劉 偉，李清海，劉仁虎

(1.浙江省農業(yè)科學院 植物保護與微生物研究所，浙江 杭州 310021； 2.浙江大學醫(yī)學院附屬第二醫(yī)院 放射科，浙江 杭州 310009； 3.浙江省農業(yè)科學院 病毒生物技術研究所，浙江 杭州 310021)

抗菌肽是一類具有抗菌活性的生物短肽，在自然界分布廣泛、種類繁多，但是產量不多[1]?？咕牟灰桩a生耐藥性，因而是未來應對耐藥性病原菌的希望之星，近年來成為新興醫(yī)藥、植物抗病基因工程、養(yǎng)殖飼料添加劑的研究熱點[2-3]。與傳統(tǒng)的抗生素相比，抗菌肽的價格限制了大規(guī)模生產[4]。thanatin是從半翅目昆蟲刺肩蝽(Podisusmaculiventris)的血淋巴中分離的一種高活性抗菌肽，由21個氨基酸組成(GSKKPVPIIYCNRRTGKCQRM)，在11位和18位的半胱氨酸形成二硫鍵[5]。二硫鍵對thanatin的抗菌活性可有可無，并不是必需的[6]。由于該抗菌肽對真菌的殺菌活性高而受到關注。

利用微生物工程菌對抗菌肽進行表達是低成本獲得抗菌肽的最佳途徑。大腸埃希菌E.coli是目前利用最為廣泛的表達宿主菌，因為其具有遺傳背景清楚，易于操作，培養(yǎng)成本簡單，生產上應用成本低的特點[7]。對于一些含有維持抗菌活性必需的二硫鍵的抗菌肽，可以選擇trxB和gor基因缺失的大腸埃希菌菌株，Novagen公司的Origami B、Origami 2和 Rosetta-gami B菌株具有該特性[8]，另外的方法就是引入信號序列，使目標蛋白進入細胞周質空間，形成二硫鍵[9]。由于抗菌肽對宿主具有毒性，不少學者都嘗試用不同的融合標簽來提高抗菌肽的表達水平和增加蛋白的可溶性[10]。因此本研究通過串聯(lián)表達抗菌肽單體與MBP蛋白融合表達，希望能夠提高抗菌肽的表達效率，同時提高抗菌肽單位效價，為后續(xù)進行不同抗菌肽串聯(lián)的表達提供一種新思路。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株與載體

表達宿主菌BL21(DE3)，為本實驗室保存，表達載體pCreat-M由通用生物系統(tǒng)(安徽)有限公司提供。

1.1.2 酶與試劑

限制內切酶、連接酶以及DNA marker購自NEB北京有限公司，6×His Tag Antibody，HRP conjugate購自Invitrogen，Western熒光檢測試劑BeyoECL Plus購自碧云天生物技術研究所。蛋白分子標準購自Thermo公司，IPTG購自Amresco公司，脫脂奶粉購自國內伊利集團；其他化學試劑來自國藥集團。

1.2 方法

1.2.1 目的基因的獲得

從抗菌肽數據庫中檢索抗菌肽的氨基酸序列，進行核苷酸密碼子優(yōu)化，并合成3個串聯(lián)重復的thanatin基因，該基因由通用生物系統(tǒng)(安徽)有限公司合成。

1.2.2 載體的構建

將含有3×thanatin基因的克隆載體pUC57，經過BamHⅠ和XhoⅠ雙酶切純化回收后，與含有相同酶切過的表達載體pCreat-M，通過 T4 DNA ligase，20 ℃連接 2 h，轉化到E.coliTOP10，通過抗性篩選和酶切驗證，驗證目的片段是否連接到目的載體。

1.2.3 表達及優(yōu)化

挑取劃線平板上單克隆接種于含適量抗性的LB培養(yǎng)液的試管中；37 ℃ 220 r·min-1振搖至菌體D600為0.6～0.8；取出1 mL培養(yǎng)物，10 000g室溫離心2 min，棄上清，用80 μL 1×PBS緩沖液重懸菌體沉淀加入20 μL的5×Loading Buffer；向剩余的培養(yǎng)物中加入IPTG至終濃度為1 mmol·L-1，在37 ℃ 220 r·min-1振搖4 h，誘導融合蛋白表達；取出1 mL培養(yǎng)物，12 000g室溫離心2 min，棄上清，用80 μL 1×PBS緩沖液重懸菌體沉淀加入20 μL的5×loading buffer。隨后對不同誘導濃度和不同誘導時間進行檢測分析，找出最佳表達條件。最后在此基礎上，對表達的蛋白進行可溶性分析，誘導后的菌液離心2 min，棄上清，用500 μL的緩沖液A(20 mmol·L-1Tris，300 mmol·L-1NaCl，pH 8.0)重懸離心后沉淀，超聲波破碎(Φ3，15%，2 s/8 s，10 min)，上清沉淀分別制樣，通過電泳分析目的蛋白可溶性。

1.2.4 蛋白電泳

加入相應體積的總蛋白樣品與5×蛋白質凝膠電泳上樣緩沖液，輕輕混合，95 ℃變性10 min，立即插入冰中待用；將樣品輕輕加至凝膠孔中，電泳儀設置成穩(wěn)壓狀態(tài)，接通電源，將電壓調至200 V使樣品通過濃縮膠與分離膠。電泳使染料至分離膠適當位置，結束電泳。進行12% SDS-PAGE分析。

1.2.5 Western-blot檢測

按著上述條件電泳完畢，進行半干式電轉印凝膠電泳，30 V，45 min結束后，將凝膠上分離到的蛋白條帶轉到PVDF，然后用1×PBST洗膜3次，用5%的脫脂奶粉進行封閉，室溫漂洗3次，加入抗體6×His Tag antibody，HRP conjugate(1∶2 000到5% 脫脂奶粉中)，孵育1 h。室溫用1×PBST漂洗5 min，共3次。緩慢加入少量ECL顯色液，能將膜全部覆蓋，然后用凝膠成像系統(tǒng)觀察條帶，拍攝。

1.2.6 親和純化與酶切

親和純化：采用最優(yōu)表達條件進行誘導，8 000 r·min-1離心10 min，棄去上清，收集所有菌體。使用緩沖液A(20 mmol·L-1Tris，300 mmol·L-1NaCl，pH 8.0)重懸菌體，超聲破碎(Φ10，15%，2 s/8 s，30 min)。16 000 r·min-1離心10 min，收集上清。在上清中加入2 mL Ni-NTA，混勻后4 ℃孵育1 h。將孵育物加入空柱管，收集流出液。分別以緩沖液B(20 mmol·L-1Tris，300 mmol·L-1NaCl，20 mmol·L-1imidazole，pH 8.0)與緩沖液C(20 mmol·L-1Tris，300 mmol·L-1NaCl，40 mmol·L-1imidazole，pH 8.0)清洗填料，收集清洗液。利用緩沖液D(20 mmol·L-1Tris，300 mmol·L-1NaCl，500 mmol·L-1imidazole，pH 8.0)洗脫，收集洗脫液。

酶切：將上一步驟洗脫樣透析至緩沖液A中，取少量透析產物，在其中加入適量的TEV protease，4 ℃反應16 h。利用緩沖液A平衡Ni-NTA親和層析柱后，將反應產物緩慢加入層析柱，收集流出樣。利用緩沖液A清洗層析柱，收集清洗樣。利用緩沖液D洗脫，收集洗脫樣。將上一步驟酶切后流出樣全部收集至透析袋(3.8 ku截留分子量)，在PEG8000粉末中濃縮，經SDS-PAGE電泳檢測。

1.2.7 液相質譜分析

蛋白的制備：細胞培養(yǎng)的上清液混合了4倍體積的冷丙酮，過夜保存在-20 ℃，在20 000g下離心沉淀蛋白。蛋白沉淀用丙酮洗滌3次，并溶解在8 mol·L-1尿素和50 mmol·L-1TEAB(pH 8.0)中，隨后經過一系列的TECP還原、碘乙酰胺烷基化、稀釋以及胰蛋白酶消化(1∶100酶蛋白比)，然后將經過C18柱脫鹽和真空冷凍離心干燥。肽段分析采用Dionex ultiMate 3000 nano LC系統(tǒng)耦合到Thermo Scientific公司的Flex離子源。柱子型號為PepMap C18柱。樣品通過Q-Exactive Orbitrap HF質譜儀進行分析。

1.2.8 抗菌試驗

取一小塊活化的核盤菌菌絲接種于PDA平板中央，21.5 ℃黑暗培養(yǎng)24 h，在新長出的菌絲圈外0.5 cm處，用200 μL槍頭印下淺溝(1～2 mm深)，將20 μL相應濃度的抗菌肽水溶液加于環(huán)狀溝中，再在21.5 ℃下黑暗培養(yǎng)48 h，觀察抑菌效果，拍照。

2 結果與分析

2.1 基因的克隆及其表達載體的成功構建

thanatin核苷酸序列由通用公司體外合成。含有該基因的pUC57克隆質粒轉化到含有AP+抗性平板上大腸埃希菌E.coliTOP，挑選單克隆，提取質粒，通過BamHⅠ和XhoⅠ雙酶切進行電泳檢測，如圖1，酶切后基因片段大小符合理論值。后經基因測序公司進行測序，證明該基因正確地克隆到表達載體pCreat-M中。

2.2 蛋白表達檢測及優(yōu)化

將上述構建好的表達抗菌肽的工程菌pCreat-T/E.coliBL21(DE3)進行不同時間誘導表達，如圖2所示，每隔2 h取樣，進行SDS-PAGE分析，結果表明目的融合蛋白得到了表達。誘導4 h，目的蛋白表達量最大，表達的氨基酸序列理論分子量為52.4 ku，與預期大小相符，隨后通過Western blot進行檢測，目的蛋白表達進一步被證實，如圖3。通過不同溫度，不同誘導物IPTG的濃度進行誘導表達，通過SDS-PAGE結果可以發(fā)現(xiàn)在37 ℃和15 ℃蛋白均可以表達，但37 ℃溫度下蛋白的可溶性的表達量優(yōu)于15 ℃條件下的表達，且1.0 mmol·L-1濃度的IPTG誘導表達目的蛋白的可溶性優(yōu)于0.2 mmol·L-1濃度IPTG下的蛋白表達(圖4)。

Lane M，DNA 標準分子質量； Lane 1，構建的質粒BamHⅠ和XhoⅠ雙酶切的電泳，目標片段位于250 bp下方； Lane 2，構建的質粒電泳。Lane M，DNA standard molecular weight；Lane 1，Electrophoresis analysis of plasmids by the double enzyme digestion; Lane 2，Electorphories analysis of the plasmids.圖1 質粒雙酶切結果Fig.1 Double enzymes digestion results of recombinant plasmid

Lane M，Protein ladder marker；Lane 1，誘導前；Lane 2-6，每隔2 h不同時間點取樣。Lane M，Protein ladder marker; Lane 1，SDS-PAGE of induced sample; Lane 2-6: SDS-PAGE of induced samples at every 2 hours.圖2 抗菌肽表達的SDS-PAGE電泳峰分析Fig.2 SDS analysis of protein expression after different periods of E. coli strain

M，蛋白分子質量標準；Lane 1，樣品。M，Protein marker; Lane 1，Sample.圖3 重組菌pCreat-T/BL21(DE3)誘導表達產物Western blot鑒定Fig.3 Western blot identification of the induced products of recombinant bacteria pCreat-T/BL21(DE3)

M，Protein marker；Lane 1，未誘導樣品；Lane 2，誘導后樣品；Lane 3，37 ℃ 1.0 mmol·L-1 IPTG誘后上清樣；Lane 4，37 ℃ 1.0 mmol·L-1 IPTG誘后沉淀樣；Lane 5，37 ℃ 0.2 mmol·L-1 IPTG誘后上清樣；Lane 6，37 ℃ 0.2 mmol·L-1 IPTG誘后沉淀樣；Lane 7，15 ℃ 1.0 mmol·L-1 IPTG誘后上清樣；Lane 8，15 ℃ 1.0 mmol·L-1 IPTG誘后沉淀樣；Lane 9，15 ℃ 0.2 mmol·L-1 IPTG誘后上清樣；Lane 10，15 ℃ 0.2 mmol·L-1 IPTG誘后沉淀樣。M，Protein marker; Lane 1，Uninduced control; Lane 2，Induced sample; Lane 3，Induced supernatant by 1.0 mmol·L-1 IPTG under 37 ℃; Lane 4，Induced precipitated sample by 1.0 mmol·L-1 IPTG under 37 ℃; Lane 5，Induced supernatant by 0.2 mmol·L-1 IPTG under 37 ℃; Lane 6，Induced precipitated sample by 0.2 mmol·L-1 IPTG under 37 ℃; Lane 7，Induced supernatant by 1.0 mmol·L-1 IPTG under 15 ℃; Lane 8，Induced precipitated sample by 1.0 mmol·L-1 IPTG under 15 ℃; Lane 9，Induced supernatant by 0.2 mmol·L-1 IPTG under 15 ℃; Lane 10，Induced precipitated sample by 0.2 mmol·L-1 IPTG under 15 ℃.圖4 pCreat-T在E. coli中的可溶性分析Fig.4 Soluble detection of pCreat-T in E. coli

2.3 蛋白的純化與酶切

經過對含有20、40和500 mmol·L-1不同濃度的咪唑緩沖液進行梯度洗脫，發(fā)現(xiàn)500 mmol·L-1咪唑洗脫液里含有目的蛋白(圖5)。經過酶切后流出液全部收集至透析袋(3.8 ku截留分子量)，在PEG8000粉末中濃縮，最終溶解在20 mmol·L-1Tris，300 mmol·L-1NaCl，pH 8.0溶液中，Nanodrop測得最終樣品濃度為0.02 mg·mL-1。樣品經過質譜檢測，檢測出抗菌肽序列片段(圖6)，表明抗菌肽已成功表達。根據該質譜特征目標多肽鑒定為KPVPIIYCNR，其中C8氨基酸為脲甲基化修飾。該多肽為3×thanatin多聚抗菌肽胰蛋白酶酶解后的主要產物。

2.4 抑菌結果

將3×thanatin串聯(lián)表達產物稀釋到不同濃度進行體外抑菌試驗，結果見圖7與對照緩沖液D比較，12～36 ng·μL-1的抗菌肽表達產物對核盤菌具有微弱的抑菌活性，48 ng·μL-1的抗菌肽原核表達產物對核盤菌具有顯著的抑菌活性。換算為3×thanatin抗菌肽的當量濃度約在6.6 μmol·L-1，而化學合成的thanatin抗菌肽對核盤菌的抑菌濃度約為64 μmol·L-1，3×thanatin抗菌肽抑菌活性提升了約1個數量級。

Lane M，Protein marker；Lane 1，破碎后沉淀；Lane 2，破碎后上清；Lane 3，Ni-NTA孵育后流出液；Lane 4，緩沖液B清洗樣；Lane 5，緩沖液C清洗樣；Lane 6，緩沖液D洗脫樣。Lane M，Protein marker; Lane 1，Precipitate of ultrasonic treatment; Lane 2，Supernatant of ultrasonic treatment; Lane 3，Ni-NTA column flow through; Lane 4，Column wash by buffer B; Lane 5，Column wash by buffer C; Lane 6，Column elution by buffer D.圖5 pCreat-T在E. coli表達產物純化結果Fig.5 Purification result of recombinant pCreat-T in E. coli

3 討論

菌核病(Sclerotiniastem rot)是由核盤菌寄生引起的一種嚴重的真菌性病害。該病的發(fā)生每年對油菜的產量損失達到10%～30%[11]。在前期的研究工作中，我們發(fā)現(xiàn)在64 μmol·L-1濃度下1×thanatin對核盤菌具有明顯的抑制效果，而本研究發(fā)現(xiàn)3×thanatin對核盤菌的抑菌活性提高了約1個數量級，其中的作用機制尚不明確，一方面3×thanatin在相同摩爾濃度下質量濃度更高，另一方面原核表達的3×thanatin在半胱氨酸殘基上有脲甲基修飾。除此之外，抗菌肽thanatin對細菌也有抑制效果，細胞毒性小，且革蘭氏陰性細菌的抑菌效果要遠遠強于革蘭氏陽性菌[12]，這些研究發(fā)現(xiàn)都為thanatin在防治菌核病上應用提供了技術支撐。

圖6 洗脫樣的質譜鑒定Fig.6 MS spectra of the substance derived from the elution sample

1，對照緩沖液D; 2，原核表達的抗菌肽12 ng·μL-1; 3，原核表達的抗菌肽 24 ng·μL-1; 4，原核表達的抗菌肽36 ng·μL-1; 5，原核表達的抗菌肽48 ng·μL-1。1，Buffer D as control; 2，The expressed thanatin at 12 ng·μL-1; 3，The expressed thanatin at 24 ng·μL-1; 4，The expressed thanatin at 36 ng·μL-1; 5，The expressed thanatin at 48 ng·μL-1. 圖7 原核表達的thanatin抗菌肽串聯(lián)體對核盤菌的抑菌效果Fig.7 Inhibition effect of tandem thanatin on Sclerotinia sclerotiorum

在過去幾十年，很多學者嘗試對不同抗菌肽雜合進行表達以獲得高效抗菌活力和降低細胞毒性[3,13-16]，如CecropinA和LL-37雜交形成的新抗菌肽展示出很強的抗菌活性，并且對綿羊紅細胞沒有溶血毒性[15]。在前期，我們對抗菌肽thanatin的不同拷貝數以及不同蛋白標簽進行構建[17]，結果發(fā)現(xiàn)超過3個拷貝的thanatin和含有sumo標簽的蛋白在大腸埃希菌中都沒有成功表達。只有3個拷貝的thanatin與MBP標簽融合表達才能成功，個中原因并不清楚?？傊狙芯繉ο嗤嗫截惪咕牡某晒Ρ磉_，為后續(xù)多拷貝基因以及雜合抗菌肽的融合表達提供了一種策略，同時對提高抗菌肽表達豐度和擴大抗菌肽抗菌譜提供了理論依據和應用價值。

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