馬旭園， 代志峰， 王慧超， 楊靜楠， 唐向陽， 康玉華， 丁春生， 李玉霞， 楊瑞林， 林旭紅△

(河南大學(xué) 1淮河醫(yī)院消化內(nèi)科， 2淮河醫(yī)院檢驗(yàn)科， 轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)中心， 3第一附屬醫(yī)院腎內(nèi)科， 河南 開封 475000)

潰瘍性結(jié)腸炎(ulcerate colitis，UC)的病因及發(fā)病機(jī)制至今仍未完全闡明，目前普遍認(rèn)為主要由環(huán)境因素、遺傳易感因素、腸道屏障功能障礙和免疫功能異常等多種因素相互作用所致，其中，慢性炎癥反應(yīng)和免疫應(yīng)答紊亂是造成UC的關(guān)鍵病理環(huán)節(jié)，而腸道內(nèi)菌群紊亂又是造成炎癥反應(yīng)和免疫應(yīng)答改變的重要因素，成為影響UC病變的重要因素。

生理情況下，腸道菌群保持相對(duì)穩(wěn)態(tài)，與宿主相互作用，在吸收營(yíng)養(yǎng)、抵抗病原體入侵及促進(jìn)維持正常免疫功能中發(fā)揮重要作用。細(xì)菌在宿主早期免疫-炎癥反應(yīng)系統(tǒng)成熟中發(fā)揮重要作用，與宿主建立有效的“交互對(duì)話”，因此細(xì)菌是早期最主要的導(dǎo)致慢性炎性紊亂如UC的環(huán)境因素。近年來，越來越多的研究認(rèn)識(shí)到，腸道菌群失調(diào)與UC的發(fā)生密切相關(guān)[1-2]，總體來講，炎癥性腸病(inflammatory bowel disease，IBD)患者腸道菌群特征性組成變化包括黏膜總菌變化，多樣性降低，伴隨疾病進(jìn)展早期菌群組成改變[3]，如具有爭(zhēng)議的侵襲性細(xì)菌(變形菌、梭桿菌和活潑瘤胃球菌)種類的增加，伴隨保護(hù)性菌(毛螺旋菌、雙歧桿菌、羅斯氏菌和薩特氏菌屬)數(shù)量下降[4]。且多數(shù)研究者都支持活動(dòng)期UC患者與健康對(duì)照者的腸道菌群存在差異，而緩解期UC患者與健康者的腸道菌群無差異這一觀點(diǎn)。因此，腸道菌群是控制UC進(jìn)一步發(fā)展的一個(gè)靶點(diǎn)。

目前，關(guān)于UC患者腸道菌群的研究因選擇的疾病病程不同、分期不同、治療與否而分析方法各異，再加上腸道菌群具有的復(fù)雜性，其完整的結(jié)構(gòu)與功能未能被完全了解，導(dǎo)致關(guān)于UC患者腸道需氧菌和常見厭氧菌的變化尚無統(tǒng)一認(rèn)識(shí)，其在宿主疾病發(fā)生中所起到的具體作用也尚未能完全闡明，且這些菌群的變化與患者腸黏膜病理改變的關(guān)系還不明確。目前國(guó)內(nèi)外相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道主要側(cè)重于某一類腸道菌群與UC的關(guān)系，并沒有全面進(jìn)行腸道內(nèi)常見菌群與UC相關(guān)性對(duì)比，因此，腸道菌群與UC的相關(guān)性研究仍面臨巨大挑戰(zhàn)。

本研究在前期工作的基礎(chǔ)上，采用涂片鏡檢、細(xì)菌培養(yǎng)、real-time PCR和免疫組化等方法分別對(duì)活動(dòng)期UC患者及正常健康人群糞便菌群進(jìn)行差異分析，并將白細(xì)胞介素23 (interleukin-23，IL-23)/IL-17與組織病理學(xué)和目標(biāo)菌群進(jìn)行相關(guān)性分析，旨在研究UC進(jìn)展過程中腸道主要菌群變化及其與IL-23/IL-17的關(guān)系，以期尋找UC相關(guān)的特異微生物種類或持續(xù)變化模式，對(duì)精確診斷提供指導(dǎo)意義，為臨床應(yīng)用抗生素及益生菌治療 UC 提供理論依據(jù)。

材 料 和 方 法

1 UC患者收集及臨床信息采集

根據(jù)2012年中華醫(yī)學(xué)會(huì)消化病學(xué)分會(huì)炎癥性腸病學(xué)組制定的《炎癥性腸病診斷與治療的共識(shí)意見》修訂的標(biāo)準(zhǔn)，收集我院2016年8月～2017年6月UC患者(同時(shí)行腸鏡檢查及病理活檢，病歷資料完整)20例進(jìn)行研究，其中，男13例，女7例，均為活動(dòng)性復(fù)發(fā)UC患者(曾接受氨基水楊酸類藥物治療)，留取標(biāo)本前4周內(nèi)均未應(yīng)用抗生素和微生態(tài)制劑等可能影響腸道菌群的藥物。核心臨床標(biāo)準(zhǔn)：入圍患者入院后行血液學(xué)檢測(cè)及結(jié)腸鏡檢查。排除標(biāo)準(zhǔn)為臨床資料不完整；伴有嚴(yán)重心、肝、肺、腎疾病患者；合并嚴(yán)重感染、糖尿病患者；合并UC并發(fā)癥患者；妊娠及哺乳期患者；合并腸外表現(xiàn)的患者；患有其他自身免疫性疾病患者。有以上任意一條均不納入本研究。同時(shí)收集20例本院體檢中心體檢健康者作為對(duì)照，男15例，女5例，無消化道慢性疾病史，常規(guī)體檢和糞常規(guī)檢查均未見異常。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1直接涂片鏡檢和菌群分析 取新鮮糞便標(biāo)本，2 h內(nèi)直接常規(guī)涂片(面積約1.5 cm±2.0 cm，厚度如血膜的菌膜)，干燥固定后革蘭染色，油鏡下觀察10個(gè)視野，根據(jù)每個(gè)油鏡視野細(xì)菌總數(shù)和各類細(xì)菌比例，判斷是否存在菌群失調(diào)及菌群失調(diào)程度，判斷和分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)參照《腸道菌群糞便涂片檢查圖譜》[5]。

2.2細(xì)菌培養(yǎng)鑒定 用10 μL接種環(huán)挑取新鮮糞便標(biāo)本，采用4區(qū)劃線法進(jìn)行接種。(1)需氧培養(yǎng)：接種血平板和中國(guó)藍(lán)平板，在5% CO2、37 ℃有氧環(huán)境中孵育24 h，使用全自動(dòng)細(xì)菌鑒定儀對(duì)平板上生長(zhǎng)的優(yōu)勢(shì)菌進(jìn)行菌種鑒定；(2)厭氧培養(yǎng)：接種厭氧血平板，在37 ℃無氧環(huán)境中(厭氧氣體發(fā)生袋，日本三菱 MGC AnaeroPack-3.5L)孵育48 h，挑取優(yōu)勢(shì)菌做耐氧實(shí)驗(yàn)，專性厭氧菌用API20A厭氧菌鑒定卡鑒定；(3)選擇性培養(yǎng)基：同時(shí)接種大腸桿菌(Escherichiacoli,E.coli)、腸球菌(Enterococcus)、擬桿菌(Bacteroidetes)、乳酸桿菌(Lactobacilli)和雙歧桿菌(Bifidobacteriumbifidum,B.bifidum)選擇性培養(yǎng)基培養(yǎng)。

2.3細(xì)菌real-time PCR熒光定量分析 將涂片及培

養(yǎng)剩余的糞便標(biāo)本置于-80 ℃保存，采用糞便DNA組提取試劑盒(TIANGEN，DP328-02)抽提糞便總DNA，具體方法按試劑盒說明書操作。提取的DNA測(cè)定濃度后保存于-20 ℃。應(yīng)用Real-Time PCR試劑盒(TaKaRa，RR820A)，將糞便DNA進(jìn)行擴(kuò)增，擴(kuò)增的細(xì)菌包括大腸桿菌、腸球菌、擬桿菌、雙歧桿菌和乳酸桿菌，每個(gè)標(biāo)本做復(fù)孔檢測(cè)。引物設(shè)計(jì)用Primer Premier 5.0軟件。各細(xì)菌引物具體見表1。

表1 Real-time PCR所用特異性引物

F: forward; R: reverse.

2.4血紅蛋白(hemoglobin)、白蛋白(albumin)、血沉(erythrocyte sedimentation rate，ESR)和C反應(yīng)蛋白(C-reactive protein，CRP)的測(cè)定 取患者空腹血標(biāo)本，常規(guī)測(cè)定血紅蛋白、白蛋白、血沉和C反應(yīng)蛋白水平。

2.5疾病臨床Mayo評(píng)分、Baron分級(jí)及結(jié)腸組織病理學(xué)分析 記錄患者一般情況、體重、大便量和性狀及精神狀態(tài)等，經(jīng)結(jié)腸鏡活檢取UC患者和健康體檢者腸黏膜組織。按照Mayo評(píng)分方法[6]，對(duì)疾病活動(dòng)度評(píng)分，具體評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)見表2，其中，總分<2分為癥狀緩解，3～5分為輕度活動(dòng)期，6～10分為中度活動(dòng)期，11～12分為重度活動(dòng)期。內(nèi)鏡下活動(dòng)度分級(jí)參照改良的Baron分級(jí)[7]，見表3。腸黏膜組織常規(guī)石蠟切片進(jìn)行HE染色，光鏡下觀察腸黏膜組織潰瘍形成、炎細(xì)胞浸潤(rùn)、充血和水腫等情況，并參照Siegmund等[8]評(píng)分方法進(jìn)行組織病理學(xué)評(píng)分，見表4。每個(gè)組織標(biāo)本選5張切片，每個(gè)切片隨機(jī)選擇4個(gè)視野。

表2 Mayo評(píng)分系統(tǒng)

表3 Baron分級(jí)評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)

表4 組織學(xué)評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)

2.6免疫組織化學(xué)法檢測(cè)結(jié)腸組織中IL-17和IL-23的表達(dá) 切片脫蠟至水化，3% H2O2阻斷內(nèi)源性過氧化物酶，微波修復(fù)抗原后，分別與IL-17和IL-23的 I 抗(Abcam，ab79056，ab45420)4 ℃孵育過夜，滴加 II 抗及辣根過氧化物酶標(biāo)記鏈霉卵白素工作液，DAB(博士德，AR1022)顯色，棕褐色反應(yīng)產(chǎn)物代表抗原定位。各蛋白表達(dá)的半定量用Image-Pro Plus軟件分析。

2.7Western blot法檢測(cè)結(jié)腸組織中IL-17和IL-23的表達(dá) 制備結(jié)腸組織樣品，用BCA蛋白定量試劑盒(碧云天，P0011-2)測(cè)定蛋白質(zhì)濃度；配制合適濃度的分離膠和5%的濃縮膠進(jìn)行SDS-PAGE，恒流150 mA轉(zhuǎn)膜55 min，5%牛奶(TBST配制)室溫封閉1.5 h，加 I 抗(Abcam，ab79056，ab45420)雜交，4 ℃ 孵育過夜，TBST洗膜，加入酶標(biāo) II 抗(Thermo，31460)，室溫孵育1 h，TBST洗膜，ECL發(fā)光液(康為世紀(jì)，CW0049M)曝片，Bio-Rad凝膠成像系統(tǒng)拍照，并根據(jù)Marker位置及蛋白分子量比對(duì)結(jié)果。內(nèi)參照用β-actin。使用軟件ImageJ分析蛋白條帶灰度值，目的蛋白的相對(duì)表達(dá)量用目的條帶灰度值與β-actin條帶灰度值的比值表示。

3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

應(yīng)用SPSS 11.5軟件對(duì)資料進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤(mean±SEM)表示，組間比較采用t檢驗(yàn);計(jì)數(shù)資料采用2檢驗(yàn);腸黏膜組織IL-17和IL-23表達(dá)的平均吸光度與Baron分級(jí)相關(guān)性采用Spearman相關(guān)分析，平均吸光度與病理組織學(xué)評(píng)分相關(guān)性采用Pearson相關(guān)分析，平均吸光度與腸球菌、擬桿菌、雙歧桿菌和乳酸桿菌熒光定量的相關(guān)性分析采用Pearson相關(guān)分析。以P<0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 直接涂片鏡檢和菌群分析

如圖1A所示，與對(duì)照組相比，活動(dòng)期UC患者球菌數(shù)量明顯增多，桿菌數(shù)量明顯減少，且菌群失調(diào)程度明顯升高；II度和III度失調(diào)的比例分別從對(duì)照組的10%和0%，升高至UC組的30%和25%，2組間差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見圖1B。

Figure 1. Results of direct smear and flora analysis for stool. A: the original image of the fecal smears (×1 000)； B: comparison of flora analysis.

圖1糞便直接涂片鏡檢和菌群分析結(jié)果

2 細(xì)菌培養(yǎng)鑒定

需氧培養(yǎng)結(jié)果表明，活動(dòng)期UC患者的需氧菌總數(shù)和單菌量均有明顯改變，其中大腸桿菌菌數(shù)較正常人顯著降低，腸球菌菌數(shù)明顯增加(P<0.01)，見圖2A；厭氧培養(yǎng)鑒定結(jié)果發(fā)現(xiàn)，厭氧菌總數(shù)減少，其中擬桿菌、雙歧桿菌和乳酸桿菌菌數(shù)較正常人顯著減少(P<0.01)，見圖2B。以上結(jié)果經(jīng)選擇性培養(yǎng)基進(jìn)行確認(rèn)，發(fā)現(xiàn)大腸桿菌在選擇性顯色培養(yǎng)基呈圓形、微凸、光滑、邊緣整齊，呈綠色光澤，UC患者的數(shù)量明顯降低；在PFIZER選擇性腸球菌瓊脂培養(yǎng)基上孵育48 h后，腸球菌形成圓形、扁平、表面凹陷、邊緣整齊的灰色菌落；擬桿菌在BDS培養(yǎng)基上孵育后，形成圓形、微凸、光滑、邊緣整齊、半透明、灰白色，不溶血的菌落；雙歧桿菌在專用瓊脂培養(yǎng)基孵育后，形成圓形、光滑、邊緣整齊、不透明、大部分顯白色的大小兩種菌落；乳酸桿菌在選擇性培養(yǎng)基孵育后，形成圓形、光滑、邊緣整齊，半透明、灰白色的菌落。UC患者的腸球菌、雙歧桿菌和乳酸桿菌數(shù)量明顯降低。

Figure 2. The analytic results of fecal bacterial cultures. A: selective cultures and the change rates ofEscherichiacoliandEnterococcus; B: selective cultures and the change rates ofBacteroidetes,BifidobacteriumbifidumandLactobacilli. Mean±SEM.n=20.**P<0.01vscontrol group.

圖2糞便細(xì)菌培養(yǎng)結(jié)果分析

3 細(xì)菌real-time PCR熒光定量分析

目標(biāo)菌屬定量分析表明，UC患者糞便中大腸桿菌相對(duì)定量較正常人顯著降低，腸球菌菌數(shù)明顯升高，擬桿菌、雙歧桿菌和乳酸桿菌菌數(shù)較正常人顯著減少(P<0.01)，見圖3。

4 血紅蛋白、白蛋白、血沉和C反應(yīng)蛋白水平

UC患者血紅蛋白較對(duì)照組無明顯改變，白蛋白較正常人明顯降低(P<0.05)，血沉和C反應(yīng)蛋白明顯增高(P<0.01)，見表5。

Figure 3. Quantitative analysis of fecal bacteria by real-time PCR. Mean±SEM.n=20.**P<0.01vscontrol group.

圖3細(xì)菌real-timePCR熒光定量分析

5 疾病臨床活動(dòng)度及組織病理積分

與正常組相比，UC患者M(jìn)ayo評(píng)分明顯增高(P<0.01)，Baron分級(jí)明顯增加(P<0.01)，見圖4A、B。HE染色結(jié)果表明，正常組結(jié)腸黏膜上皮細(xì)胞完整，腺體排列整齊緊密，富含杯狀細(xì)胞，固有層僅見少量散在的中性粒細(xì)胞及淋巴細(xì)胞，毛細(xì)血管無充血、擴(kuò)張；UC組結(jié)腸黏膜糜爛，腸黏膜受損，上皮細(xì)胞大量破壞，腺體破壞，排列紊亂，陷窩結(jié)構(gòu)破壞，杯狀細(xì)胞大量消失，固有層、肌層均可見大量中性粒細(xì)胞及淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)，毛細(xì)血管充血、擴(kuò)張，隱窩膿腫形成，并見多發(fā)潰瘍，甚者表面有膿苔，組織學(xué)評(píng)分明顯高于正常組(P<0.01)，見圖4C。

表5 各組常規(guī)指標(biāo)的比較

ESR: erythrocyte sedimentation rate;*P<0.05,**P<0.01vscontrol group

Figure 4. Mayo scoring (A), Baron grading (B) and HE staining (C) results. Mean±SEM.n=20.**P<0.01vscontrol group.

圖4Mayo評(píng)分、Baron分級(jí)及組織病理學(xué)結(jié)果

6 結(jié)腸組織中IL-17和IL-23的表達(dá)

免疫組化結(jié)果顯示，正常結(jié)腸黏膜組織IL-17和IL-23表達(dá)微弱，而病變結(jié)腸組織表達(dá)豐富的IL-17和IL-23，陽性表達(dá)主要位于黏膜上皮細(xì)胞和固有層單個(gè)核細(xì)胞，為胞漿染色，顆粒呈棕黃色，且固有層內(nèi)可見強(qiáng)陽性棕褐色顆粒聚集，平均吸光度均明顯升高(P<0.01)，見圖5。Western Blot結(jié)果表明，IL-17和IL-23蛋白表達(dá)水平較對(duì)照組均有明顯升高(P<0.01)，見圖6。

7 IL-17和IL-23表達(dá)與Baron分級(jí)及病理組織學(xué)積分的相關(guān)性

如表6所示，將IL-7和IL-23平均吸光度與Baron分級(jí)進(jìn)行Spearman相關(guān)分析，結(jié)果顯示，UC患者結(jié)腸黏膜組織中IL-17和IL-23表達(dá)的平均吸光度與Baron分級(jí)的相關(guān)系數(shù)分別為0.717(P=0.02)和0.849(P=0.016)，表明二者與內(nèi)鏡下活動(dòng)度分級(jí)呈正相關(guān)。另外，Pearson相關(guān)分析表明，UC患者結(jié)腸黏膜組織中IL-17和IL-23表達(dá)的平均吸光度與病理組織學(xué)評(píng)分的相關(guān)系數(shù)分別為0.660(P=0.030)和0.675(P=0.032)，提示二者與病理組織學(xué)評(píng)分亦呈正相關(guān)。

Figure 5. The protein levels of IL-17 and IL-23 in the colon detected by immunohistochemical staining(×400). Mean±SEM.n=20.**P<0.01vscontrol group.

圖5免疫組化檢測(cè)結(jié)腸組織IL-17和IL-23蛋白的表達(dá)水平及定位

8 IL-17和IL-23表達(dá)與大腸桿菌、腸球菌、擬桿菌、雙歧桿菌和乳酸桿菌熒光定量的相關(guān)性分析

Pearson相關(guān)分析表明，IL-23表達(dá)的平均吸光度與大腸桿菌數(shù)量呈負(fù)相關(guān)(r=-0.699，P=0.025)，與腸球菌數(shù)量呈正相關(guān)(r=0.872，P=0.010)，IL-17表達(dá)的平均吸光度與腸球菌數(shù)量呈正相關(guān)(r=0.764，P=0.046)，但二者與其他目標(biāo)菌屬的數(shù)量無明顯相關(guān)性，見表7。

討 論

體內(nèi)的腸道菌群構(gòu)成了一個(gè)極其復(fù)雜的腸道內(nèi)微生態(tài)系統(tǒng)，在宿主的腸道免疫系統(tǒng)、營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的合成與吸收、抑制致病菌等眾多方面均發(fā)揮著重要作用[9-10]。

有研究認(rèn)為，腸黏膜屏障功能障礙可能是UC發(fā)病的觸發(fā)扳機(jī)[11]，腸道菌群紊亂與異常免疫反應(yīng)介導(dǎo)之間的相互作用可能是導(dǎo)致腸粘膜功能障礙，參與 UC 發(fā)病的始動(dòng)因素[12]。將一些基因敲除或基因缺陷小鼠置于無菌環(huán)境中不會(huì)發(fā)生UC，置于正常腸道菌群中或予某些腸道菌群(如腸球菌)灌腸后可誘發(fā)UC[13]，證明了“無菌無炎癥”的觀點(diǎn)，提示腸道菌群成分是腸炎發(fā)病不可或缺的因素之一?，F(xiàn)已發(fā)現(xiàn)，多種細(xì)菌和病毒等病原體參與炎癥性腸病發(fā)病。Gradel 等[14]發(fā)現(xiàn)感染彎曲桿菌或沙門氏菌的患者易患IBD；Li等[1]觀察了16例健康人和41例UC患者糞菌，發(fā)現(xiàn)正常人糞便微生物多樣性明顯高于UC患者，與正常人、靜止期和輕度活動(dòng)期相比，中、重度活動(dòng)期患者糞菌中的主要類型明顯改變，且主要細(xì)菌的比例與疾病活動(dòng)呈負(fù)相關(guān)，UC患者產(chǎn)氣莢膜梭菌數(shù)量增加，屎腸桿菌、直腸桿菌數(shù)量減少；Rajili-Stojanovi等[15]應(yīng)用高重復(fù)率系統(tǒng)發(fā)育微陣列技術(shù)檢測(cè)15例UC患者和15例健康對(duì)照者糞菌，認(rèn)為UC患者糞菌組成明顯不同于健康對(duì)照，UC緩解期相關(guān)微生物相對(duì)穩(wěn)定，且在所有患者相似，在活動(dòng)期，菌群失調(diào)的主要標(biāo)志物有：梭菌屬IV簇細(xì)菌多樣性明顯降低，參與丁酸和丙酸代謝的細(xì)菌包括瘤胃球菌屬、直腸真桿菌、羅氏菌屬、阿克曼氏菌豐度降低，而條件致病菌梭菌屬、消化鏈球菌屬、螺桿菌、彎曲桿菌、艱難梭菌豐度升高。另有研究發(fā)現(xiàn)，幽門螺桿菌感染與IBD發(fā)病呈負(fù)相關(guān)，幽門螺桿菌通過多種機(jī)制使宿主受益，從而起到保護(hù)宿主免受IBD襲擊[16]。因此，基于不同的分析方法，對(duì)于活動(dòng)期UC患者腸道菌群組成，歷來的研究結(jié)果千差萬別。

Figure 6. The protein levels of IL-17 and IL-23 in the colon detected by Western blot. Mean±SEM.n=20.**P<0.01vscontrol group.

圖6Westernblot檢測(cè)結(jié)腸組織IL-17和IL-23蛋白的表達(dá)水平

表6IL-17和IL-23表達(dá)與Baron分級(jí)及組織病理學(xué)評(píng)分的相關(guān)性

Table 6. Correlations between IL-17/IL-23 expression and Baron grade as well as histopathological score

ProteinBarongradeHistopathologicalscorerPrPIL-170.7170.020.6600.030IL-230.8490.0160.6750.032

表7 IL-17和IL-23表達(dá)與目標(biāo)菌群的相關(guān)性

腸道菌群分析可反映腸道細(xì)菌的狀態(tài)，因此我們首先對(duì)各組標(biāo)本進(jìn)行糞便涂片、需氧及厭氧培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)2類菌均有不同程度的改變，其中，需氧菌總數(shù)增加，以大腸桿菌降低和腸球菌升高變化最為明顯；厭氧菌總數(shù)減少，主要表現(xiàn)為擬桿菌、雙歧桿菌和乳酸桿菌減少，這與國(guó)內(nèi)外文獻(xiàn)報(bào)道部分相似，從而大體水平上揭示UC患者腸道細(xì)菌的變化。為了驗(yàn)證以上結(jié)果，我們用以上需氧及厭氧菌的選擇性培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)與鑒定結(jié)果一致。同時(shí)，為全面反映腸道狀態(tài)，本研究選取消化道內(nèi)幾種目標(biāo)菌屬，對(duì)UC患者目標(biāo)菌屬進(jìn)行定量研究，結(jié)果顯示，大腸桿菌、擬桿菌、雙歧桿菌和乳酸桿菌在UC組糞便標(biāo)本中較正常組含量有所減少，而腸球菌在UC組糞便標(biāo)本中較正常組含量有所增高。這些結(jié)果與活菌培養(yǎng)的結(jié)果一致。正常情況下，雙歧桿菌和乳酸桿菌可與腸黏膜細(xì)胞密切結(jié)合，在腸黏膜表面形成生物學(xué)屏障，阻止致病菌、條件致病菌的定植和入侵，因此二者的減少將明顯削弱腸黏膜對(duì)各種致病因素的防御作用。另外，由于腸球菌釋放外毒素，勢(shì)必加重UC患者已存在的腸道局部炎癥反應(yīng)和免疫紊亂。但是這些細(xì)菌在UC中的具體作用機(jī)制還有待進(jìn)一步研究。

雖然腸黏膜固有層免疫細(xì)胞平衡著腸道微生物的免疫耐受和對(duì)腸道微生物致病菌的防御作用，但UC仍然被認(rèn)為可能是腸黏膜免疫細(xì)胞對(duì)腸道菌群抗原的過度應(yīng)答導(dǎo)致腸道屏障功能受損過度的炎癥反應(yīng)狀態(tài)[17-18]。新近研究表明，以分泌IL-17為特征的CD4+T細(xì)胞是一種新的輔助性T細(xì)胞亞群，被認(rèn)為具有介導(dǎo)炎性反應(yīng)、自身免疫性疾病等重要免疫調(diào)節(jié)作用[19]。我們發(fā)現(xiàn)IL-23/IL-17的表達(dá)在正常的結(jié)腸上皮細(xì)胞較低，而在UC患者結(jié)腸上皮細(xì)胞的表達(dá)明顯升高，通過相關(guān)性分析，發(fā)現(xiàn)IL-23與IL-17平均吸光度與Baron分級(jí)和組織病理學(xué)評(píng)分均呈正相關(guān)，表明二者在UC的發(fā)生發(fā)展中起關(guān)鍵作用，但二者表達(dá)水平與UC患者腸道菌群的關(guān)系尚不明確。通過將IL-23/IL-17的平均吸光度與常見菌熒光定量進(jìn)行相關(guān)性分析，發(fā)現(xiàn)IL-23平均吸光度與大腸桿菌數(shù)量呈負(fù)相關(guān)，IL-23/IL-17與腸球菌數(shù)量呈正相關(guān)，而二者表達(dá)水平與擬桿菌、雙歧桿菌、乳酸桿菌數(shù)量無關(guān)，提示IL-23/IL-17作為UC發(fā)生發(fā)展的關(guān)鍵因子，其與腸道菌群含量的變化可能存在一定關(guān)聯(lián)，因其相互之間的影響最終在UC的發(fā)生中起到重要作用。關(guān)于IL-23/IL-17與腸道細(xì)菌的因果關(guān)系在UC中的作用，已有研究認(rèn)為,腸道內(nèi)致病菌產(chǎn)物與各自的Toll樣受體結(jié)合，誘導(dǎo)抗原遞呈細(xì)胞分泌IL-23，IL-23再與相應(yīng)受體結(jié)合，誘導(dǎo)IL-17表達(dá)，促發(fā)炎癥級(jí)聯(lián)放大，最終介導(dǎo)腸道炎癥發(fā)生和腸黏膜損傷[20]。多種動(dòng)物模型研究表明，IBD的病理是宿主對(duì)正常細(xì)菌的異常免疫反應(yīng)和宿主對(duì)異常細(xì)菌的正常反應(yīng)的交叉[21]，但菌群失調(diào)到底是IBD的原因，還是IBD的結(jié)果，目前并不明確[4]。

本研究也存在局限性，如培養(yǎng)只能檢測(cè)腸道中的活菌，而不能代表死菌，由于腸道菌群種類較多，不能完全反映所有菌群，且分析過程中只能涉及那些能在現(xiàn)有條件較易培養(yǎng)出來的細(xì)菌，而能培養(yǎng)的細(xì)菌由于種類太多，也只能選擇有代表性的數(shù)種。

綜上所述，活動(dòng)期UC患者存在明顯的菌群失調(diào)，改變的細(xì)菌與患者炎癥程度密切相關(guān)，IL-23/IL-17作為UC發(fā)生發(fā)展的關(guān)鍵因子，與腸道菌群含量的變化可能存在一定關(guān)聯(lián)，其相互作用在UC的發(fā)生中起到重要作用。

[參 考 文 獻(xiàn)]

[1] Li KY, Wang JL, Wei JP, et al. Fecal microbiota in pouchitis and ulcerative colitis[J]. World J Gastroenterol, 2016, 22(40):8929-8939.

[2] Kumagai H, Yokoyama K, Imagawa T, et al. Failure of fecal microbiota transplantation in a three-year-old child with severe refractory ulcerative colitis[J]. Pediatr Gastroenterol Hepatol Nutr, 2016, 19(3):214-220.

[3] Kostic AD, Xavier RJ, Gevers D. The microbiome in inflammatory bowel disease: current status and the future ahead[J]. Gastroenterology, 2014, 146(6):1489-1499.

[4] Sartor RB, Wu GD. Roles for intestinal bacteria, viruses, and fungi in pathogenesis of inflammatory bowel diseases and therapeutic approaches[J]. Gastroenterology, 2017, 152(2):327-339.

[5] 張秀榮. 腸道菌群糞便涂片檢查圖譜[M]. 第1版.北京： 人民軍醫(yī)出版社， 2000：27-61.

[6] Bewtra M, Brensinger CM, Tomov VT, et al. An optimized patient-reported ulcerative colitis disease activity measure derived from the Mayo score and the simple clinical colitis activity index[J]. Inflamm Bowel Dis, 2014, 20(6):1070-1078.

[7] Karagoz H, Erden A, Karaman H, et al. Revision of the demographic and clinical data of patients with ulcerative colitis in Turkey[J]. Med Glas (Zenica), 2017, 14(2):224-228.

[8] Siegmund B, Lehr HA, Fantuzzi G, et al. IL-1β-converting enzyme (caspase-1) in intestinal inflammation[J]. Proc Natl Acad Sci U S A, 2001, 98(23):13249-13254.

[9] Tomasello G, Bellavia M, Palumbo VD, et al. From gut microflora imbalance to mycobacteria infection: is there a relationship with chronic intestinal inflammatory diseases?[J]. Ann Ital Chir, 2011, 82(5):361-368.

[10] Shen J, Zuo ZX, Mao AP. Effect of probiotics on inducing remission and maintai ning therapy in ulcerative colitis, Crohn’s disease, and pouchitis: meta-analysis of rando-mized controlled trials[J]. Inflamm Bowel Dis, 2014, 20(1):21-35.

[11] Martini E, Krug SM, Siegmund B, et al. Mend your fences: the epithelial barrier and its relationship with mucosal immunity in inflammatory bowel disease[J]. Cell Mol Gastroenterol Hepatol， 2017, 4(1):33-46.

[12] Kaser A, Zeissig S, Blumberg RS. Inflammatory bowel di-sease[J]. Annu Rev Immunol, 2010, 28:573-621.

[13] Balish E, Warnter T. Enterococcus faecalis induces inflammatory bowel disease in interleukin-10 knockout mice[J]. Am J Pathol, 2002, 160(6):2253-2257.

[14] Gradel KO, Nielsen HL, Sch?nheyder HC, et al. Increased short- and long-term risk of inflammatory bowel disease after salmonella or campylobacter gastroenteritis[J]. Gastroenterology, 2009, 137(2):495-501.

[16] Papamichael K, Konstantopoulos P, Mantzaris GJ.Helicobacterpyloriinfection and inflammatory bowel disease: is there a link?[J]. World J Gastroenterol, 2014, 20(21):6374-6385.

[17] Neuman MG. Immune dysfunction in inflammatory bowel disease[J]. Transl Res, 2007, 149(4):173-186.

[18] Danese S, Fiocchi C. Etiopathogenesis of inflammatory bowel diseases[J]. World J Gastroenterol, 2006, 12(30):4807-4812.

[20] Krajina T, Leith?user F, M?ller P, et al. Colonic lamina propria dendritic cells in mice with CD4+T cell-induced colitis[J]. Eur J Immunol,2003, 33(4):1073-1083.

[21] Buttó LF, Haller D. Dysbiosis in intestinal inflammation: cause or consequence[J]. Int J Med Microbiol, 2016, 306(5):302-309.