高學(xué)勇 林 珊 韓咪莎

(1 福建醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院解剖學(xué)與組織學(xué)胚胎學(xué)系,福州 350004; 2 福州兒童醫(yī)院檢驗科,福州 350005)

全世界約15%的育齡夫婦被不育不孕所困擾,其中約50%為男性不育[1]。最近50年間,人類的精子質(zhì)量不斷降低,生殖能力也明顯下降;男性不育多為生精障礙,表現(xiàn)無精癥和少精癥,其病因復(fù)雜,目前治療方法很多,但效果均不太理想。環(huán)磷酰胺(cyclophosphamide)是一種烷化劑類藥物,是常用的抗腫瘤藥物和免疫抑制劑;對男性生殖系統(tǒng)的損傷和對后代的潛在致畸危險已經(jīng)引起醫(yī)患雙方的高度關(guān)注[2]。淫羊藿(herba epimedium)藥用歷史悠久,屬于小蘗科淫羊藿屬植物。淫羊藿苷(icariin)是淫羊藿的主要有效成分,也是探討含淫羊藿苷中成藥的首選成分,淫羊藿苷對免疫系統(tǒng)、生殖、內(nèi)分泌系統(tǒng)等作用的研究,證實了其強大的藥理活性,這為淫羊藿用于男性不育癥的治療提供了實驗依據(jù)。本研究采用環(huán)磷酰胺致性成熟大鼠睪丸生精障礙模型,研究環(huán)磷酰胺損傷后,睪丸組織學(xué)變化、促性腺激素及睪酮水平,生精上皮細胞凋亡、正中隆起促性腺激素釋放激素(gonadotropin-releasing hormone,GnRH)陽性纖維表達,探討淫羊藿苷能否改善環(huán)磷酰胺導(dǎo)致的生精障礙睪丸功能及其機制。

1 材料和方法

1.1 實驗動物和主要試劑

清潔級雄性SD大鼠40只,15周齡,體質(zhì)量300～350g,由上海斯萊克實驗動物有限公司提供;淫羊藿苷單體(南京替斯艾么中藥研究所,含量HPLC>98%);環(huán)磷酰胺(江蘇恒瑞醫(yī)藥股份有限公司);細胞凋亡檢測試劑盒、SABC試劑盒、GnRH 試劑盒(武漢博士德生物工程有限公司);DAB試劑盒(福州邁新生物技術(shù)開發(fā)有限公司);睪酮含量放射免疫試劑盒購于北京北方生物技術(shù)研究所。

1.2 動物分組及給藥

隨機將40只SD大鼠分成4組,每組10只。(1) 空白對照組：未經(jīng)任何處理;(2) 陰性對照組：腹腔注射生理鹽水1ml連續(xù)5d后,每天皮下注射含30% 二甲基亞砜的丙二醇0.5ml 1次,共50d。(3) 模型組：腹腔注射環(huán)磷酰胺(20mg·kg-1·d-1)[3]連續(xù)5d后,每天皮下注射含30%二甲基亞砜的丙二醇0.5ml 1次,共50d。(4) 淫羊藿苷治療組：腹腔注射環(huán)磷酰胺(20mg·kg-1·d-1)連續(xù)5d后,每天皮下注射淫羊藿苷注射液(50mg·kg-1·d-1)[4]1次,共50d。

1.3 取材及標本制作

各組于實驗第56天,即ICA注射結(jié)束后第1天,以3%戊巴比妥鈉(30mg/kg)麻醉,剖胸從右心房抽取2ml血液,離心取血清,低溫冰箱保存,待測睪酮、FSH、LH;打開腹腔,取左側(cè)睪丸注射4%多聚甲醛0.5ml,預(yù)固定30min后,再固定24h;下丘腦取材：迅速斷頭,按大鼠腦立體定位圖譜[5],切取含正中隆起、第三腦室和弓狀核的下丘腦腦塊,用4%多聚甲醛固定24h。睪丸、下丘腦腦塊常規(guī)石蠟包埋,制備5μm厚的連續(xù)切片,用于H-E染色、生殖細胞凋亡和免疫組織化學(xué)的觀察。

1.4 睪丸組織H-E染色和生殖細胞凋亡檢測

取各組每只大鼠睪丸組織切片各2張,其中1張做H-E染色,觀察睪丸組織學(xué)變化：生精小管面積、直徑、生殖細胞數(shù)量層次及生精小管是否含精子,同時應(yīng)用顯微攝影系統(tǒng)PM-OBAD,進行圖像分析自動測量生精小管直徑、面積;另一張應(yīng)用TUNEL觀察生殖細胞凋亡,具體操作按凋亡檢測試劑盒說明書進行,凋亡細胞核呈棕黃色,光鏡下隨機選取10個高倍視野,計數(shù)各視野陽性細胞數(shù);陰性對照不加末端轉(zhuǎn)化酶,以試劑盒提供的陽性對照切片作為陽性對照。結(jié)果判定：細胞核中有棕黃色顆粒者為陽性細胞,即凋亡的細胞。按凋亡檢測試劑盒說明書(TUNEL方法)檢測生殖細胞凋亡。

1.5 檢測血清睪酮、FSH、LH

取聚苯乙烯試管若干,編號后按試劑盒使用說明書中加樣順序表進行加樣,加樣前所有試劑搖勻、并平衡至室溫。采用電腦放射免疫法程序的四參數(shù)回歸自動處理得出結(jié)果。

1.6 免疫組織化學(xué)觀察正中隆起GnRH陽性纖維

石蠟切片經(jīng)脫蠟水化后,采用SABC法檢測正中隆起GnRH陽性纖維表達情況,具體操作按SABC法檢測試劑盒說明書進行,用PBS做陰性對照,有棕黃色反應(yīng)的為陽性。

1.7 統(tǒng)計學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 睪丸H-E染色切片觀察

空白對照組和陰性對照組睪丸生精小管直徑寬,排列密集,生精上皮厚,生殖細胞層次和數(shù)量多,生精小管均見精子形成,兩者生精小管形態(tài)結(jié)構(gòu)變化無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)(圖1A、B),模型組睪丸生精小管直徑縮小,間距增寬,生精上皮變薄,生殖細胞數(shù)量減少,生精小管腔多未見精子形成,與空白對照組比較其生精小管結(jié)構(gòu)變化顯著(P<0.01)(圖1C);淫羊藿苷治療組與模型組比較生精小管壁增厚,含有精子的生精小管明顯增多(P<0.01)(圖1D),各組睪丸生精小管直徑、面積、生殖細胞數(shù)見表1。

2.2 睪丸生殖細胞凋亡的觀察

空白對照組和陰性對照組睪丸生殖細胞凋亡較少(圖2A、B),兩組生殖細胞凋亡數(shù)量差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05);模型組與空白對照組比較其生殖細胞凋亡增多(圖2C),差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01);治療組與模型組比較生殖細胞凋亡數(shù)量明顯減少(P<0.01)(圖2D,表2)。

表1 各組睪丸生精小管直徑、面積、生殖細胞數(shù)Tab 1 Diameter,area,number of germ cells of testis seminiferous tubule in each group (n=10,

**P<0.01vsblank control group;△△P<0.01vsmodel group

2.3 正中隆起GnRH陽性纖維觀察

空白對照組和陰性對照組GnRH陽性纖維較少,染色淺(圖3A、B),兩組陽性纖維光密度差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05);模型組與空白對照組比較其陽性纖維增多,染色深(圖3C),光密度變化有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01);治療組與模型組比較其GnRH陽性纖維明顯減少,染色淺(P<0.01)(圖3D,表2)。

表2 各組生殖細胞凋亡數(shù)、GnRH陽性纖維光密度Tab 2 The number of germ cell apoptosis and optical density of GnRH-positive fibers in each group (n=10,

**P<0.01vsblank control group;△△P<0.01vsmodel group

2.4 血清睪酮、卵泡刺激素(FSH)及黃體生成素(LH)檢測

空白對照組和陰性對照組血清血睪酮水平差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05);模型組與空白對照組比較血清睪酮明顯降低,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01);治療組與模型組比較其血清睪酮明顯增加(P<0.01),血清FSH、LH水平各組間差異無統(tǒng)計學(xué)意義(表3)。

3 討論

睪丸是產(chǎn)生精子和分泌睪酮的重要器官,既受神經(jīng)內(nèi)分泌免疫網(wǎng)絡(luò)調(diào)控,也受到睪丸自身分泌的各種細胞因子的調(diào)控;本研究選用15周齡性完全成熟大鼠,用藥超過50d后,處理動物,因大鼠精子發(fā)生所需時間為50～60d,以便觀察環(huán)磷酰胺和淫羊藿苷對睪丸生殖細胞的影響,探討一個精子發(fā)生周期的變化。

環(huán)磷酰胺是常用的抗腫瘤藥物和免疫抑制劑,容易導(dǎo)致精子DNA損傷、少精癥、后代畸形;環(huán)磷酰胺能誘導(dǎo)睪丸生精障礙,本實驗建模成功,說明環(huán)磷酰胺可作為建立生精障礙動物模型的藥物,結(jié)合本人前期的研究和已發(fā)表的論文[6],其機制為誘導(dǎo)生精細胞凋亡,干擾A型精原細胞自我更新增殖及分化功能,損傷精子發(fā)生微環(huán)境,環(huán)磷酰胺損傷生殖細胞遺傳物質(zhì),同時具有生殖毒性,引起睪酮水平降低、生殖細胞數(shù)目減少[7]。

表3 各組大鼠血清睪酮、FSH、LH水平Tab 3 Serum Testosterone,FSH and LH levels in each group

**P<0.01vsblank control group;△△P<0.01vsmodel group

從本實驗結(jié)果觀察,淫羊藿苷對環(huán)磷酰胺誘導(dǎo)生精障礙大鼠睪丸生精小管結(jié)構(gòu)有明顯改善作用,減少生精細胞凋亡,促進精子發(fā)生,模型組血清睪酮水平顯著降低,淫羊藿苷治療組血清睪酮水平明顯提高,說明淫羊藿苷有明顯的性激素樣作用可直接刺激性腺[8],腎陽虛小鼠血清睪酮含量,性腺雄激素受體mRNA 和蛋白質(zhì)的表達與正常組相比均有所下降,淫羊藿苷能夠抑制其下降,緩解腎陽虛癥狀,因緩解腎陽虛小鼠睪酮及性腺雄激素受體基因的表達下調(diào)[9]。通過觀察淫羊藿苷對衰老大鼠睪丸組織基質(zhì)金屬蛋白酶-2(MMP-2)、基質(zhì)金屬蛋白酶-9(MMP-9) 表達的影響,顯示淫羊藿苷對 D-半乳糖所致的衰老大鼠睪丸損傷有明顯的保護作用,其機制可能與上調(diào) MMP-2、MMP-9水平有關(guān)[10]。黃酮類藥物具有抗氧化、抗腫瘤和抗炎等作用,淫羊藿苷是黃酮類藥物的一種,具有保護血管內(nèi)皮細胞的作用,減少內(nèi)皮細胞凋亡[11]。淫羊藿苷能減少生精細胞凋亡,促進精子發(fā)生,淫羊藿苷可通過調(diào)控蛋白激酶B(protein kinase B,AKT)通路,進一步增加p-AKT 蛋白的表達,從而抑制P53蛋白表達,抑制活性氧(reactive oxygen species,ROS)和保護線粒體膜電位,抑制細胞色素C釋放和caspase-3活化,從而抑制細胞凋亡,淫羊藿苷還具有抑制S-亞硝基谷胱甘肽誘導(dǎo)細胞凋亡的作用[12]。不同哺乳動物的GnRH神經(jīng)元分布明顯不同,人類主要分布于弓狀核和視前區(qū),而嚙齒動物在弓狀核中幾乎不能檢測到GnRH神經(jīng)元,與本實驗結(jié)果相符合,嚙齒動物最明顯的GnRH神經(jīng)元網(wǎng)絡(luò)的組成神經(jīng)元形成了一個松散而連續(xù)的隔區(qū)視前區(qū)-漏斗區(qū)通路[13],通過免疫細胞化學(xué)觀察,顯示模型組大鼠正中隆起處GnRH 陽性纖維的光密度卻增加,正中隆起是GnRH分泌的最后通路,參與垂體促性腺激素合成和釋放的管理,在正中隆起處刺激或抑制GnRH神經(jīng)末梢,能夠影響GnRH向垂體門脈系統(tǒng)的釋放,低水平睪酮能促進GnRH神經(jīng)元合成,增加軸漿運輸,同時,環(huán)磷酰胺可能抑制GnRH神經(jīng)纖維末梢釋放GnRH,使GnRH并沒有全部進入垂體門脈系統(tǒng)而是發(fā)生了GnRH的蓄集;而淫羊藿苷治療組未見GnRH在正中隆起的蓄集現(xiàn)象,高水平睪酮能抑制GnRH神經(jīng)元合成,減少軸漿運輸[14]。本研究結(jié)果顯示各組血清FSH、LH水平無顯著改變,與章振保等[15]研究結(jié)果相似,但并不能說明環(huán)磷酰胺和淫羊藿苷對腺垂體前葉促性腺細胞沒有直接作用,因垂體-性腺軸存在負反饋調(diào)節(jié)機制,睪酮水平降低能促進腺垂體前葉促性腺細胞分泌FSH、LH,睪酮水平提高負反饋調(diào)節(jié)促性腺細胞分泌FSH、LH減少,而FSH、LH的分泌也受GnRH的調(diào)控,故各組FSH和LH維持相對平衡?？傊?本研究結(jié)果表明,環(huán)磷酰胺能誘導(dǎo)睪丸生精障礙,促進生殖細胞凋亡,淫羊藿苷可改善睪丸生精小管結(jié)構(gòu),促進精子發(fā)生,減少生殖細胞凋亡,為男性不育癥中藥治療提供理論依據(jù),具有重要的臨床意義。

圖1 睪丸組織觀察,H-E染色,標尺=100μm,×100。A：空白對照組;B：陰性對照組;C：模型組;D：淫羊藿苷治療組.
圖2 睪丸生殖細胞凋亡的觀察,TUNEL,標尺=100μm,×100?！旱蛲黾毎：空白對照組;B：陰性對照組;C：模型組;D：淫羊藿苷治療組．
圖3 正中隆起()GnRH陽性纖維觀察,SABC法,標尺=100μm,×100?！篏nRH陽性纖。A：空白對照組;B：陰性對照組;C：模型組;D：淫羊藿苷治療組.
Fig 1 Observation of testicular tissue,H-E staining,bar=100μm,×100.A：Blank control group; B：Negative control group; C：Model group; D：Icariin treatment group.
Fig 2 Observation of germ cell apoptosis in testicular seminiferous tubules,TUNEL method,bar=100μm,×100.↑：Apoptotic cells.A：Blank control group; B：Negative control group; C：Model group; D：Icariin treatment group.
Fig 3 Observation of GnRH-positive fibers in median eminence (),SABC method,bar=100μm,×100.↑：GnRH-positive fibers.A：Blank control group; B：Negative control group; C：Model group; D：Icariin treatment group.

參 考 文 獻

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(編輯: 葉 文)