宋傳偉

甲狀腺癌屬于常見的內(nèi)分泌惡性腫瘤之一，包括乳頭狀癌、未分化癌、濾泡狀癌以及髓樣癌，且以乳頭狀癌發(fā)生率最高，大約占所有甲狀腺癌的85%[1]。目前，甲狀腺癌的發(fā)病率逐年升高，尤其乳頭狀癌的發(fā)生情況最為明顯。甲狀腺癌治愈率也比較低，大多數(shù)患者會(huì)發(fā)生疾病復(fù)發(fā)、并發(fā)癥、癌組織遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移等后遺癥，因此甲狀腺癌的治療也越來越受到人們的關(guān)注[2]。本院在對(duì)甲狀腺癌以及良性甲狀腺病變患者的診治過程中，分析BRAF基因突變與甲狀腺癌的發(fā)病機(jī)制、病理性特征、治療、診斷的臨床相關(guān)性，取得了滿意效果，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選取2016年7月～2017年7月本院收治的甲狀腺癌患者40例，其中男23例，女17例，年齡25～76歲，平均年齡（53.2±2.4）歲，乳頭狀癌25例，濾泡狀癌8例，未分化癌7例，腫瘤直徑＞1 cm有24例，≤1 cm有16例；同期收治的良性甲狀腺病變患者32例，其中男15例，女17例，年齡31～74歲，平均年齡（48.5±3.2）歲，甲狀腺結(jié)節(jié)15例，甲狀腺腺瘤8例，甲狀舌管囊腫9例。兩組患者臨床資料比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，均知情同意本研究，并經(jīng)過醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2 方法 研究組與對(duì)照組患者均采用以下的兩種方法分別觀察其BRAF基因突變情況以及BRAF蛋白表達(dá)情況。

1.2.1 BRAF基因突變情況 采用PCR擴(kuò)增技術(shù)并通過測(cè)序儀對(duì)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行序列測(cè)定。首先進(jìn)行DNA的提取，將8μm厚的石蠟組織進(jìn)行切片處理，切分為3～4片，將其放置于1.5 ml專用試管中，將含有DNA的石蠟切片抽提試劑盒進(jìn)行樣本提取，使用NanoDrop進(jìn)行DNA的濃度測(cè)定，均按照試劑盒操作說明書進(jìn)行[3]。其次進(jìn)行引物合成，引物合成后，采用巢式PCR擴(kuò)增技術(shù)進(jìn)行BRAF基因的擴(kuò)增。擴(kuò)增完成后，取8μl PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，2%的瓊脂糖凝膠，1μl緩沖液，在100 V電壓下進(jìn)行30 min的電泳操作，EB進(jìn)行染色處理，將PCR產(chǎn)物純化后，使用引物BRAF-F或BRAF-R進(jìn)行測(cè)序，并將測(cè)序結(jié)果通過Blast軟件與已知序列進(jìn)行同源性比較，觀察BRAF基因突變情況[4]。

1.2.2 BRAF蛋白表達(dá)情況 采用免疫組化Envision兩步法，將4μm厚石蠟切片，石蠟進(jìn)行常規(guī)脫至水處理，置于放有檸檬酸修復(fù)液的電飯煲中，煮沸20 min，然后將其降至室溫狀態(tài)，再滴加稀釋程度為（1∶100）的抗BRAF抗體，培養(yǎng)3 h，用PBS清洗3次，發(fā)現(xiàn)DAB正常顯色，再次用蘇木精染色一遍，脫水至透明封固處理[5]。觀察分析BRAF蛋白表達(dá)中的陽性率與陰性率。

1.3 觀察指標(biāo) 通過將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物與基因庫中的序列進(jìn)行比較，觀察BRAF突變情況。BRAF蛋白表達(dá)陽性與陰性判斷標(biāo)準(zhǔn)：腫瘤細(xì)胞核染色后為棕黃色，隨機(jī)觀察切片的5個(gè)視野，陽性細(xì)胞數(shù)占腫瘤細(xì)胞總數(shù)得百分比≥10%為陽性，即為甲狀腺癌，陽性細(xì)胞數(shù)或無著色細(xì)胞數(shù)＜10%為陰性，即良性腫瘤。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 本研究采用SPSS 18.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)數(shù)資料以例數(shù)表示，采用χ2檢驗(yàn)；計(jì)量資料采用“x±s”表示，采用t檢驗(yàn)；P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

研究組中甲狀腺乳頭狀癌25例，有15例發(fā)生了基因突變，濾泡狀癌與未分化癌沒有發(fā)生基因突變。對(duì)照組中均無基因突變發(fā)生，兩組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

研究組患者的BRAF蛋白表達(dá)率水平明顯高于對(duì)照組（P＜0.05），且研究組BRAF蛋白陽性者28例，陽性率為70.0%，表達(dá)陰性者12例，陰性率為30.0%，對(duì)照組BRAF蛋白表達(dá)陽性者8例，陽性率為25.0%，表達(dá)陰性者24例，陰性率為75.0%，見表1。

表1 兩組患者BRAF蛋白表達(dá)水平對(duì)比[n（%）]Table 1 Comparison of BRAF protein expression levels in the two groups[n(%)]

3 討論

BRAF基因，又稱鼠類肉瘤濾過性毒菌致癌同源體B1，屬于RAF基因家族中的一種，位于人染色體的7q34，約190 KD大小，有94 KD能夠編碼蛋白質(zhì)分子，且含有18個(gè)外顯子，783個(gè)氨基酸殘基，對(duì)MAPK信號(hào)通路的傳導(dǎo)有重要作用，其基因突變對(duì)于多種癌的形成均有誘導(dǎo)作用，甲狀腺癌是其中之一[6]。RAS和RET的下游蛋白激酶是BRAF，在15外顯子基因中的單個(gè)堿基發(fā)生突變（T1799A），會(huì)造成谷氨酸替代翻譯蛋白質(zhì)的密碼子相對(duì)應(yīng)的纈氨酸（V600E)，使之變成活化的蛋白激酶，從而將MEK（ERK激酶）激活以及向MAPK信號(hào)通路下游傳遞有絲分裂信號(hào)的細(xì)胞，致使腫瘤的形成。MAPK是一種信號(hào)通路，能夠?qū)?xì)胞的生長(zhǎng)、繁殖、分化、凋亡起重要調(diào)控作用，影響細(xì)胞的生命周期，當(dāng)它被某種因素影響導(dǎo)致其異常激活時(shí)，可能會(huì)促使腫瘤的形成[7]。

BRAF基因合并PTEN、RAS等基因突變通常發(fā)生在浸潤(rùn)性甲狀腺癌中，尤以甲狀腺乳頭狀癌的發(fā)生最為常見，甲狀腺癌發(fā)生的重要機(jī)制之一是抑癌基因發(fā)生異常甲基化從而誘導(dǎo)基因沉默的發(fā)生，并使腫瘤進(jìn)一步惡化。研究學(xué)者在對(duì)甲狀腺乳頭狀癌患者的研究中發(fā)現(xiàn)，RASSR1A抑癌基因超甲基化與BRAF基因突變具有負(fù)相關(guān)的關(guān)系，這或許暗示著BRAF基因的后天破壞可能將通過影響信號(hào)通路（MAPK通路）來誘導(dǎo)甲狀腺癌的形成。最新的研究表明，BRAF基因突變能夠誘導(dǎo)轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子TGF-β的分泌以及抑制素（PHB）的分泌，且BRAF基因突變能夠提高抑制素釋放素的活性，促進(jìn)PHB的分泌，抑制素能夠潛在的對(duì)BRAF基因突變進(jìn)行調(diào)節(jié)，從而促使甲狀腺乳頭狀癌的發(fā)生。BRAF基因突變經(jīng)研究證實(shí)，與患者的年齡、性別、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、原發(fā)灶大小、甲狀腺外侵犯以及腫瘤大小和分期沒有明顯相關(guān)性，其突變的主要原因有：①BRAF基因的異常剪接。BRAF基因的異常剪接是引起B(yǎng)RAF基因活化的重要誘因，研究學(xué)者通過調(diào)查甲狀腺癌患者的腫瘤組織發(fā)現(xiàn)，BRAF基因突變都能夠檢測(cè)到，且在甲狀腺乳頭狀癌患者中的Ⅲ期、Ⅳ期顯著高于Ⅰ期、Ⅱ期，這種異?，F(xiàn)象的出現(xiàn)與腫瘤的分期、BRAF突變有明顯關(guān)系。②輻射。輻射是一種重要的致癌劑，其與DNA分子相互作用，能夠使DNA分子雙鏈裂變，導(dǎo)致基因重排，遭受輻射的細(xì)胞會(huì)造成基因組出現(xiàn)不穩(wěn)定性，且相鄰的細(xì)胞即使未被輻射也會(huì)出現(xiàn)相同的現(xiàn)象，這便是旁觀者效應(yīng)，最終會(huì)導(dǎo)致腫瘤原癌基因與抑癌基因發(fā)生變化，致使腫瘤形成[8]。致癌基因的重排包括原癌基因和抑癌基因，也包括BRAF基因的重排。有研究調(diào)查發(fā)現(xiàn)，在切爾諾貝利核事故發(fā)生后的20多年，當(dāng)?shù)鼐用窦谞钕侔┑陌l(fā)病率增加較快，表明射線暴露也是導(dǎo)致甲狀腺癌的危險(xiǎn)因子。③大量的碘攝入。研究學(xué)者通過考察分析，發(fā)現(xiàn)高碘攝入?yún)^(qū)比正常的碘攝入?yún)^(qū)發(fā)生BRAF基因突變的突變率要高很多，以此證明，大量碘的攝入也是一個(gè)誘導(dǎo)因素[9]。

雖然BRAF基因突變會(huì)誘導(dǎo)甲狀腺癌的形成，但其也具有重要的臨床醫(yī)學(xué)價(jià)值，對(duì)于甲狀腺癌的診治和預(yù)后有重要的作用。通過本次研究表明，BRAF基因突變率為60%，其中甲狀腺乳頭狀癌突變率最高，且在其他甲狀腺癌和良性甲狀腺病變中并未發(fā)生基因突變，國(guó)內(nèi)外的文獻(xiàn)報(bào)道稱BRAF基因在甲狀腺乳頭狀癌中的突變率為28.4%～66.7%，本次研究結(jié)果與報(bào)道上大體上一致，表明BRAF基因是甲狀腺癌的特異基因，因此可作為診斷甲狀腺癌發(fā)生的一個(gè)標(biāo)志物[10]。本次研究結(jié)果顯示，研究組患者的BRAF蛋白表達(dá)率水平明顯高于對(duì)照組（P＜0.05），表明甲狀腺癌患者體內(nèi)BRAF基因蛋白表達(dá)更為顯著，腫瘤細(xì)胞繁殖率較高。對(duì)于甲狀腺癌的治療，可以通過研究某種抑制藥物，使其能抑制MAPK信號(hào)通路的異常激活，或者使某種抑制藥物能夠抑制乳頭狀癌腫瘤細(xì)胞的增殖，可能將會(huì)有效治療甲狀腺癌，治療效果還有待于進(jìn)一步研究。

綜上所述，BRAF基因突變與BRAF蛋白表達(dá)為陽性都會(huì)誘導(dǎo)甲狀腺癌的發(fā)生，成為難以根治的惡性腫瘤，但其在甲狀腺癌的診治及預(yù)后中也發(fā)揮了輔助價(jià)值，有利于為臨床應(yīng)用BRAF基因突變?cè)\斷甲狀腺癌和患者的預(yù)后工作提供理論依據(jù)，其臨床價(jià)值仍需要進(jìn)一步研究發(fā)展。

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