馮云龍，丁澤人，楊曉君

(新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)，烏魯木齊 830000)

新疆葵花籽年產(chǎn)總量超過40萬(wàn)噸[1]。新疆油葵籽出油質(zhì)好、油率高、不飽和脂肪酸含量高?？ㄗ哑墒强ㄗ阎朴蜁r(shí)的副產(chǎn)物，葵花籽粕營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)豐富，富含29%～43%的優(yōu)質(zhì)植物蛋白[2，3]，且氨基酸組成均衡，蛋白組成為：醇溶蛋白(1%～4%)、谷蛋白(11%～17%)、球蛋白(55%左右)和清蛋白(20%左右)[4]?？ㄗ哑芍羞€含有較高的生物活性鈣、磷脂和煙酸[5]、高級(jí)脂肪醇類、水溶性膳食纖維及水不溶性膳食纖維、還原糖、微量元素及天然色素、糠醛[6，7]。為了充分利用葵花籽粕蛋白質(zhì)資源，本文利用新疆葵花籽粕通過堿水解、酶水解制備葵花籽多肽，將該多肽與葡萄糖進(jìn)行美拉德反應(yīng)合成天然風(fēng)味物質(zhì)，并對(duì)天然風(fēng)味物質(zhì)的合成條件進(jìn)行優(yōu)化，制定基于美拉德反應(yīng)合成麥香味的葵花籽粕天然風(fēng)味物質(zhì)的工藝，旨在為新疆地產(chǎn)葵花籽粕深加工利用做有益的探索。

1 材料與實(shí)驗(yàn)方法

1.1 材料與主要試劑

正己烷(分析純)、氫氧化鈉(優(yōu)級(jí)純)、濃鹽酸(分析純)：天津市致遠(yuǎn)化學(xué)試劑有限公司；無水乙醇(分析純)、葡萄糖(分析純)：天津永晟精細(xì)化工有限公司；麥芽酚標(biāo)品(北京普析)壓榨葵花籽粕：由中糧集團(tuán)油脂公司新疆分公司提供；浸出葵花籽粕：自制。

1.2 主要實(shí)驗(yàn)儀器

601型電熱恒溫水浴箱 金壇市醫(yī)療儀器廠；RE-52AA型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器 上海亞榮生化儀器廠；FA1004N型萬(wàn)分之一電子天平；TCL-80-2B型臺(tái)式低速離心機(jī) 上海楚柏實(shí)驗(yàn)室設(shè)備有限公司；RCT型電磁攪拌器、T10型均質(zhì)機(jī) IKA公司；KND-08C型消化爐 浙江托普儀器有限公司；紫外分光光度計(jì)。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 原料的品質(zhì)檢測(cè)

對(duì)2種葵花籽粕原料分別依照國(guó)標(biāo)GB 5009.5-2016，GB 5009.88-2014，GB/T 5512-2008，GB/T 5505-2008，GB 5009.3-2010進(jìn)行蛋白質(zhì)、總纖維素、殘油量、灰分、水分含量測(cè)定，依照文獻(xiàn)[7]利用硫酸-苯酚法測(cè)定其總糖含量。

1.3.2 原料制備與預(yù)處理

將油葵籽仁、壓榨粕于50～60 ℃烘干至恒重后，粉碎至40～60目，選用浸出制油企業(yè)常用的6號(hào)溶劑作為提取劑，料液比1∶10，恒溫65～70 ℃，水浴回流2 h后抽濾，濾餅于50 ℃烘干去除殘留溶劑。

將去除殘油后的葵花籽粕，參照文獻(xiàn)[8]的方法，用55%乙醇，料液比1∶10，72 ℃恒溫水浴回流2 h后抽濾，重復(fù)上述實(shí)驗(yàn)至55%乙醇溶液無色，保留濾渣。濾液含有綠原酸，棄去。將濾餅于55 ℃烘干作為后續(xù)實(shí)驗(yàn)的原料。

1.3.3 麥芽酚檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制與方法學(xué)考察

1.3.3.1 麥芽酚標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

參照文獻(xiàn)[9]所確立的麥芽酚檢測(cè)方法制作麥芽酚標(biāo)準(zhǔn)曲線對(duì)基于美拉德反應(yīng)合成的麥香味天然風(fēng)味物質(zhì)中麥芽酚的含量檢測(cè)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，標(biāo)準(zhǔn)曲線見圖1。

圖1 麥芽酚標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.1 Standard curve of maltol

1.3.3.2 方法學(xué)考察

繪制的麥芽酚標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為：y=0.8795X+0.0196，R=0.9995；進(jìn)行重復(fù)性檢測(cè)，RSD=1.37%；進(jìn)行精密度測(cè)試，RSD=0.84%；進(jìn)行加樣回收率測(cè)試，RSD=1.03%；進(jìn)行穩(wěn)定性測(cè)試，RSD=1.42%。該方程線性度、重復(fù)性、精密度、穩(wěn)定性良好，能滿足實(shí)驗(yàn)要求，后續(xù)實(shí)驗(yàn)可用該標(biāo)曲對(duì)葵花籽粕美拉德反應(yīng)合成風(fēng)味物質(zhì)中麥芽酚含量進(jìn)行準(zhǔn)確測(cè)定。

1.3.4 葵花籽粕堿水解產(chǎn)物美拉德反應(yīng)合成風(fēng)味物質(zhì)的風(fēng)味類型的確定實(shí)驗(yàn)

將1.3.1所得的2種預(yù)處理后的葵花籽粕原料每種各取2份，每份以3% NaOH水溶液，料液比1∶10，75 ℃恒溫水解2 h，所得水解液加入3%的葡萄糖混合均勻，80 ℃恒溫條件下合成1 h。品評(píng)所得美拉德產(chǎn)物風(fēng)味，了解其麥香味的濃郁程度、有無雜味和不適于食品添加的異味，設(shè)立感官評(píng)價(jià)表。

1.3.5 葵花籽粕堿水解產(chǎn)物美拉德反應(yīng)合成風(fēng)味物質(zhì)優(yōu)化工藝的確定

恒定預(yù)處理后葵花籽粕原料的物料量、反應(yīng)體系pH值、美拉德反應(yīng)合成溫度和時(shí)間，以堿液濃度、水解料液比、水解溫度、水解時(shí)間、糖加入量為考察因素，進(jìn)行單因素實(shí)驗(yàn)，所得產(chǎn)物按1.3.4制定的感官評(píng)價(jià)表進(jìn)行感官評(píng)定，了解堿水解條件、糖加入量的變化對(duì)美拉德合成風(fēng)味物質(zhì)的影響，確定合適的堿水解條件、糖加入量，在此基礎(chǔ)上，進(jìn)一步以物料量、美拉德反應(yīng)時(shí)間、反應(yīng)溫度、反應(yīng)體系pH值、糖濃度為考察因素，利用正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)安排實(shí)驗(yàn)，以感官評(píng)價(jià)得分為指標(biāo)確定葵花籽粕堿水解產(chǎn)物美拉德反應(yīng)合成具有麥香味的風(fēng)味物質(zhì)優(yōu)化反應(yīng)條件。

1.3.6 葵花籽粕堿水解產(chǎn)物美拉德反應(yīng)合成風(fēng)味物質(zhì)的微量元素含量測(cè)定和毒理學(xué)評(píng)價(jià)

1.3.6.1 合成風(fēng)味物質(zhì)的微量元素含量測(cè)定方法

參照國(guó)標(biāo)GB/T 9735-2008對(duì)合成風(fēng)味物質(zhì)微量金屬元素含量進(jìn)行測(cè)定，先精密稱定0.2030，0.2001，0.2015 g 3份加入硝酸-高氯酸(5∶1)混合酸25 mL，另外取混合酸25 mL加入錐形瓶中作空白對(duì)照，進(jìn)行消解，消解完全后分別用蒸餾水定容至50 mL作為檢測(cè)液，檢測(cè)的結(jié)果以3份平行樣品均值表示，檢測(cè)液微量元素含量由式(1)換算為合成風(fēng)味物質(zhì)中微量元素的含量(mg/g)。

合成風(fēng)味物質(zhì)中微量元素的百分含量計(jì)算公式：

微量元素含量(mg/g)=檢測(cè)液每毫升微量元素含量(μg)×50÷103÷0.2。

式(1)

1.3.6.2 合成風(fēng)味物質(zhì)的毒理學(xué)評(píng)價(jià)方法

根據(jù)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)《化學(xué)品急性經(jīng)口毒性試驗(yàn)方法》的最大限量法[10]，采用5/kg的劑量灌胃給藥。實(shí)驗(yàn)小鼠灌胃前禁食12 h，自由飲水，隨機(jī)分為2組，每組10只雌性小鼠，其中一組為等量空白樣品組，另一組為合成的風(fēng)味物質(zhì)凍干粉組。對(duì)各組小鼠進(jìn)行編號(hào)、稱重，每日灌胃1次，觀察14天，14天后對(duì)實(shí)驗(yàn)小鼠進(jìn)行大致解剖，求取臟器系數(shù)。

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析

2.1 原料的品質(zhì)檢測(cè)結(jié)果

依照1.3.1所確定的葵花籽粕原料品質(zhì)各因素測(cè)定方法進(jìn)行檢測(cè)，2種葵花籽粕原料的蛋白質(zhì)、總糖、總纖維素、殘油、灰分、水分含量見表1。

表1 葵花籽粕的品質(zhì)檢測(cè)數(shù)據(jù)Table 1 Quality inspection data of sunflower seed %

2.2 葵花籽粕堿水解產(chǎn)物美拉德反應(yīng)合成風(fēng)味物質(zhì)的感官評(píng)價(jià)表制定

按照1.3.4所確定的方法進(jìn)行美拉德反應(yīng)合成風(fēng)味物質(zhì)，所得產(chǎn)物邀請(qǐng)新疆職業(yè)大學(xué)烹飪學(xué)院西點(diǎn)焙烤技師及焙烤專業(yè)學(xué)生共20位對(duì)其風(fēng)味類型進(jìn)行感官確定，在此基礎(chǔ)上設(shè)定感官評(píng)定表，以便對(duì)后續(xù)合成產(chǎn)物進(jìn)行感官評(píng)分，葵花籽粕堿水解產(chǎn)物美拉德反應(yīng)合成風(fēng)味物質(zhì)的風(fēng)味類型評(píng)價(jià)結(jié)果見表2。

表2 葵花籽粕堿水解產(chǎn)物美拉德反應(yīng)合成風(fēng)味物質(zhì)的風(fēng)味類型評(píng)價(jià)結(jié)果表Table 2 Evaluation results of flavor types of Maillard reaction synthesized flavor substances of sunflower meal alkaline hydrolysis products

注：+表示微弱，++表示易聞得，++++表示濃烈，加*表示有個(gè)體差異。

由表2可知，該合成物風(fēng)味以麥香味為主(認(rèn)可度90%，濃烈)，夾雜少許果香味(認(rèn)可度40%，微弱)，有堿味(認(rèn)可度90%，易聞得)，但能給人有甜潤(rùn)味(認(rèn)可度70%，易聞得，但有個(gè)體差異)的感覺。堿味是不良風(fēng)味，感官評(píng)價(jià)表設(shè)定中予以負(fù)分值，麥香味、果香味、甜潤(rùn)味是良好風(fēng)味，感官評(píng)價(jià)表設(shè)定中予以正分值，作為一種風(fēng)味物質(zhì)，不同類型風(fēng)味復(fù)合的協(xié)調(diào)程度是重要的，故感官評(píng)價(jià)表設(shè)定中對(duì)葵花籽粕堿水解美拉德反應(yīng)合成風(fēng)味物質(zhì)的風(fēng)味協(xié)調(diào)性也做以考慮，不協(xié)調(diào)予以負(fù)分，協(xié)調(diào)予以正分。設(shè)定的感官評(píng)定表見表3。以表3對(duì)后續(xù)葵花籽粕堿水解產(chǎn)物美拉德反應(yīng)合成風(fēng)味物質(zhì)進(jìn)行感官評(píng)價(jià)。

表3 葵花籽粕水解產(chǎn)物美拉德反應(yīng)合成風(fēng)味物質(zhì)的感官評(píng)價(jià)表Table 3 Sensory evaluation table of Maillard reaction synthesized flavor substances of sunflower meal alkaline hydrolysis products

2.3 堿水解條件及美拉德反應(yīng)合成條件的單因素實(shí)驗(yàn)

2.3.1 pH對(duì)堿水解多肽美拉德產(chǎn)物風(fēng)味的影響

稱取20 g預(yù)處理后的葵花籽粕原料，與5% NaOH以料液比1∶10混合均勻，75 ℃條件下恒溫水解，水解液分別調(diào)pH至7，7.5，8[11]，加入3%的葡萄糖混合均勻，80 ℃恒溫條件下合成1 h，比較不同pH所合成美拉德產(chǎn)物風(fēng)味，結(jié)果見表4。

表4 堿水解多肽合成pH對(duì)美拉德產(chǎn)物風(fēng)味的影響Table 4 Effect of alkaline hydrolytic polypeptide synthesis pH on the flavor of Maillard products

注：+表示微弱，++表示易聞得，+++表示濃烈。

由表4可知，合成pH為7.5時(shí)所得美拉德產(chǎn)物的麥香味和甜潤(rùn)味都比較飽滿，堿味較淡，基本可以忽略。

2.3.2 溫度對(duì)堿水解多肽美拉德產(chǎn)物風(fēng)味的影響

堿水解制備多肽條件、合成反應(yīng)加入葡萄糖量、pH值、合成反應(yīng)時(shí)間與2.3.1相同，設(shè)定合成溫度為 70，80，90，100 ℃，比較不同合成溫度下所得美拉德產(chǎn)物的風(fēng)味，結(jié)果見表5。

表5 堿水解多肽合成溫度對(duì)美拉德產(chǎn)物風(fēng)味的影響Table 5 Effect of alkaline hydrolytic polypeptide synthesis temperature on the flavor of Maillard products

注：+表示微弱，++表示易聞得，+++表示濃烈。

由表5可知，100 ℃所得產(chǎn)物為佳，產(chǎn)物近乎沒有堿味，麥香味濃郁，甜潤(rùn)味較濃郁，香味物質(zhì)也主要在高溫環(huán)境下產(chǎn)生[12]。選用100 ℃能夠得到好的風(fēng)味物質(zhì)。

2.3.3 反應(yīng)時(shí)間對(duì)堿水解多肽美拉德產(chǎn)物風(fēng)味的影響

堿水解制備多肽條件、合成反應(yīng)加入葡萄糖量、pH值、合成反應(yīng)時(shí)間與2.3.1相同，將美拉德合成時(shí)間設(shè)為0.5，1，2，3 h，比較不同合成時(shí)間下所得美拉德產(chǎn)物風(fēng)味，結(jié)果見表6。

表6 堿水解多肽合成反應(yīng)時(shí)間對(duì)美拉德產(chǎn)物風(fēng)味的影響Table 6 Effect of alkaline hydrolytic polypeptide synthesis sugar on the flavor of Maillard products

注：+表示微弱，++表示易聞得，+++表示濃烈。

經(jīng)實(shí)驗(yàn)得知葵花籽粕美拉德合成反應(yīng)在前0.5 h不出現(xiàn)風(fēng)味，故合成反應(yīng)進(jìn)行0.5 h以上，合成反應(yīng)時(shí)間在2 h時(shí)，麥香味濃郁，甜潤(rùn)味足；合成反應(yīng)時(shí)間為3 h時(shí)，以堿水解多肽為底物的美拉德合成產(chǎn)物出現(xiàn)濃重的焦味；故其合成反應(yīng)時(shí)間應(yīng)該在0.5 h以上，3 h以下，2 h左右為宜。

2.4 堿水解條件及美拉德反應(yīng)合成條件的正交實(shí)驗(yàn)優(yōu)化

依據(jù)感官評(píng)價(jià)表3，以麥香味、果香味為評(píng)價(jià)指標(biāo)，綜合2.3堿水解單因素實(shí)驗(yàn)所得較優(yōu)條件，考慮各條件交叉可能會(huì)有好的風(fēng)味產(chǎn)生，同時(shí)考慮堿水解條件與后續(xù)美拉德反應(yīng)合成反應(yīng)條件，對(duì)每個(gè)實(shí)驗(yàn)因素設(shè)置不同水平，采用L16(45)正交表進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

2.4.1 堿水解多肽美拉德反應(yīng)合成風(fēng)味物質(zhì)正交實(shí)驗(yàn)因素及水平設(shè)置

正交實(shí)驗(yàn)因素和水平設(shè)置見表7。

表7 堿水解多肽美拉德反應(yīng)合成風(fēng)味物質(zhì)正交實(shí)驗(yàn)因素水平設(shè)置Table 7 Factors and levels related to the synthesis of flavor substances by Maillard reaction of alkaline hydrolytic polypeptide

2.4.2 堿水解多肽美拉德反應(yīng)正交實(shí)驗(yàn)及感官評(píng)價(jià)結(jié)果與分析

正交實(shí)驗(yàn)表見表8。

表8 堿水解多肽美拉德反應(yīng)正交實(shí)驗(yàn)及感官評(píng)價(jià)結(jié)果統(tǒng)計(jì)表Table 8 The orthogonal experiment table of Maillard synthesis of alkaline hydrolytic polypeptide and the statistical table of sensory evaluation results

第6號(hào)實(shí)驗(yàn)合成產(chǎn)物感官評(píng)價(jià)得分為18分，即堿水解葵花籽粕多肽美拉德反應(yīng)合成風(fēng)味物質(zhì)的最佳工藝條件為：以15 g的自制粕為原料經(jīng)過預(yù)處理后，用濃度為2%的NaOH水解6 h，制備所得的多肽加入葡萄糖的濃度為2%，在pH為6、恒定溫度為110 ℃的條件下進(jìn)行美拉德合成反應(yīng)，合成反應(yīng)時(shí)間為120 min，以此條件進(jìn)行重復(fù)放大實(shí)驗(yàn)，重復(fù)放大實(shí)驗(yàn)所得產(chǎn)物的風(fēng)味型與優(yōu)化實(shí)驗(yàn)所得產(chǎn)物相同。將合成產(chǎn)物冷凍干燥，凍干粉平均得率為27.8%。

2.4.3 合成風(fēng)味物質(zhì)凍干粉中麥芽酚含量的檢測(cè)

分別精密稱取合成風(fēng)味物質(zhì)6份，每份2.00 g左右，依照1.3.3.1繪制麥芽酚標(biāo)準(zhǔn)曲線的方法處理，進(jìn)行麥芽酚含量的檢測(cè)，測(cè)得的吸光度值代入麥芽酚標(biāo)準(zhǔn)曲線方程，計(jì)算風(fēng)味物質(zhì)中的麥芽酚濃度，再換算為樣品中的百分含量，結(jié)果見表9。

表9 合成風(fēng)味物質(zhì)中麥芽酚含量Table 9 Content of maltol in synthetic flavor substances

由表9可知，合成風(fēng)味物質(zhì)即葵花籽粕堿水解多肽加葡萄糖經(jīng)美拉德合成的風(fēng)味物質(zhì)凍干粉的麥芽酚百分含量為30.19%～33.58%。

2.5 合成風(fēng)味物質(zhì)的微量元素測(cè)定及安全性評(píng)價(jià)

2.5.1 合成風(fēng)味物質(zhì)的微量元素測(cè)定

表10 合成風(fēng)味物質(zhì)檢測(cè)液微量元素測(cè)定結(jié)果Table 10 Determination results of trace elements in synthetic flavoring substances μg/mL

表11 合成風(fēng)味物質(zhì)中微量元素的含量Table 11 Content of trace elements in synthetic flavor substances mg/g

由表11可知，利用葵花籽粕堿水解產(chǎn)物基于美拉德反應(yīng)合成的風(fēng)味物質(zhì)中有益元素鈣含量5.5362 mg/g、鐵含量0.4397 mg/g、鎂含量5.7233 mg/g、鋅含量0.0405 mg/g，食品中常見元素鉀含量2.1150 mg/g和鈉含量0.2503 mg/g，可能對(duì)人體造成危害的銅含量為0.0163 mg/g，錳含量為0.0103 mg/g，均在食品安全相關(guān)國(guó)標(biāo)的限量之下。

2.5.2 合成風(fēng)味物質(zhì)的毒理學(xué)評(píng)價(jià)結(jié)果

急性毒理學(xué)實(shí)驗(yàn)期間，對(duì)實(shí)驗(yàn)小鼠的行為狀態(tài)進(jìn)行細(xì)致的觀察，觀察結(jié)果見表12。

表12 合成風(fēng)味物質(zhì)毒理學(xué)實(shí)驗(yàn)小鼠行為觀察結(jié)果Table 12 Behavior observation results of mice in toxicological test of synthetic flavor substances

14天之后，對(duì)2組實(shí)驗(yàn)小鼠進(jìn)行病理學(xué)解剖并觀察臟器情況，計(jì)算臟器系數(shù)，結(jié)果見表13。

表13 實(shí)驗(yàn)小鼠臟器系數(shù)Table 13 Organ coefficient of experimental mice

對(duì)比練有文等[13]對(duì)BALB/c系裸小鼠臟器重量、臟器系數(shù)的測(cè)定數(shù)據(jù)，3組實(shí)驗(yàn)小鼠臟器系數(shù)均在標(biāo)準(zhǔn)的心體比、肝體比、脾體比、肺體比以及腎體比正常波動(dòng)區(qū)間之內(nèi)，且臟器顏色紅潤(rùn)，形態(tài)正常，無異常變化，故灌胃劑量為5 g/kg時(shí)合成的風(fēng)味物質(zhì)對(duì)實(shí)驗(yàn)小鼠的臟器無影響，按正常成年人體重60 kg計(jì)算，每日攝入量為300 g，屬于無毒。

3 結(jié)論

以感官評(píng)價(jià)得分為指標(biāo)，通過單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)合正交實(shí)驗(yàn)優(yōu)化確定的葵花籽粕堿水解產(chǎn)物美拉德反應(yīng)合成風(fēng)味物質(zhì)的工藝為：以15 g的自制粕為原料經(jīng)過脫除殘油、脫除綠原酸預(yù)處理后，用濃度為2%的NaOH水解6 h，制備所得的多肽加入葡萄糖的濃度為2%，在pH為6，恒定溫度為110 ℃的條件下進(jìn)行美拉德合成反應(yīng)，合成反應(yīng)時(shí)間為120 min。

對(duì)以優(yōu)化工藝合成的風(fēng)味物質(zhì)凍干粉進(jìn)行麥芽酚含量檢測(cè)，其中麥芽酚百分含量為30.19%～33.58%；結(jié)合合成風(fēng)味物質(zhì)微量元素檢測(cè)數(shù)據(jù)及毒理學(xué)評(píng)價(jià)結(jié)果對(duì)合成風(fēng)味物質(zhì)凍干粉的安全性進(jìn)行評(píng)價(jià)，該合成風(fēng)味物質(zhì)中可能對(duì)人體造成危害的銅、錳的含量均在食品安全相關(guān)國(guó)標(biāo)的限量之下，急性毒理實(shí)驗(yàn)證實(shí)按正常成年人體重60 kg計(jì)算，每日攝入量可達(dá)300 g，屬于無毒。

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