胡東昊， 劉鳳云， 謝金枝， 李偉宏

(1焦作職工醫(yī)學院， 河南 焦作 454150； 2鄭州澍青醫(yī)學高等專科學校， 河南 鄭州 450064)

在全球范圍內，惡性腫瘤的發(fā)病率和死亡率一直很高，環(huán)境污染、生活習慣和人口老齡化等多種因素導致全球腫瘤患者繼續(xù)增多。腫瘤的免疫治療是通過激發(fā)和增強機體的免疫功能來控制和殺死腫瘤細胞[1]，這是繼手術、化療和放療后一種有效的輔助治療。隨著腫瘤免疫治療的發(fā)展，這一治療方法越來越為人們看重。腫瘤的免疫治療具有特異性強和副作用小的優(yōu)點[2]。腫瘤的免疫治療和腫瘤多肽疫苗的研究的前提條件是找到有效的腫瘤抗原特異性CTL表位。黑色素瘤相關抗原C2(melanoma-associated antigen C2,MAGEC2)是一種新型癌-睪丸(cancer-testis，CT)抗原。在正常組織中，僅在睪丸中檢測到MAGEC2 的mRNA表達；但是在肝癌、惡性黑色素瘤和膀胱癌中具有高水平的MAGEC2表達[3-5]。用于腫瘤患者的肽疫苗目前正處于臨床研究的活躍階段。然而，基于肽的免疫治療受人類白細胞抗原(human leukocyte antigen，HLA)-A等位基因的高度限制。在中國人群中，HLA-A2超型占45%左右，HLA-A3超型超過50%[6]，所以尋找并鑒定MAGEC2的HLA-A3限制性細胞毒性T淋巴細胞(cytotoxic T-lymphocyte,CTL)表位對腫瘤的免疫治療具有重要意義。本次研究使用BIMAS、SYFPEITHI和IEDB等生物信息學軟件進行綜合預測[7-9]，篩選出綜合打分較高的表位，并通過鑒定篩選出MAGEC2的HLA-A3限制性CTL表位。

材 料 和 方 法

1 材料

T2A3細胞由焦作職工醫(yī)學院實驗室常規(guī)保存，采用37 ℃、5% CO2飽和濕度培養(yǎng)條件下常規(guī)培養(yǎng)。人外周血單個核細胞(peripheral blood mononuclear cells，PBMCs)由HLA-A3+健康供者捐贈。HLA-A3+外周血健康供者來自醫(yī)院尋找的健康志愿者。

2 方法

2.1HLA-A3限制性CTL表位肽的預測 使用BIMAS(https://www-bimas.cit.nih.gov/molbio/hla_bind/)、SYFPEITHI(http://www.syfpeithi.de/bin/MHCServer.dll/EpitopePrediction.htm)和IEDB(http://tools.iedb.org/main/tcell/)軟件對MAGEC2氨基酸序列進行預測打分，CTL表位限制性MHC類型為HLA-A*03，預測抗原肽長度為9 aa (nona-mers)。根據各個預測軟件所推選的前20個優(yōu)勢表位進行綜合選擇，選出在各種軟件打分較好的HLA-A3超型限制性表位。

2.2HLA-A3限制性CTL表位肽的合成 候選表位肽由上海生工生物工程有限公司合成，經高效液相色譜(high-performance liquid chromatography，HPLC)分析純化后，其純度>95%。采用電噴霧電離質譜(electrospray ionization mass spectrometry，ESI-MS)鑒定多肽，條件設置：噴霧器壓力為7.0或11.0 Psi；干燥器流速為4.0或8.0 L/min；溫度300 ℃；噴霧針電壓4.0 kV。G2025A Software A.02.01數據分析軟件檢測精肽的分子質量。

2.3表位肽與HLA-A3分子結合力實驗 收集T2A3細胞，用無血清RPMI-1640培養(yǎng)基洗3次，調整細胞密度至1×109/L，鋪于24孔板中(每孔1 mL)，每實驗孔加入待測肽50 μmol/L和β2-微球蛋白(Merck)3 mg/L，37 ℃、5% CO2共孵育18 h后，冷PBA洗滌3次，加入500 μL稀釋度為1 ∶100的單克隆抗體(鼠抗人β2-微球蛋白)，4 ℃避光靜置40 min。之后冷PBA洗滌3次，加入50 μL稀釋度為1 ∶50的FITC-羊抗鼠抗體溶液，4 ℃靜置40 min，PBA洗滌1次后上流式細胞儀檢測，結果用熒光系數(flourescence index，F(xiàn)I)表示。FI=(表位肽平均熒光強度-背景平均熒光強度)/背景平均熒光強度。FI>1.0表示高等結合力，0.5

2.4CTL的體外誘導 抽取20 mL健康志愿者血液，經常規(guī)聚蔗糖-泛影葡胺分層液梯度離心，獲取PBMCs，用含10%胎牛血清的IMDM培養(yǎng)基調整細胞濃度為1.5×109/L。第2天分別加入10 mg/L的候選肽共培養(yǎng)，第3天加入3×104U/L的重組人白細胞介素2(recombinant interleukin-2，rIL-2；Promega)繼續(xù)培養(yǎng)。每周收集細胞，1 000 r/min離心10 min，除去上清液，加入新鮮的含10%胎牛血清的IMDM培養(yǎng)基，同時加入上述條件的候選肽和rIL-2。刺激3輪后于最后 1 次刺激的第3天收集細胞。調整細胞密度作為效應細胞，荷肽的T2A3細胞作為靶細胞，用無血清IMDM培養(yǎng)基調整細胞密度[11]。

2.5干擾素γ(interferon-γ，IFN-γ)分泌水平的檢測 取出酶聯(lián)免疫斑點(enzyme-linked immunospot，ELISPOT)實驗板條(購自達科為生物技術有限公司)，加200 μL無血清的IMDM培養(yǎng)基進行封閉，靜置10 min；誘導的CTL作為效應細胞，荷肽的T2A3細胞作為刺激細胞，細胞密度均調整為2×109/L；設立對照孔和實驗孔；37 ℃、5% CO2孵育18 h；傾盡孔中培養(yǎng)基，每孔加入200 μL無菌的去離子水，4 ℃ 裂解細胞10 min；傾盡孔內液體，加入200 μL 1×Washing Buffer 洗滌6次，每次停留60 s；加入 100 μL生物素標記的抗體，37 ℃ 孵育1 h；傾盡孔內液體，加入200 μL 1×Washing Buffer進行洗滌，方法同上，在吸水紙上拍干；加入100 μL酶聯(lián)親和素，37 ℃ 孵育1 h；每孔加入200 μL 1×Washing Buffer進行洗滌，方法同上；加入100 μL現(xiàn)配的AEC顯色液，25 ℃避光靜置30 min；結束后置于通風處，室溫靜置干燥；結果用 ELISPOT 圖像分析儀計數 96 孔板中每孔的斑點數。

2.6乳酸脫氫酶(lactate dehydrogenase，LDH)細胞毒活性檢測 調整CTL密度為5×109/L；荷肽的T2A3細胞作為靶細胞，調整靶細胞密度為1×108/L；按50 ∶1、25 ∶1和12.5 ∶1的不同效靶比鋪于96孔板中，同時設立效應細胞自發(fā)釋放組、靶細胞自發(fā)釋放組、靶細胞最大釋放組、體積校正組和背景對照組，每孔終體積為100 μL。37 ℃、5% CO2培養(yǎng)4 h。于孵育結束前45 min，在靶細胞最大釋放組及體積校正組中加入10 μL裂解液。1 000 r/min離心4 min，轉移50 μL上清至另一干凈96孔板中，每孔加入50 μL底物混合液，室溫避光孵育30 min；每孔再加入50 μL終止液。用酶標儀檢測其在490 nm波長處的吸光度(A)。殺傷率(%)=(實驗孔A值-效應細胞自發(fā)釋放A值-CTL自發(fā)釋放A值)/(靶細胞A值-效應細胞自發(fā)釋放A值)×100%。

2.7羧基熒光素琥珀酰亞胺酯(carboxyfluorescein succinimidyl ester,CFSE)熒光染色檢測細胞毒性實驗 離心收集靶細胞，并將細胞重懸于含有1%FCS的PBS中，并將細胞密度調節(jié)至1×109/L。致敏靶細胞：每1 mL細胞懸浮液加入0.5 μL 5 mmol/L CFSE(購自Sigma)，室溫，光照孵育4 min。對照靶細胞：每1 mL細胞懸液中加入0.5 μL 100 μmol/L CFSE，室溫，光照孵育4 min。將細胞用5% FCS-PBS洗滌1次，離心并除去上清液，將細胞重懸于無血清IMDM培養(yǎng)基中。將效應細胞在無血清IMDM培養(yǎng)基中洗滌1次，并以(1.25～5.00)×109/L的密度重懸于無血清IMDM培養(yǎng)基中。將效應細胞與致敏的靶細胞(效靶比分別為12.5 ∶1、25 ∶1和50 ∶1)在離心管中混合，靶細胞數為2×104，在37 ℃溫育4 h 孵育后，用含有1% FCS和0.1%疊氮化鈉的PBS(FACS)處理相同效靶比的致敏靶細胞組和對照靶細胞組，并用FACS洗滌。離心，重懸在含4%多聚甲醛的PBS溶液中，上流式細胞儀檢測。殺傷率(%)=(對照樣品中致敏靶細胞的數量-測試樣品中致敏靶細胞的數量)/對照樣品中致敏靶細胞的數量×100%。

3 統(tǒng)計學處理

實驗數據用均數±標準差(mean±SD)表示，采用單因素方差分析檢驗多組平均數之間的差別，采用SPSS 16.0標準版統(tǒng)計軟件包進行數據分析，用GraphPad Prism軟件繪圖，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

結 果

1 MAGEC2 HLA-A3限制性CTL表位的預測結果

為了預測MAGEC2開放閱讀框中潛在的HLA-A3超型限制性CTL表位，我們依據BIMAS、SYFPEITHI和IEDB軟件的結果，選取在各個預測軟件中分值排名靠前的表位肽，根據這3個預測軟件進行綜合打分，篩選出分值在各個軟件中打分較好的CTL表位肽，打分情況見表1。使用質譜儀測定候選表位肽的分子量，結果顯示各多肽分子量測定值與理論值相符，表明合成的多肽是我們所需要的目的肽，見表2。

表1 MAGEC2 HLA-A3限制性CTL表位預測結果

2 表位肽與HLA-A3分子結合力實驗結果

T2A3結合力實驗測試表位肽與HLA-A*03的結合能力。使用流式細胞術進行檢測，對所得到的數據進行處理，結果表明P147、P167、P196、P229和P251均具有較好的結合HLA-A*03的能力(FI>0.5)，見表2。

表2候選肽與HLA-A*03分子結合力結果

Table 2. The HLA-A*03 binding affinity of the peptides derived from MAGEC2

PeptideESI-MS[M+H]+CalculatedObservedFIP471046.21047.20.26P129937.9938.70.34P1401017.11018.50.37P1471103.41105.40.68P1671138.51139.30.76P1751122.41122.60.34P196950.0950.70.98P229996.3995.50.86P2321045.41046.50.45P251963.1964.20.88P2571035.11038.60.33HBcAg18-271155.31155.61.58

FI = [mean fluorescence intensity (MFI) of the peptide-MFI background]/MFI background.

3 IFN-γ分泌水平結果

為了檢測各表位肽是否可被MAGEC2抗原特異性的CD8+T細胞識別，根據結合力的實驗結果，我們選擇了較好結合力的多肽進行實驗，結果顯示P167、P196和P251多肽疫苗能檢測到特異性T細胞免疫，能分泌較多的IFN-γ，見圖1。

Figure 1. ELISPOT assay was conducted to measure the IFN-γ release by CTLs induced from the PBMCs of healthy donors. CTLs induced by PBS and HBcAg18-27were taken as negative controls. Mean±SD.n=3.*P<0.05,**P<0.01vsPBS group.

圖1ELISPOT法檢測MAGEC2候選表位肽誘導的特異性CTL分泌IFN-γ的能力

4 細胞毒實驗結果

根據IFN-γ分泌水平結果，我們將有效果的P167、P196和P251進行進一步的免疫活性檢測；P196和P251這2條候選肽誘導得到的CTL在效靶比為50 ∶1時對靶細胞的殺傷率較陰性對照組和無關肽組在效靶比為50 ∶1時對靶細胞的殺傷率均顯著升高(P<0.01)，見圖2。

5 CFSE熒光染色檢測細胞毒性實驗結果

候選肽所誘導產生的CTL，隨著效靶比的提高殺傷效果相應得到提高，P196和P251這2條候選肽誘導得到的CTL在效靶比為50∶1時對荷肽T2A3細胞的殺傷率分別較陰性對照組和無關肽組顯著升高(P<0.01)，見圖3。

討 論

隨著社會發(fā)展，日益突出的環(huán)境問題及人們生活方式的改變引發(fā)了一系列的健康問題，其中最為令人關注的問題之一就是有著上升趨勢的腫瘤發(fā)病率。腫瘤的手術摘除及放療、化療的聯(lián)合應用在臨床治療上有一定的治愈率，但術后的復發(fā)率及毒副作用也是困擾人們的問題之一。特別是惡性腫瘤，其高轉移性更是令人們束手無策。而隨著生物信息學及分子免疫學的發(fā)展，人們對人體免疫系統(tǒng)有了更深的認識，利用自身免疫系統(tǒng)來治療疾病已經成為可能。腫瘤的免疫治療作為一種新興的腫瘤治療方式引起了更多的關注[12-13]。

Figure 2. Specific lysis of target cells by the CTLs generated from the PBMCs of healthy donors. The levels of LDH release were detected.Mean±SD.n=3.*P<0.05,**P<0.01vsPBS group.

圖2候選肽P196和P251誘導得到的CTL在不同效靶比時對靶細胞的殺傷情況

Figure 3. Detection of antigen-specific cytotoxicity by FACS-CTL assay. Mean±SD.n=3.*P<0.05,**P<0.01vsPBS group.

圖3CFSE法檢測特異性CTL的體外細胞毒實驗結果

腫瘤疫苗作為腫瘤生物治療的重要組成部分，為腫瘤的治療和預防開辟了新途徑。近年來腫瘤疫苗的研究在國內外逐漸受到重視，并且得到了十分迅速的發(fā)展[14]。腫瘤疫苗的基本原理是通過激活患者自身的免疫系統(tǒng)，主要通過利用腫瘤細胞和腫瘤抗原物質誘導機體產生特異性細胞免疫或者體液免疫反應，增強機體的抗腫瘤能力，阻止腫瘤的生長、轉移擴散和復發(fā)，最終達到清除或抑制腫瘤的目的[15]。多肽疫苗近年來已經獲得了很多關注，在對抗腫瘤和病毒疾病是一種有效且安全的治療方式。針對腫瘤抗原的研究表明，在腫瘤細胞表面存在許多抗原多肽，這些抗原多肽可以有效地激發(fā)機體產生一系列針對該腫瘤細胞的免疫應答反應[16]。通過對腫瘤抗原編碼基因的序列分析，篩選其被 CD8+T淋巴細胞識別的抗原表位，構建多肽疫苗，能夠加強HLA 和 TCR 的結合，而且還可以通過氨基酸替換、改變肽的構象以及修飾氨基酸殘基等方法提高肽的免疫原性[17]。

近年來的研究報道顯示，用表達于腫瘤細胞表面的腫瘤抗原的 CTL 表位肽刺激機體可以很好的產生抗原特異性的 CTL 細胞，進而參與針對腫瘤的免疫應答并發(fā)揮出較好的抗腫瘤效應。反向免疫學方法被廣泛應用，并被證明是鑒定腫瘤相關肽的有效方法[18]。使用這種方法，已經從人類TAA鑒定了大量的CD8+T細胞表位，例如PBF[19]，PIWIL2[20]和MUC4[21]等。生物信息學的方法預測腫瘤表位，可以減少實驗的盲目性，對前期實驗的篩選很有幫助。BIMAS軟件是依據肽-MHC分子復合物的分裂半衰期原理來預測HLA限制性表位；SYFPEITHI軟件則是基于表位肽的一級結構及與MHC結合的長度和結和力等因素的預測手段。IEDB是基于序列的線性表位預測工具。因此將SYFPEITHI和BIMAS的預測結果結合然后綜合IEDB表位預測軟件打分結果分析。3種不同的在線預測軟件的使用，可以提高表位預測的準確性。

在本次研究中， P196和P251的免疫原性已在體外實驗中展示，結果顯示P196和P251能有效誘導MAGEC2+HLA-A3+限制性CTL，能夠識別和裂解自然遞呈野生型MAGEC2表位的靶細胞。但其在體內抗腫瘤免疫誘導中的效力仍有待確定。腫瘤表位肽在腫瘤治療中發(fā)揮了重要作用，但應該加大力度提高其治療潛力[22-23]。我們應該繼續(xù)探索具有抗腫瘤特性的新型表位肽，通過開發(fā)更多的肽庫和新技術來提高肽的腫瘤靶向能力。通過開發(fā)具有非天然氨基酸的新型肽，以提高其高度特異性和有效抗腫瘤活性，從而克服天然肽半衰期短的缺點。我們應該設計更可靠和有效的修飾策略，以提高生物活性肽的抗癌效果和結構穩(wěn)定性。納米技術也可以用于表位肽藥物的開發(fā)，它可以使表位肽持續(xù)釋放或者具有靶向功能[24]。

[參 考 文 獻]

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