王 倩， 袁 敏， 陳志國， 卞 華△

(南陽理工學(xué)院 1河南省張仲景方藥與免疫調(diào)節(jié)重點實驗室， 2張仲景國醫(yī)國藥學(xué)院， 河南 南陽 473004； 3武漢大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院， 湖北 武漢 430072)

胃癌是消化系統(tǒng)最常見的腫瘤之一，近年來其發(fā)病率呈逐年上升趨勢，致死率在男性腫瘤和女性腫瘤中分別排第2位和第3位[1]。在中國，由于飲食結(jié)構(gòu)的特殊性，胃癌致死率在所有腫瘤死因中排第2位，嚴(yán)重威脅著我國人民的健康[2]。在所有胃癌患者中，腫瘤轉(zhuǎn)移是導(dǎo)致患者死亡的主要原因。眾所周知，Wnt/β-catenin信號通路在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中起著重要的作用，其過度激活能夠促進其靶基因，如c-myc和cyclin D1等的表達，從而促進細胞的增殖和遷移，而抑制其活性則可降低細胞的增殖和遷移能力[3-5]。視黃酸受體γ(retinoic acid receptor gamma，RARG)是核受體亞家族的成員。最近越來越多的研究發(fā)現(xiàn)RARG在許多腫瘤，如肝細胞癌、食管癌、膽管癌和結(jié)直腸癌的發(fā)生發(fā)展中起著重要的作用，其表達水平與腫瘤細胞的增殖和遷移能力密切相關(guān)。但是，RARG在胃癌發(fā)生發(fā)展中扮演著什么樣的角色，目前尚不清楚。本研究通過過表達質(zhì)粒和小干擾RNA(small interfering RNA,siRNA)轉(zhuǎn)染技術(shù)，并用MTT和Transwell等實驗探討RARG對胃癌細胞的活力和遷移能力的影響。

材 料 和 方 法

1 材料

胃癌細胞系MGC-803購自ATCC；SGC7901細胞系購自中國科學(xué)院細胞庫。FLAG和HRP標(biāo)記的山羊抗兔抗RARG、β-catenin、c-Myc、cyclin D1、Twist、Snail和GAPDH抗體購自Cell Signaling Technology；轉(zhuǎn)染試劑脂質(zhì)體Lipofectamine 3000購自Invitrogen；胰蛋白酶購自索萊寶生物科技公司；MTT細胞活力檢測試劑盒購自碧云天生物技術(shù)公司；Transwell小室購自Corning；DMEM高糖培養(yǎng)基和胎牛血清購自Gibco；Dual-Luciferase? Reporter Assay System購自Promega；Protein A/G瓊脂糖珠購自Santa Cruz；空載體pFLAG-NC和pHA-NC均購自Sigma；pFLAG-RARG和pHA-β-catenin質(zhì)粒由本實驗室構(gòu)建，經(jīng)測序正確。

2 方法

2.1RARG干擾序列的設(shè)計及干擾載體的構(gòu)建 在NCBI數(shù)據(jù)庫中檢索人RARG基因序列(NM_000966.5)，按照siRNA設(shè)計原則，設(shè)計3條siRNA序列，見表1。將上述3條target sequences交由上海吉瑪公司構(gòu)建得到RARG的干擾載體(siR-RARG)以及陰性對照(siR-negative control,siR-NC)。

2.2細胞培養(yǎng)及轉(zhuǎn)染 用含10%胎牛血清的DMEM高糖培養(yǎng)基培養(yǎng)MGC-803細胞和SGC7901細胞，培養(yǎng)環(huán)境為37 ℃、5% CO2的恒溫培養(yǎng)箱。當(dāng)細胞生長至80%～90%融合度時，用胰蛋白酶消化后傳代至60 mm細胞培養(yǎng)皿，待細胞生長至60%融合度時，按照Lipofectamine 3000說明書進行轉(zhuǎn)染。

表1靶向RARG基因的小干擾RNA序列

Table 1. Small interfering RNA sequences targeting theRARGgene

NameThesequenceRARG-homo-836Sense(5-3):GCCGAAGCAUCCAGAAGAATTAntisense(5-3):UUCUUCUGGAUGCUUCGGCTTRARG-homo-959Sense(5-3):CCAAGGAAGCUGUGCGAAATTAntisense(5-3):UUUCGCACAGCUUCCUUGGTTRARG-homo-1266Sense(5-3):CCAGAUCACUCUGCUCAAATTAntisense(5-3):UUUGAGCAGAGUGAUCUG-GTT

2.3MTT實驗檢測細胞活力 收集對數(shù)期細胞接種到96孔板，使待測細胞密度至每孔5 000個左右，轉(zhuǎn)染相應(yīng)的質(zhì)粒和空載體，每組設(shè)3個復(fù)孔，37 ℃培養(yǎng)6 h后更換為含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基，設(shè)置培養(yǎng)時間0 h、24 h和48 h；每孔加入10 μL MTT溶液(5 g/L)，繼續(xù)培養(yǎng)4～6 h；終止培養(yǎng)，小心吸出孔內(nèi)培養(yǎng)基，加入150 μL DMSO，在搖床上低速振蕩10 min，于570 nm波長下檢測吸光度(A)值。

2.4Transwell實驗檢測細胞遷移能力 將轉(zhuǎn)染48 h后的細胞用胰蛋白酶消化，按每孔1×106個細胞接種到Transwell小室中，其中上層小室為不含血清的細胞懸液，下層為500 μL含10%胎牛血清的培養(yǎng)基，培養(yǎng)24 h后棄去培養(yǎng)基，用PBS將小室洗3遍，然后用4%多聚甲醛固定，0.2% Triton X-100通透細胞膜，加入DAPI溶液染色后，通過熒光顯微鏡觀察拍照。

2.5TOP/FOPFlash雙螢光素酶報告基因?qū)嶒?將SGC7901細胞按每孔5 000個左右的密度接種到96孔板中，實驗分為 pFLAG-RARG+TOP+pRL-TK組、pFLAG-RARG+FOP+pRL-TK組、pFLAG-NC+TOP+pRL-TK組和pFLAG-NC+FOP+pRL-TK組，按照上述分組分別轉(zhuǎn)染相應(yīng)質(zhì)粒到SGC7901細胞中，培養(yǎng)48 h后，收集細胞按Dual-Luciferase? Reporter Assay System試劑盒說明書操作，記錄并分析數(shù)據(jù)。

2.6Western blot 收集各處理組細胞，利用RIPA蛋白裂解液聯(lián)合超聲細胞破碎儀使細胞完全破裂，12 000×g、4 ℃離心10 min，吸取上清液，通過BCA法檢測蛋白濃度。取適量蛋白樣品加上樣緩沖液后，沸水煮5 min，離心后置于冰上。將40 μg各組蛋白質(zhì)通過SDS-PAGE，并轉(zhuǎn)印到PVDF膜(Millipore)上。然后使用5%脫脂奶粉在室溫下封閉膜1 h。封閉后，分別將膜與抗RARG、β-catenin、c-Myc、cyclin D1、Twist、Snail(Cell Signaling Technology，均1∶1 000倍稀釋)和GAPDH(Cell Signaling Technology，1∶5 000倍稀釋)抗體敷育過夜。用TBST緩沖液洗滌膜后，將膜與相應(yīng)的Ⅱ抗在室溫敷育1 h。最后，將膜用TBST洗滌3次，并使用BeyoECL Plus試劑盒通過化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)顯影。

2.7免疫共沉淀實驗 將SGC7901細胞接種到100 mm細胞培養(yǎng)皿中，實驗分為 pFLAG-RARG+pHA-β-catenin組和pFLAG-NC+pHA-β-catenin組，按照上述分組轉(zhuǎn)染相應(yīng)質(zhì)粒到SGC7901細胞中，培養(yǎng)48 h后，收集細胞，加入細胞裂解液并放置于冰上裂解，4 ℃高速離心后取上清液，分別加入相應(yīng)抗體，4 ℃孵育1 h后，再加入Protein A/G瓊脂糖珠，4 ℃孵育過夜后，以4 ℃、3 000 r/min離心，棄去上清液，再用細胞裂解液輕柔洗滌沉淀中的Protein A/G瓊脂糖珠3次，最后加入蛋白上樣緩沖液，沸水煮5 min，通過Western blot檢測目的蛋白，確定結(jié)合蛋白。

2.8免疫熒光共定位實驗 將pFLAG-RARG和pEGFP-β-catenin質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染至SGC7901細胞中，轉(zhuǎn)染48 h后，棄去培養(yǎng)基，用PBS清洗3次，再用4%多聚甲醛固定細胞15 min，0.5% Triton X-100通透細胞15 min，用山羊血清封閉液封閉30 min，敷育FLAG標(biāo)記的兔抗人Ⅰ抗4 ℃過夜，再用PE標(biāo)記的山羊抗兔 II 抗敷育1 h，DAPI染細胞核10 min，最后通過熒光顯微鏡觀察拍照。

3 統(tǒng)計學(xué)處理

采用SPSS 13.0 軟件進行統(tǒng)計學(xué)分析，數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示。RARG在胃癌和正常組織中的表達水平差異，以及RARG敲減和過表達組與對照組之間的比較均采用兩獨立樣本t檢驗。用Kaplan-Meier法和log-rank檢驗分析RARG表達水平與患者術(shù)后總生存率的關(guān)系。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

1 生物信息學(xué)分析RARG在胃癌和正常組織中的表達水平及其與胃癌患者總生存率的相關(guān)性

通過在線數(shù)據(jù)庫Oncomine和UCSC Cancer Genomics Browser分析胃癌和正常胃上皮組織中RARG的mRNA表達水平和DNA拷貝數(shù)的差異，結(jié)果顯示，與正常胃上皮組織相比，胃癌組織中RARG的mRNA表達水平增高，DNA拷貝數(shù)增加(P<0.05)。同時，Kaplan-Meier plotter數(shù)據(jù)庫分析顯示，RARG的表達水平與胃癌患者的總生存率呈負相關(guān),見圖1。

Figure 1. The mRNA expression level (A, C) and DNA copy number (B) were analyzed by bioinformatics in Oncomine database and UCSC Cancer Genomics Browser database. The correlation of RARG expression level with gastric cancer patients’ overall survival probability was determined in Kaplan-Meier plotter database (D).

圖1生物信息學(xué)分析RARG在胃癌和正常組織中的表達水平及其與胃癌患者總生存率的相關(guān)性

2 采用MTT實驗檢測RARG對胃癌細胞活力的影響

分別在SGC7901細胞中轉(zhuǎn)染pFLAG-RARG和pFLAG-NC，結(jié)果顯示RARG表達上調(diào)能夠增加SGC7901細胞的活力；在MGC-803細胞中共轉(zhuǎn)染靶向RARG的3個siRNA質(zhì)粒和陰性對照siR-NC，結(jié)果顯示敲減RARG能夠抑制MGC-803細胞的活力。其中，分別與同時點的對照組相比，24 h的pFLAG-RARG組和siR-RARG組細胞活力的差異均無統(tǒng)計學(xué)顯著性，48 h的細胞活力差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，見圖2。

Figure 2. The viability of the SGC7901 cells with over-expression ofRARG(A) and the BGC-803 cells with knockdown ofRARG(B) measured by MTT assay. Mean±SD.n=3.*P<0.05vspFLAG-NC group;#P<0.05vssiR-NC group.

圖2MTT實驗檢測RARG對胃癌細胞活力的影響

3 采用Transwell實驗檢測RARG對胃癌細胞遷移能力的影響

分別在SGC7901細胞中轉(zhuǎn)染pFLAG-RARG和pFLAG-NC，結(jié)果顯示RARG表達上調(diào)能夠增加SGC7901細胞的遷移能力(P<0.05)；分別在MGC-803細胞中轉(zhuǎn)染siR-RARG和siR-NC，結(jié)果顯示敲減RARG能夠抑制MGC-803細胞的遷移能力(P<0.05),見圖3。

Figure 3. The migration abilities of the SGC7901 cells with over-expression ofRARG(A) and the MGC-803 cells with knockdown ofRARG(B) measured by Transwell assay (×200). Mean±SD.n=3.*P<0.05vspFLAG-NC group;#P<0.05vssiR-NC group.

圖3Transwell實驗檢測RARG對胃癌細胞遷移能力的影響

4 胃癌細胞中RARG對Wnt/β-catenin信號通路的影響

分別在SGC7901細胞中轉(zhuǎn)染pFLAG-RARG和pFLAG-NC，結(jié)果顯示過表達RARG能夠顯著增加Wnt/β-catenin信號通路相關(guān)蛋白β-catenin、c-Myc、cyclin D1、Twist和Snail的蛋白表達水平(P<0.05)，激活Wnt/β-catenin信號通路；分別在MGC-803細胞中轉(zhuǎn)染siR-RARG和siR-NC，結(jié)果顯示敲減RARG能夠顯著降低Wnt/β-catenin信號通路相關(guān)蛋白β-catenin、c-Myc、cyclin D1、Twist和Snail的蛋白表達水平(P<0.05)，抑制Wnt/β-catenin信號通路,見圖4。

Figure 4. The effects of RARG expression level on the protein levels of Wnt/β-catenin signal pathway-related molecules in the SGC7901 cells with over-expression ofRARG(A) and in the BGC-803 cells with knockdown ofRARG(B) determined by Western blot. Mean±SD.n=3.*P<0.05vspFLAG-NC group;#P<0.05vssiR-NC group.

圖4RARG對Wnt/β-catenin信號通路相關(guān)蛋白的影響

5 采用TOP/FOPFlash雙螢光素酶報告基因?qū)嶒灆z測RARG對Wnt/β-catenin信號通路活性的影響

過表達RARG能夠顯著增加TOPFlash報告基因活性(P<0.05)，說明RARG能夠顯著激活Wnt/β-catenin信號通路,見圖5。

6 胃癌細胞中RARG與β-catenin蛋白存在相互作用

通過RCSB Protein Data Bank(PBD)數(shù)據(jù)庫(www.rcsb.org)分析RARG(PDB ID: 3LBD)和β-catenin(PDB ID: 3SLA)蛋白的三級結(jié)構(gòu)，通過生物信息學(xué)網(wǎng)站zdock(http://zdock.umassmed.edu/)預(yù)測得知RARG與β-catenin存在可能直接結(jié)合的結(jié)構(gòu)域。另外，通過蛋白免疫共沉淀和免疫熒光共定位實驗進行驗證，結(jié)果顯示RARG和β-catenin存在相互作用,見圖6。

Figure 5. Over-expression ofRARGenhanced the activity of TOP/FOPFlash dual-luciferase reporter gene in the SGC-7901 cells. Mean±SD.n=3.*P<0.05vspFLAG-NC group.

圖5TOP/FOPFlash雙螢光素酶報告基因?qū)嶒灆z測RARG對Wnt/β-catenin信號通路活性的影響

Figure 6. RARG (inside the red dotted line) may interact with β-catenin (outside the red dotted line) based on protein structure (A). Co-IP (B) and immunofluorescence co-localization (C) assays showed that RARG may interact with β-catenin (×200).

圖6胃癌細胞中RARG與β-catenin蛋白存在相互作用

討 論

胃癌的發(fā)生發(fā)展是一個多因素、多階段、多基因共同參與的過程。同時伴隨著抑癌基因的失活、癌基因的激活，細胞周期紊亂、致癌細胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的激活或抑癌信號通路的失活等病理過程的改變[2]。我國的胃癌發(fā)病率位居世界第二，而且往往由于診斷技術(shù)的局限和健康意識的淡薄等原因，使得大部分胃癌患者在確診時已經(jīng)處于中晚期，預(yù)后非常差。因此，深入探討胃癌的發(fā)病機制，從而為胃癌的診斷以及治療提供一定的實驗依據(jù)和理論基礎(chǔ)就顯得尤為重要。

關(guān)于RARG的研究由來已久，然而最近幾年越來越多的研究顯示RARG與腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。然而，目前的研究結(jié)果表明RARG在不同的腫瘤中扮演著不同的角色，可能是抑癌基因，也可能是癌基因。一方面，RARG可能作為癌基因促進腫瘤細胞的增殖和遷移。例如，在膽管癌中RARG過表達能夠激活A(yù)kt/NF-κB和Wnt/β-catenin信號通路，從而增強癌細胞的增殖和遷移能力[6];同樣，RARG在肝癌組織中表達升高，RARG表達上調(diào)能夠激活PI3K/Akt信號通路和NF-κB信號通路，增加癌細胞的惡性程度[7-8];同時，在動物實驗和臨床試驗中，RARG表達上調(diào)能夠促進肝癌細胞的增殖，并且能夠削弱維A酸對于肝癌的治療作用[9];在結(jié)直腸癌研究中，RARG過表達增加了結(jié)直腸癌細胞的多藥耐藥性，其機制可能是通過激活Wnt/β-catenin信號通路而上調(diào)MDR1[10]。另一方面，RARG也被報道為抑制癌細胞增殖和侵襲的腫瘤抑制因子。例如，RARG通過調(diào)節(jié)碳水化合物轉(zhuǎn)移酶10的表達，可以抑制黑色素瘤的侵襲能力[11];RARG的表達缺失能夠促進v-Ha-Ras誘導(dǎo)的鱗狀細胞癌[12];最近有研究發(fā)現(xiàn)RARG在結(jié)直腸癌組織中表達降低，揭示了RARG可以作為抑癌基因，通過抑制Hippo-Yap信號通路調(diào)節(jié)結(jié)直腸腫瘤的發(fā)生和轉(zhuǎn)移[13]。

本研究通過生物信息學(xué)分析表明，在胃癌組織中RARG的mRNA表達水平增高，其表達增高可能與拷貝數(shù)的增加有關(guān)。在體外胃癌細胞實驗中RARG過表達或敲減能夠增加或減弱胃癌細胞的活力和遷移能力，同時能夠激活或抑制Wnt/β-catenin信號通路，因此，我們推測在胃癌細胞中RARG表達上調(diào)通過激活Wnt/β-catenin信號通路，促進c-myc、cyclin D1、Twist和Snail等經(jīng)典癌基因的表達，從而促進腫瘤細胞的活力和遷移。

為了進一步探討RARG對于Wnt/β-catenin信號通路的調(diào)控機制，我們分析了RARG和β-catenin的蛋白質(zhì)三級結(jié)構(gòu)，發(fā)現(xiàn)RARG和β-catenin蛋白可能存在相互作用。接下來，我們通過蛋白質(zhì)免疫共沉淀和免疫熒光共定位實驗檢測發(fā)現(xiàn)RARG和β-catenin蛋白確實存在相互作用，這個結(jié)果初步驗證了我們的預(yù)測。而更進一步地探討RARG和β-catenin蛋白的具體結(jié)合位點以及調(diào)控機制將是我們接下來研究的重點。

綜上所述，本研究通過組織學(xué)和分子細胞學(xué)研究，揭示了RARG能夠通過激活Wnt/β-catenin信號通路，促進胃癌細胞的生長和遷移，其基因在胃癌發(fā)生發(fā)展中扮演著癌基因的角色。更加重要的是，RARG在胃癌組織中表達明顯升高，而且其表達水平與胃癌患者的生存率呈負相關(guān)，提示RARG可以作為胃癌診斷及預(yù)后的分子標(biāo)志物。

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