜渾濁度=4（至少2只眼球）、上皮嚴(yán)重松弛（至少1只眼球），則有嚴(yán)重眼損傷和眼腐蝕；（3）若為其他情況，則無法判斷。ICE法可用于鑒別化學(xué)物的眼腐蝕和嚴(yán)重眼損傷或無刺激性，但無法區(qū)分嚴(yán)重眼刺激、眼損傷。該方法適用于固體、液體、乳劑、凝膠狀化合物。

2.2.3熒光素漏出試驗(yàn)

FL法是一項(xiàng)基于細(xì)胞毒性和細(xì)胞屏障功能的眼刺激替代試驗(yàn)。將受試物暴露后，以導(dǎo)致培養(yǎng)的單、多層細(xì)胞20%熒光素漏出的受試物的濃度FL20（mg/ml）作為評(píng)價(jià)指標(biāo)，若FL20≤100mg/ml，即可確定受試物可導(dǎo)致眼腐蝕性和嚴(yán)重刺激性。FL法在國(guó)外獲得了大量的驗(yàn)證研究，OECD指南推薦將FL法用于體外試驗(yàn)“自上而下”分層組合策略中，初步篩選眼腐蝕性、嚴(yán)重刺激性的受試物，但不推薦用于輕微、弱刺激性的評(píng)估，以及眼刺激性的分類。FL法僅適用于在規(guī)定條件下的水溶性無色物質(zhì)，不包括強(qiáng)酸、強(qiáng)堿、細(xì)胞固定劑、強(qiáng)揮發(fā)性物質(zhì)，會(huì)產(chǎn)生凝固、皂化或其他特殊反應(yīng)的化學(xué)物同樣不適用。

2.2.4短期暴露試驗(yàn)

引起角膜上皮細(xì)胞的細(xì)胞毒性是化學(xué)物引起角膜上皮損傷和眼刺激的重要作用方式，STE法利用兔眼角膜細(xì)胞（SIRC），將受試物短期暴露5min，使用MTT法或CCK-8法測(cè)定細(xì)胞吸光度，通過計(jì)算受試物暴露后引起角膜上皮的細(xì)胞生存率判斷受試物的眼刺激性。若受試物5%和0.05%質(zhì)量比濃度引起細(xì)胞生存率≤70%，則該受試物有刺激性；反之，若受試物5%和0.05%質(zhì)量比濃度引起細(xì)胞生存率大于70%，則無眼刺激性。

3皮膚刺激、腐蝕性評(píng)價(jià)

化妝品原料及產(chǎn)品對(duì)皮膚的損傷主要包括皮膚刺激性和腐蝕性，皮膚刺激性是指皮膚接觸受試物后產(chǎn)生的局部可逆性損傷，腐蝕性指的是不可逆損傷，體內(nèi)和體外替代試驗(yàn)是常用的方法，其中體外替代方法正成為趨勢(shì)。

3.1體內(nèi)試驗(yàn)

標(biāo)準(zhǔn)動(dòng)物皮膚刺激性試驗(yàn)是Draize試驗(yàn)，也是國(guó)際公認(rèn)的標(biāo)準(zhǔn)。常規(guī)的人體試驗(yàn)是斑貼試驗(yàn)，根據(jù)觀察志愿者斑貼部位是否有紅斑、浸潤(rùn)、水腫、丘疹等臨床表現(xiàn)分級(jí)并評(píng)估。若受試物刺激反應(yīng)小，人體試驗(yàn)臨床表現(xiàn)不明顯，為了全面評(píng)估受試物的刺激性，可通過生物工程技術(shù)進(jìn)行評(píng)價(jià)，如通過檢測(cè)經(jīng)皮水分流失（TransepidermalWaterLoss，TEWL）評(píng)估皮膚屏障功能，TEWL值越大，表明皮膚屏障功能受損越嚴(yán)重。

3.2體外試驗(yàn)

目前已經(jīng)有多種皮膚刺激、腐蝕性體外替代方法經(jīng)過了OECD、ECVAM的驗(yàn)證與認(rèn)可。

人表皮模型主要是將由人體取得的角質(zhì)形成細(xì)胞在體外誘導(dǎo)培養(yǎng)，完全分化至具有多層皮膚結(jié)構(gòu)的三維人體表皮模型。經(jīng)過驗(yàn)證的主要有EpiSkin、EpiDermTM、SkinEthicTM、LabCyteEPI-MODEL24SIT四種模型，將受試物涂抹于皮膚模型，暴露一定時(shí)間后用MTT法測(cè)試細(xì)胞存活率，若細(xì)胞存活率>50%，則該物質(zhì)對(duì)皮膚無刺激；若細(xì)胞存活率≤50%，則該物質(zhì)有皮膚刺激性，但無法對(duì)刺激性進(jìn)一步分類。

4結(jié)束語

體外科學(xué)技術(shù)的發(fā)展極大地促進(jìn)了替代方法的研究開發(fā)，世界各國(guó)在嚴(yán)禁動(dòng)物試驗(yàn)和推行替代方法的法規(guī)上的認(rèn)識(shí)逐漸統(tǒng)一，雖然目前替代方法的開發(fā)和驗(yàn)證有待進(jìn)一步成熟，如何將具有不同預(yù)測(cè)能力和使用范圍的體外方法科學(xué)合理地整合，提高替代方法的準(zhǔn)確度、精密度等都是以后的研究重點(diǎn)，但毫無疑問替代方法在化妝品安全性評(píng)價(jià)中的使用已成為全球趨勢(shì)。