宋延明， 馮國(guó)清， 李倩倩， 察雪湘

(鄭州大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院， 河南 鄭州 450001)

心肌缺血再灌注損傷(ischemic reperfusion injury，IRI)指心肌局部缺血后再灌注，心肌功能不僅沒(méi)有恢復(fù)，反而使得缺血所致?lián)p傷進(jìn)一步加重的現(xiàn)象[1]。根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，IRI涉及到多種機(jī)制[2]，其中內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激(endoplasmic reticulum stress，ERS)誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡是其重要機(jī)制之一。ERS指內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的穩(wěn)態(tài)受到干擾，導(dǎo)致功能異常，最后未折疊和錯(cuò)誤折疊的蛋白聚集在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上，并伴隨著Ca2+平衡的失調(diào)[3-4]。缺血再灌注損傷、氧化應(yīng)激或外界壓力負(fù)荷增大等刺激都會(huì)誘導(dǎo)細(xì)胞ERS的產(chǎn)生，從而激活ERS相關(guān)凋亡通路[5]。

巴戟天屬草科藤植物，為“四大南藥”之一，具有補(bǔ)腎壯陽(yáng)和祛風(fēng)濕的功效。本研究團(tuán)隊(duì)對(duì)巴戟天寡糖混合物進(jìn)行提純得到菊淀粉型聚糖和呋喃糖，并經(jīng)前期研究發(fā)現(xiàn)，巴戟天寡糖單體HexB具有促進(jìn)心臟血管生長(zhǎng)作用并可以減輕缺氧/復(fù)氧(hypoxia/reoxygenation，H/R)對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞造成的損傷[6-8]，并經(jīng)激光共聚焦實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)HexB可結(jié)合于細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上。然而HexB的上述作用是否是通過(guò)調(diào)控內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激所產(chǎn)生，尚未經(jīng)實(shí)驗(yàn)證實(shí)。

本實(shí)驗(yàn)采用人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(human umbilical vein endothelial cells，HUVECs)為研究對(duì)象建造H/R模型。CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞的存活率，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞的凋亡率，Western blot法檢測(cè)ERS標(biāo)志分子葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白78(glucose-regulated protein 78，GRP78)和C/EBP同源蛋白(C/EBP homology protein，CHOP)、凋亡相關(guān)蛋白caspase-12及磷酸化 c-Jun氨基末端激酶(phosphorylated c-Jun NH2-terminal kinase，p-JNK)的表達(dá)。本實(shí)驗(yàn)中同時(shí)利用ERS抑制劑4-苯基丁酸(4-phenylbutyric acid，4-PBA)和ERS誘導(dǎo)劑毒胡蘿卜素(thapsigargin，TG)作為對(duì)照，進(jìn)一步闡述HexB減輕H/R損傷HUVECs的機(jī)制，為以后基于此單體新藥的開(kāi)發(fā)提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

材 料 和 方 法

1 細(xì)胞株

HUVECs由鄭州大學(xué)生物工程系祁元明教授惠贈(zèng)。

2 主要試劑和儀器

巴戟天寡糖單體HexB(純度>95%，日本北海道大學(xué)姚閔教授協(xié)助提純)；胎牛血清購(gòu)自四季青生物材料有限公司；CCK-8試劑盒購(gòu)自碧云天生物技術(shù)研究所；細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒購(gòu)自天津三箭生物技術(shù)股份有限公司；RPMI-1640培養(yǎng)基、胰蛋白酶、BCA試劑盒、ECL超敏發(fā)光液和蛋白上樣緩沖液購(gòu)自Solarbio；TG和4-PBA購(gòu)自Sigma；蛋白電泳分子量標(biāo)志物購(gòu)自Thermo；辣根過(guò)氧化酶標(biāo)記山羊抗兔II 抗購(gòu)自EarthOx；兔抗人caspase-12多克隆抗體購(gòu)自武漢博士德生物工程有限公司；兔抗人CHOP單克隆抗體購(gòu)自Abcam；兔抗人p-JNK、GAPDH和GRP78單克隆抗體購(gòu)自CST。

BD Accuri C6型流式細(xì)胞分析儀(碧迪醫(yī)療器械有限公司)；酶標(biāo)儀(Bio-Rad)；倒置顯微鏡(Nikon)；CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱(Thermo)；Western blot電泳儀(Bio-Rad)。

3 主要方法

3.1細(xì)胞培養(yǎng)及分組 復(fù)蘇細(xì)胞于培養(yǎng)瓶中，加入4 mL含10%新生牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基，并置于細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。選取第3～5代生長(zhǎng)狀態(tài)良好的細(xì)胞用于后續(xù)的實(shí)驗(yàn)。將細(xì)胞分為7組，對(duì)照(control)組、HexB組、H/R組、HexB+H/R組、4-PBA+H/R、TG組和HexB+TG。各藥物均于H/R建模前加入細(xì)胞預(yù)處理：其中HexB(30 nmol/L)預(yù)處理24 h、4-PBA(2 mmol/L)預(yù)處理12 h、TG(2 μmol/L)預(yù)處理24 h。

3.2CCK-8法檢測(cè)HUVECs活力 各組細(xì)胞以每孔1×104個(gè)的密度接種于96孔板上，每孔加入100 μL培養(yǎng)液，同時(shí)設(shè)置對(duì)照組與空白組，每組8個(gè)復(fù)孔。細(xì)胞處理結(jié)束后，每孔加入10 μL的CCK-8試劑。放入培養(yǎng)箱反應(yīng)2 h后，用酶標(biāo)儀在450 nm處檢測(cè)吸光度(A)值，細(xì)胞存活率(%)=(A加藥組-A空白組)/(A對(duì)照組-A空白組)×100%，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

3.3Annexin V-FITC法檢測(cè)細(xì)胞凋亡率 用胰蛋白酶(不含EDTA)消化細(xì)胞，然后1 500 r/min離心5 min收集細(xì)胞，用PBS漂洗細(xì)胞2次，1 500 r/min離心5 min收集細(xì)胞于離心管中，然后每管加入500 μL的Binding Buffer重懸細(xì)胞后依次加入5 μL Annexin V-FITC和10 μL碘化丙啶 (propidium iodide，PI)混合均勻，室溫避光反應(yīng)10 min，用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡率，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

3.4Western blot檢測(cè)GRP78、CHOP、caspase-12及p-JNK的蛋白水平 RIPA法裂解細(xì)胞，提取總蛋白，BCA試劑盒測(cè)定蛋白濃度，于-80 ℃保存。取上述蛋白進(jìn)行SDS-PAGE，將電泳分離后的蛋白轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜上。用脫脂牛奶在37 ℃搖床上封閉2 h，加入目標(biāo)蛋白 I 抗和內(nèi)參照GAPDH I 抗，在4 ℃冰箱中過(guò)夜孵育，加入辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記 II 抗在37 ℃孵育2 h后，用ECL化學(xué)發(fā)光法顯示。檢測(cè)條帶灰度值，并計(jì)算目標(biāo)蛋白條帶灰度值與相應(yīng)GAPDH條帶灰度值之比，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 17.0 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理和統(tǒng)計(jì)分析。數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示，單因素方差分析進(jìn)行多組間比較，SNK-q法進(jìn)行組間兩兩比較，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 各組HUVECs活力的分析

與control組相比，H/R組和TG組HUVECs的細(xì)胞活力明顯降低(P<0.05)；與H/R組比較，HexB+H/R和4-PBA+H/R組HUVECs的細(xì)胞活力明顯升高(P<0.05)；但是HexB+H/R組和4-PBA+H/R組兩組間細(xì)胞活力的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性；與TG組相比，HexB+TG組的細(xì)胞活力亦顯著升高(P<0.05)，見(jiàn)圖1。

Figure 1. The viability of HUVECs with different treatments was detected by CCK-8 assay. Mean±SD.n=3.*P<0.05vscontrol group;#P<0.05vsH/R group;&P<0.05vsTG group.

圖1CCK-8法檢測(cè)各組HUVECs的細(xì)胞活力

2 各組HUVECs凋亡率的分析

與control組相比，H/R組和TG組的細(xì)胞凋亡率顯著上升(P<0.05)；與H/R組相比，HexB+H/R組和4-PBA+H/R組的細(xì)胞凋亡率明顯降低(P<0.05)；HexB+H/R組和4-PBA+H/R組細(xì)胞凋亡率的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性；與TG組相比，HexB+TG組細(xì)胞的凋亡率明顯降低(P<0.05)，見(jiàn)圖2。

3 各組GRP78、CHOP、caspase-12及p-JNK蛋白水平的分析

與control組相比，H/R組和TG組的GRP78、CHOP、caspase-12及p-JNK的蛋白水平明顯升高(P<0.05)；與H/R組相比，HexB+H/R組和4-PBA+H/R組的GRP78、CHOP、caspase-12及p-JNK的蛋白水平明顯降低(P<0.05)；HexB+H/R組和4-PBA+H/R組的GRP78、CHOP、caspase-12及p-JNK蛋白水平的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性；與TG組相比，HexB+TG組GRP78、CHOP、caspase-12及p-JNK的蛋白水平明顯降低(P<0.05)，見(jiàn)圖3。

討 論

缺血再灌注損傷的機(jī)制是復(fù)雜的，研究發(fā)現(xiàn)其病理學(xué)過(guò)程涉及到多條凋亡相關(guān)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，其中，線(xiàn)粒體凋亡途徑、死亡受體凋亡途徑和ERS凋亡途徑被稱(chēng)為3大凋亡通路[1]。

內(nèi)質(zhì)網(wǎng)是整合細(xì)胞損傷和凋亡信號(hào)的重要細(xì)胞器[9]，在對(duì)細(xì)胞凋亡的研究中，ERS在細(xì)胞凋亡中所扮演的角色已經(jīng)逐漸清晰[10-11]。與ERS相關(guān)的凋亡通路主要有3條：CHOP、JNK以及caspase-12通路[12]。有文獻(xiàn)指出，如果ERS反應(yīng)持續(xù)時(shí)間較長(zhǎng)，便會(huì)誘發(fā)細(xì)胞的凋亡，此時(shí)3條細(xì)胞凋亡通路即CHOP、JNK以及caspase-12凋亡途徑被激活[13]。其中，CHOP和caspase-12的激活是觸發(fā)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)凋亡途徑的特異性信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路[14]。有研究證實(shí)通過(guò)抑制ERS相關(guān)凋亡途徑可抑制H/R所誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡[15-16]。Yu等[17]和Gao[1]等通過(guò)實(shí)驗(yàn)也進(jìn)一步證實(shí)了上述結(jié)果。

那么，HexB是否也是通過(guò)抑制ERS途徑減輕H/R誘導(dǎo)HUVECs損傷的呢？本研究發(fā)現(xiàn)與對(duì)照組相比，HUVECs缺氧復(fù)氧后，細(xì)胞活力明顯降低，細(xì)胞凋亡率顯著升高，ERS相關(guān)蛋白GRP78、CHOP、caspase-12和p-JNK表達(dá)顯著增加，說(shuō)明ERS相關(guān)凋亡通路被激活并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。

為證實(shí)HexB可以通過(guò)抑制ERS發(fā)揮保護(hù)HUVECs作用，本實(shí)驗(yàn)在TG誘導(dǎo)細(xì)胞之前，對(duì)細(xì)胞進(jìn)行了HexB的預(yù)處理，結(jié)果表明，HexB可以顯著抑制TG誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡及細(xì)胞活力下降，同時(shí)降低GRP78、CHOP、caspase-12和p-JNK蛋白表達(dá)。為進(jìn)一步探討HexB抑制ERS相關(guān)凋亡途徑的作用，本實(shí)驗(yàn)在細(xì)胞缺氧復(fù)氧前，對(duì)其進(jìn)行ERS抑制劑4-PBA的預(yù)處理，結(jié)果表明其可顯著降低缺氧復(fù)氧誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡，并提高細(xì)胞的活力，抑制GRP78、CHOP、caspase-12和p-JNK蛋白表達(dá)。

綜上所述，本研究證明HexB可以通過(guò)抑制ERS發(fā)揮保護(hù)HUVECs的作用，其作用機(jī)制與抑制ERS相關(guān)的CHOP、caspase-12和JNK凋亡通路有關(guān)。

Figure 2. The apoptotic rate of the HUVECs with different treatments anayzed by flow cytometry. Mean±SD.n=3.*P<0.05vscontrol group;#P<0.05vsH/R group;&P<0.05vsTG group.

圖2流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)各組HUVECs的凋亡率變化

Figure 3. The protein levels of GRP78, CHOP, caspase-12 and p-JNK in the HUVECs with different treatments determined by Wes-tern blot. Mean±SD.n=3.*P<0.05vscontrol group;#P<0.05vsH/R group;&P<0.05vsTG group.

圖3Westernblot檢測(cè)各組HUVECs中GRP78、CHOP、caspase-12及p-JNK的蛋白水平

[參 考 文 獻(xiàn)]

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