朱江煜，歐一琛，費(fèi)立天

(揚(yáng)州大學(xué) 食品科學(xué)與工程學(xué)院 營(yíng)養(yǎng)與食品衛(wèi)生學(xué)專業(yè)，江蘇 揚(yáng)州 225000)

豆豉是一種以黑豆或黃豆為主要原料的傳統(tǒng)發(fā)酵食物，口味獨(dú)特，營(yíng)養(yǎng)豐富，其中含有多種抗氧化成分，除少量的生育酚和維生素C外，還含有黃酮類和酚酸類化合物，以及在發(fā)酵過程中產(chǎn)生的多肽類和褐色色素類物質(zhì)等[1,2]。隨著人們生活質(zhì)量和消費(fèi)水平的提高，豆豉的生理保健功能越來越受到消費(fèi)者的重視，特別是抗氧化功能。有研究表明不同鹽濃度會(huì)對(duì)豆豉發(fā)酵的過程有所影響，從而導(dǎo)致抗氧化活性的變化。鹽濃度低，發(fā)酵周期短，產(chǎn)品易受微生物污染。鹽度太高則周期長(zhǎng)，且鹽分含量高對(duì)健康不利，不為廣大消費(fèi)者接受，因此合適的食鹽含量是發(fā)酵調(diào)味品生產(chǎn)的關(guān)鍵[3,4]。為了在發(fā)酵過程中更好地保證豆豉的抗氧化活性，本研究以黑豆為原材，研究了不同鹽濃度下，豆豉發(fā)酵過程中黃酮總量、鐵還原能力、羥自由基清除能力及DPPH自由基清除能力的變化，從而為豆豉工業(yè)化生產(chǎn)工藝優(yōu)化提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

原料：新鮮黑豆、食鹽，均為市售；米曲霉菌，來自揚(yáng)州大學(xué)微生物實(shí)驗(yàn)室。

1.2 試驗(yàn)試劑

磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉、碳酸鈉、鐵氰化鉀、三氯乙酸、氯化鐵、1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)、無水乙醇、水楊酸、硫酸亞鐵、過氧化氫、硝酸鋁、醋酸鉀，均為分析純。

1.3 儀器與設(shè)備

TG328型分析天平、5415D型臺(tái)式離心機(jī)、YQ-120A型超聲波振蕩儀、HQ11D型便攜式pH、G100/G200型水平式恒溫水浴鍋、101-1型干燥箱、722N型分光光度計(jì)、6202型多功能粉碎機(jī)。

1.4 試驗(yàn)方法

1.4.1 不同鹽濃度的豆豉的制作

取1.5 kg黑豆洗凈，常溫下浸泡7 h，放入滅菌鍋內(nèi)，在121 ℃下加熱30 min，降溫到40 ℃待用，然后分成4組，每組600 g蒸熟的黑豆，按4%，8%，12%，16%的鹽濃度加入食鹽，然后按黑豆重的0.2%接入米曲霉菌三級(jí)種，攪拌均勻后立即取樣，其余樣放入35 ℃恒溫箱內(nèi)，每隔3天取1次樣，第15天結(jié)束采樣。

1.4.2 樣液的準(zhǔn)備

將樣品從恒溫箱中取出，初步搗碎后放入鼓風(fēng)烘箱內(nèi)50 ℃恒溫干燥3～4 h，直至樣品水分低于10%后取出，用多功能粉碎機(jī)粉碎，按質(zhì)量比1∶30的比例加入80%的乙醇，進(jìn)行超聲提取30 min，離心后過濾，得待測(cè)樣液[5]。

1.4.3 黃酮總量的測(cè)定

黃酮類化合物和蘆丁母核相似，吸光度測(cè)試效果相同，故用蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算黃酮總量。

取5 mg蘆丁對(duì)照品于50 mL容量瓶中，用60%乙醇定容，得標(biāo)準(zhǔn)溶液。精密量取0，1.0，2.0，3.0，4.0，5.0 mL，加入到10 mL容量瓶中，加蒸餾水補(bǔ)足，使各容量瓶中均含有5 mL液體，然后精密稱取0.3 mL濃度為5%的亞硝酸溶液，混勻放置5 min后加入0.3 mL濃度為10%的硝酸鋁溶液，再次放置5 min后，加2 mL濃度為4%的氫氧化鈉溶液，添加蒸餾水至容量瓶刻度線定容，再靜置10 min后，以無蘆丁樣為空白，在510 nm處測(cè)定吸光度值，繪制蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線。

吸取待測(cè)標(biāo)準(zhǔn)液1.0 mL，置于50 mL容量瓶中，加95%的乙醇溶液至總體積為15 mL，依次加入硝酸鋁溶液1 mL、醋酸鉀溶液1 mL，搖勻，加水至刻度，搖勻，最后靜置1 h；以空白試液(精密吸取待測(cè)試料溶液1.0 mL，置于50 mL容量瓶中，加95%的乙醇溶液至總體積為15 mL，加水至刻度，搖勻)做參比，在415 nm處測(cè)定試料溶液的吸光度；根據(jù)所得標(biāo)準(zhǔn)曲線，按下式計(jì)算總黃酮含量[6]：

M=(m×d)/W。

式中：M為黃酮類化合物的總含量，mg/g；m為由標(biāo)準(zhǔn)曲線上查出的樣品比色液中蘆丁質(zhì)量濃度，mg/mL；W為樣品的質(zhì)量，g；d為稀釋比例。

1.4.4 鐵還原能力的測(cè)定

取2支試管，均加入2.5 mL磷酸鹽緩沖液(pH為6.6)和0.5 mL測(cè)試液，其中一支中加入2.5 mL 1%的鐵氰化鉀溶液，另一支中加入2.5 mL蒸餾水，搖勻后在50 ℃下水浴30 min，快速冷卻后均加入2.5 mL 10%三氯乙酸，然后放入離心機(jī)中在3000 r/min下離心10 min，取2.5 mL上清液，加入2.5 mL水以及0.5 mL 0.1%氯化鐵，靜置10 min后于700 nm處測(cè)定吸光度值，其中加鐵氰化鉀的樣液吸光度值記為Aa，加水的吸光度值記為Ab。

最后，Aa-Ab得到的吸光度差值A(chǔ)t可以用來判斷鐵還原能力的強(qiáng)弱：差值越大，鐵還原能力越強(qiáng)；差值越小，鐵還原能力越弱。

1.4.5 羥自由基清除能力的測(cè)定

取3支10 mL比色管，第1支中加入0.5 mL的 10 mmol/L水楊酸-乙醇溶液、0.5 mL的 10 mmol/L 硫酸亞鐵、0.5 mL的待測(cè)液、8 mL的水和0.5 mL的10 mmol/L過氧化氫，搖勻，室溫放置20 min，在510 nm處測(cè)定吸光度值，記為Ax。第2支中以0.5 mL樣品提取液溶劑代替待測(cè)液，第3支中以0.5 mL水代替過氧化氫，其余同第1支，吸光度值分別記為A0和Ax0。羥自由基清除率的計(jì)算公式如下[7]：

清除率(%)=[A0-(Ax-Ax0)]/A0×100。

1.4.6 DPPH自由基清除能力的測(cè)定

在試管中依次加入0.5 mL樣品提取液溶劑、3 mLDPPH產(chǎn)酸性蛋白酶乙醇溶液，混勻，避光，25 ℃水浴30 min，取出后在517 nm處測(cè)吸光度，記為Ai；以0.5 mL樣品加入3 mL無水乙醇按上述方法測(cè)吸光度，記為Aj；以0.5 mL溶劑加入3 mL DPPH乙醇溶液按上述方法測(cè)吸光度，記為Ac。測(cè)得數(shù)據(jù)后，清除率K的計(jì)算公式如下[8]：

K(%)=[Ac-(Ai-Aj)]/Ac×100。

1.5 數(shù)據(jù)處理

所有數(shù)據(jù)通過SPSS 19.0進(jìn)行處理，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。

2 結(jié)果與討論

2.1 黃酮總量的變化

根據(jù)分光光度計(jì)測(cè)得數(shù)據(jù)，繪制蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線，見圖1。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算出待測(cè)液中的黃酮總量，見圖2。

圖1 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線

圖2 不同鹽濃度豆豉發(fā)酵過程中黃酮總量

由圖2可知，同一鹽濃度的豆豉在發(fā)酵過程中其黃酮總量基本不變；不同鹽濃度豆豉的黃酮總量變化也不顯著。黃酮總量在1.51～1.78 mg/g之間，基本上處于不變的狀態(tài)，與前人結(jié)果相似[9]，細(xì)微的差異可能取決于原料豆的種類及酵母菌的差異。

盡管在本實(shí)驗(yàn)中發(fā)酵前后不同鹽濃度豆豉中黃酮總量并未發(fā)生明顯的變化，但根據(jù)宋永生等的研究[10]，發(fā)酵處理會(huì)導(dǎo)致豆豉中異黃酮成分的改變，經(jīng)過發(fā)酵處理的豆豉中黃豆苷元、染料木黃酮的含量會(huì)明顯增加，而黃豆苷、染料木苷的含量明顯降低。我們推斷，之所以發(fā)酵過程中黃酮總量最后沒有發(fā)生變化，可能是黃豆苷元、染料木黃酮的增加，抵消了黃豆苷、染料木苷的降低，最終導(dǎo)致黃酮總量基本沒受鹽濃度和發(fā)酵時(shí)間的影響。

雖然發(fā)酵處理對(duì)豆豉中異黃酮含量的影響并不顯著，但據(jù)報(bào)道，發(fā)酵作用下，糖苷型大豆異黃酮在β-葡萄糖苷酶的幫助下會(huì)部分轉(zhuǎn)化為游離型大豆異黃酮，使得游離型大豆異黃酮的含量明顯提高，糖苷型大豆異黃酮含量明顯降低。由于游離型大豆異黃酮的生物活性比糖苷型大豆異黃酮要高，所以發(fā)酵處理其實(shí)對(duì)于提高豆豉中黃酮物質(zhì)的生理活性十分有效；但隨著鹽濃度的升高，β-葡萄糖苷酶活性會(huì)受到抑制，游離型異黃酮含量降低，導(dǎo)致大豆異黃酮的生物活性也發(fā)生降低。所以，在發(fā)酵處理中，鹽度盡管對(duì)豆豉黃酮總量并未發(fā)生影響，但生物活性卻會(huì)受到影響。

2.2 鐵還原能力的變化

鐵還原能力由2組溶液測(cè)得的吸光度Aa和Ab的差值A(chǔ)t來判斷。差值A(chǔ)t越大，鐵還原能力越強(qiáng)；差值A(chǔ)t越小，鐵還原能力越弱。根據(jù)得到的數(shù)據(jù)，繪制成圖3。

圖3 不同鹽濃度豆豉發(fā)酵過程中鐵還原能力的變化

由圖3可知，在同一鹽濃度下，隨著發(fā)酵過程的進(jìn)行，豆豉的鐵還原能力會(huì)逐漸變強(qiáng)；處于同一發(fā)酵時(shí)間，豆豉的鐵還原能力會(huì)隨著鹽濃度的提升而下降。

各鹽濃度最后一次取樣時(shí)，吸光度差值均遠(yuǎn)高于發(fā)酵初期，原因可能在于發(fā)酵過程中，微生物在酶的幫助下不斷產(chǎn)生黃酮類和酚酸類化合物、還原性糖以及多肽類和褐色色素類物質(zhì)，它們不斷增加，導(dǎo)致鐵還原能力在發(fā)酵過程中不斷加強(qiáng)[11]。

此外，在同一時(shí)間，低鹽濃度發(fā)酵的豆豉其鐵還原能力顯著高于高鹽濃度發(fā)酵。4%鹽濃度的豆豉在第15天取樣時(shí)，其鐵還原能力最強(qiáng)，吸光度差值達(dá)到了0.637；而同一時(shí)間16%鹽濃度的豆豉其吸光度差值僅為0.475。因?yàn)辂}濃度越高，酶活性降低，對(duì)微生物抑制越強(qiáng)，導(dǎo)致高鹽濃度豆豉中的還原性糖和酚類物質(zhì)比低鹽濃度豆豉中的含量少很多，而還原性糖和酚類物質(zhì)對(duì)鐵還原能力有促進(jìn)作用，所以鐵還原能力也發(fā)生下降。

2.3 羥自由基和DPPH自由基清除能力的變化

羥自由基是一種在機(jī)體內(nèi)危害作用最大的活性氧自由基，羥自由基清除率是反映豆豉抗氧化能力的重要指標(biāo)[12]。在本實(shí)驗(yàn)中，采取水楊酸法來測(cè)定羥自由基的清除能力，結(jié)果見圖4。

圖4 不同鹽濃度豆豉發(fā)酵過程中羥自由基清除能力的變化

由圖4可知，在同一鹽濃度情況下，豆豉發(fā)酵時(shí)間越長(zhǎng)，羥自由基清除能力越強(qiáng)；而同一發(fā)酵時(shí)間，豆豉的羥自由基清除能力隨著鹽分的提升而變?nèi)酢Ｔ诘?5天時(shí)，4%鹽濃度的豆豉提取物的羥自由基清除率為35.72%，而16%鹽濃度的豆豉提取物中，其羥自由基清除率僅為22.32%。

圖5 不同鹽濃度豆豉發(fā)酵過程中DPPH自由基清除能力的變化

DPPH自由基清除能力的變化也基本一致。由圖5可知，剛蒸煮完畢的黑豆(0 天)及發(fā)酵處理15 天后的豆豉對(duì)DPPH自由基均有一定的清除效果，而發(fā)酵處理過的豆豉提取液的清除率遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于未發(fā)酵的黑豆。這表明在黑豆及豆豉中，都存在著能夠作為電子供體的抗氧化性物質(zhì)，從而與自由基反應(yīng)使其結(jié)構(gòu)穩(wěn)定，中止自由鏈反應(yīng)，減少破壞，而在發(fā)酵過的豆豉中，這些抗氧化物質(zhì)的含量或種類是高于未經(jīng)發(fā)酵的豆豉的。此外，與羥自由基清除實(shí)驗(yàn)相似，在高鹽度下，豆豉的DPPH自由基清除能力也發(fā)生了降低，4%鹽濃度豆豉浸提液的DPPH自由基清除率高達(dá)58.67%，而16%鹽濃度中僅為36.35%，證明過量的鹽濃度可能會(huì)對(duì)這些抗氧化物質(zhì)的含量和種類產(chǎn)生一些負(fù)面影響。

存在于黑豆中可清除自由基的成分有黃酮類和酚酸類化合物等。黑豆在曲霉發(fā)酵過程中進(jìn)一步產(chǎn)生抗氧化物質(zhì)，黑豆中的蛋白質(zhì)和碳水化合物在多種酶的作用下進(jìn)一步分解為多肽類、褐色色素類物質(zhì)和還原性糖，此外，那些黃酮類化合物在β-葡萄糖苷酶的作用下會(huì)部分轉(zhuǎn)化為游離型異黃酮，其生物活性比糖苷型異黃酮要高[13]。這也解釋了發(fā)酵15天的豆豉的自由基清除能力高于未經(jīng)發(fā)酵的黑豆的原因。此外，鹽濃度也是影響豆豉自由基清除能力的關(guān)鍵，高鹽濃度下，許多酶和微生物受到抑制，這些清除自由基的活性物質(zhì)的產(chǎn)生也會(huì)相應(yīng)減少[14]。

3 結(jié)論

在本實(shí)驗(yàn)中，通過不同鹽濃度豆豉發(fā)酵前后黃酮總量、鐵還原能力、羥自由基及DPPH自由基清除實(shí)驗(yàn)，最終得出以下結(jié)論：

豆豉在發(fā)酵過程中，其抗氧化活性得到很大的提升。

低鹽濃度發(fā)酵的豆豉的抗氧化性優(yōu)于高鹽濃度的，本實(shí)驗(yàn)中最佳鹽濃度為4%，在發(fā)酵15天后各抗氧化性指標(biāo)達(dá)到最高，黃酮總量為1.62 mg/g，鐵還原實(shí)驗(yàn)吸光度差值為0.637，羥自由基清除率達(dá)到35.72%，DPPH自由基清除率達(dá)到58.67%。

低鹽發(fā)酵避免了高鹽量對(duì)身體的不利影響，同時(shí)也保證了豆豉抗氧化性的最佳狀態(tài)，但低鹽發(fā)酵也會(huì)面臨著發(fā)酵周期長(zhǎng)，不易保藏，風(fēng)味易受到影響的問題，我們正致力于進(jìn)一步優(yōu)化豆豉的低鹽發(fā)酵，在保證生理活性的同時(shí)，也可以兼顧其他品質(zhì)的要求，以更好地適應(yīng)豆豉的商品化和市場(chǎng)化[15]。

參考文獻(xiàn)：

[1]?ztürk M,Duru M E,Kivrak O,et al.In vitro antioxidant,anticholinesterase and antimicrobial activity studies on threeAgaricusspecies with fatty acid compositions and iron contents:a comparative study on the three most edible mushrooms[J].Food & Chemical Toxicology,2011,49(6):1353-1360.

[2]孫森.天然發(fā)酵豆豉后發(fā)酵過程的動(dòng)態(tài)分析[D].濟(jì)南：齊魯工業(yè)大學(xué),2008.

[3]邢蓬蕊,張曉崢,于鑫,等.青蒿發(fā)酵豆豉與傳統(tǒng)發(fā)酵豆豉中大豆異黃酮含量研究比較[J].泰山醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào),2014(9):917-918.

[4]范琳.毛霉型豆豉后發(fā)酵過程中微生態(tài)的變化及抗氧化性研究[D].長(zhǎng)沙：湖南農(nóng)業(yè)大學(xué),2013.

[5]孫森,宋俊梅,曲靜然.鹽度對(duì)豆豉后發(fā)酵周期的影響[J].山東食品發(fā)酵,2008(2):38-41.

[6]龐慶芳,張炳文,孫愛東.中國(guó)傳統(tǒng)大豆發(fā)酵食品——豆豉功能成分的研究進(jìn)展[J].食品研究與開發(fā),2006,27(2):185-187.

[7]林榕姍.細(xì)菌型豆豉發(fā)酵機(jī)理及功能性研究[D].泰安：山東農(nóng)業(yè)大學(xué),2012.

[8]索化夷,盧露,吳佳敏,等.永川豆豉在傳統(tǒng)發(fā)酵過程中基本成分及蛋白酶活性變化[J].食品科學(xué),2011,32(1):177-180.

[9]張炳文,宋永生,郝征紅,等.發(fā)酵處理對(duì)大豆制品中異黃酮含量與組分的影響[J].食品與發(fā)酵工業(yè),2002,28(7):6-9.

[10]宋永生,張炳文,郝征紅,等.發(fā)酵處理對(duì)豆豉抗氧化活性影響的研究[J].食品科學(xué),2002,23(8):263-267.

[11]汪孟娟,陳廷濤,姜淑英,等.豆豉發(fā)酵中的微生物和功能性組分研究動(dòng)態(tài)[J].中國(guó)微生態(tài)學(xué)雜志,2010,22(1):81-84.

[12]劉錦繡,陳偉,程芳,等.混合菌種發(fā)酵對(duì)豆豉抗氧化性影響的研究[J].中國(guó)糧油學(xué)報(bào),2013,28(4):17-21.

[13]蘇悟,鄭小芬,徐睿烜,等.1種細(xì)菌型豆豉自然發(fā)酵過程中生物胺的變化[J].食品與發(fā)酵工業(yè),2014(7):40-45.

[14]盧露,鄭曉瑩.豆豉發(fā)酵中微生物及其功能研究進(jìn)展[J].糧食與食品工業(yè),2011,18(1):42-45.

[15]薄芯,李京霞,葉磊.豆豉低鹽固態(tài)發(fā)酵過程中部分成分的轉(zhuǎn)化初探[J].北京聯(lián)合大學(xué)學(xué)報(bào)：自然科學(xué)版,2012,26(1):46-50.