謝 箐， 吳可沁， 陳其榮， 陸 寧

(嘉興市第一醫(yī)院骨科， 浙江 嘉興 314001)

骨肉瘤是一種高度惡性骨腫瘤，目前釆用手術聯(lián)合化療對骨肉瘤患者進行治療，其5年生存率已提高到約60%～70%，但仍有很多患者對化療不敏感，具有高轉移和復發(fā)的風險[1-2]。尋求新的骨肉瘤治療方法依然非常必要，基因治療為腫瘤治療開辟了新途徑。長鏈非編碼RNA(long non-coding RNA，lncRNA)是一類轉錄本長度超過200核苷酸的內源性非編碼RNA，以多種形式參與調控基因的表達[3-4]。近年來在多種腫瘤組織中發(fā)現(xiàn) lncRNA 的差異性表達，lncRNA可能在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮著重要作用[5-6]。TTTY15是一個5 284 bp的lncRNA，在哺乳動物中序列高度保守，但功能尚不清楚。本研究擬首先檢測人骨肉瘤組織和細胞株中TTTY15的表達水平，研究TTTY15在組織及細胞株中的表達水平差異，再通過檢驗TTTY15-小干擾RNA(small interfering RNA，siRNA)轉染后骨肉瘤細胞活力和侵襲能力，研究TTTY15的表達水平與骨肉瘤細胞生長和侵襲能力的關系，并探討其分子機制，以期為人骨肉瘤的基因防治提供理論和實驗依據(jù)。

材 料 和 方 法

1 實驗材料

人骨肉瘤細胞株(143B、Saos2、MG-63、U2OS 和 HOS) 和人成骨細胞株hFOB1.19均購自中科院上海細胞研究所。DMEM 培養(yǎng)基、DMEM/F12培養(yǎng)基和胎牛血清(fetal bovine serum，F(xiàn)BS)購自Gibco；RPMI-1640培養(yǎng)基購自HyClone；pcDNA3.1-TTTY15-siRNA質粒和陰性對照質粒購自上海吉瑪制藥技術有限公司(TTTY15-siRNA的正義鏈為5’-GUAGAUUGCCUUUGUCUUACU-3’，反義鏈為5’-UAAGACAAAGGCAAUCUACAU-3’)；抗轉錄因子FOXM1、細胞周期蛋白依賴性激酶(cyclin-dependent kinase，CDK)4、細胞周期蛋白(cyclin) D1、基質金屬蛋白酶(matrix metalloproteinases，MMP)-2、上皮型鈣黏蛋白(E-cadherin)、神經型鈣黏蛋白(N-cadherin)及GAPDH抗體均購自Cell Signaling Technology；預鋪好Matrigel的Transwell板(8 μm孔徑)購自武漢博士德生物工程有限公司；TRIzol試劑和Lipofectamine 3000 轉染試劑盒購自Invitrogen；細胞周期檢測試劑盒均購自南京凱基生物公司。

2 實驗標本

11例骨肉瘤組織及配對瘤旁組織標本來自2012年6月～2017年3月在嘉興市第一醫(yī)院行手術治療的骨肉瘤患者，本研究經過本院倫理委員會批準，患者簽署知情同意書。患者術前均未行放、化療，經組織病理切片檢測證實為骨肉瘤，離體后10 min 內置于液氮中保存待做后續(xù)分析。

3 實驗方法

3.1細胞培養(yǎng)和轉染 143B和HOS 細胞培養(yǎng)于含10% FBS的RPMI-1640培養(yǎng)液中，Saos2、MG-63和U2OS 細胞培養(yǎng)于含10% FBS的DMEM培養(yǎng)液中，將它們全部置于37 ℃、5% CO2孵箱中培養(yǎng)。hFOB1.19 細胞培養(yǎng)在含10% FBS的DMEM/F12 培養(yǎng)液中，置于34 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。將MG-63細胞接種于6孔板，待融合度為60%時按照Lipofetamine 3000脂質體試劑盒說明書分別將pcDNA3.1-TTTY15-siRNA質粒和陰性對照質粒轉染細胞。并將細胞分為實驗(experiment)組和對照(control)組。

3.2qPCR 使用TRIzol試劑提取組織及細胞的總RNA，按逆轉錄試劑盒操作說明合成cDNA，使用qPCR試劑盒進行擴增檢測，反應條件為95 ℃ 1 min；55 ℃ 30 s、72 ℃ 30 s，共35個循環(huán)。以GAPDH為內參照檢測TTTY15和FOXM1 mRNA的表達，以U6為內參照檢測miR-216b-5p的表達。GAPDH上游引物為 5’-CTGGGCTACACTGAGCACC-3’，下游引物為5’-AAGTGGTCGTTGAGGGCAATG-3’；TTTY15上游引物為 5’-CACCCAACCAGTCATCTGAGTA-3’，下游引物為5’-GGTTGCAGTGGGCTATGACT-3’；miR-216b-5p上游引物為 5’-GGGAAATCTCTGCAGGCAAA’，下游引物為5’-CAGTGCGTGTCGTGGAGT-3’；U6上游引物為5’-CTCGCTTCGGCAGCACA-3’，下游引物為5’-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3’；FOXM1上游引物為 5’-CGTCGGCCACTGATTCTCAAA-3’，下游引物為5’-GGCAGGGGATCTCTTAGGTTC-3’。

3.3CCK-8檢測細胞活力 收集轉染后的MG-63細胞，使用完全培養(yǎng)基調整細胞密度為1.5×107/L，以每孔3×103個細胞接種于96孔板，在培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24、48、72 、96和120 h。在上述時點分別加入濃度為10%的CCK-8試劑，避光放置1 h后用酶標儀檢測450 nm波長下的吸光度(A)值。

3.4流式細胞術檢測細胞生長周期 取轉染48 h后的MG-63細胞，胰酶消化棄上清，PBS溶液洗3次；離心后加入70%乙醇固定2 h；棄去乙醇，PBS溶液洗3次；加入500 μL PBS溶液制成細胞懸液，加入5 μL RNAse A(終濃度為50 mg/L)，室溫放置20 min；加入5 μL碘化丙啶，4 ℃下避光30 min，通過流式細胞術檢測細胞周期。

3.5Transwell實驗檢測細胞侵襲能力 收集轉染后的MG-63細胞，使用無血清DMEM培養(yǎng)基重懸調整細胞密度為2×108/L，以每孔4×104個細胞加入到預鋪好Matrigel基質膠的Transwell小室的上室，下室加入600 μL完全培養(yǎng)基，在培養(yǎng)箱中連續(xù)培養(yǎng)24 h。取出上室，甲醛固定15 min，0.01%結晶紫染色15 min。100倍光學顯微鏡下計數(shù)穿膜細胞數(shù)，隨即取4個視野計數(shù)后取平均值。實驗重復4次。

3.6生物信息學分析TTTY15的下游miRNA及靶基因 采用LncBase Predicted v.2分析網站預測可與TTTY15互補配對結合的目的miRNA。采用microRNA.org靶基因預測網站分析目的miRNA的下游靶基因。

3.7Western blot法檢測蛋白水平 收集轉染后的MG-63細胞，用細胞裂解液裂解取細胞總蛋白，蛋白樣品行SDS-PAGE 1.5 h，硝酸纖維素膜轉膜2 h，5%脫脂牛奶封閉非特異性結合2 h，分別加入 I 抗FOXM1(1∶2 000)、CDK4(1∶500)、cyclin D1(1∶1 000)、MMP-2(1∶1 000)、E-cadherin(1∶5 000)、N-cadherin(1∶5 000)及GAPDH(1∶1 000)，4 ℃下孵育過夜，加入 II 抗室溫孵育1 h，化學發(fā)光法發(fā)光顯影，觀察條帶。實驗重復4次。

4 統(tǒng)計學處理

用SPSS 19.0統(tǒng)計學軟件進行統(tǒng)計分析。實驗數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差(mean±SD)表示，計量資料2組間比較采用t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析。以P<0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

結 果

1 骨肉瘤組織和細胞株中TTTY15的相對表達量

采用qPCR技術檢測骨肉瘤組織及瘤旁組織中TTTY15的表達情況，結果顯示骨肉瘤組織中TTTY15相對表達量較配對瘤旁組織顯著升高(P<0.01)，見圖1。同時，qPCR檢測結果顯示，TTTY15在5種骨肉瘤細胞株中的表達水平均顯著高于其在人成骨細胞系 hFOB1.19 中的表達水平(P<0.01)，其中在MG-63細胞中表達水平最高(P<0.01)，見圖2。

Figure 1. The mRNA levels of TTTY15 in the osteosarcoma tissues and para-carcinoma tissues. Mean±SD.n=11.**P<0.01vspara-carcinoma tissue group.

圖1骨肉瘤組織及瘤旁組織中TTTY15mRNA的相對表達量

Figure 2. The mRNA levels of TTTY15 in 5 osteosarcoma cell lines and human osteoblast cell line. Mean±SD.n=4.*P<0.05,**P<0.01vshFOB1.19 group.

圖2骨肉瘤細胞株和人成骨細胞株中TTTY15mRNA的相對表達量

2 轉染質粒的MG-63細胞中TTTY15相對表達量的變化

轉染TTTY15-siRNA后，采用qPCR技術檢測實驗組和對照組MG-63細胞中TTTY15的相對表達量分別為0.40±0.08和1.02±0.11，實驗組TTTY15的表達較對照組明顯降低(P<0.01)，驗證了TTTY15-siRNA可成功降低TTTY15的表達。

3 敲減TTTY15表達可抑制MG-63細胞活力

轉染TTTY15-siRNA及對照空質粒后，CCK-8法結果顯示，接種96 h、120 h后，低表達TTTY15的細胞活力降低，實驗組較對照組的A值均明顯降低(P<0.05)，說明低表達TTTY15可抑制MG-63細胞的活力，見圖3。

Figure 3. The effect of TTTY15 expression knockdown on the viability of MG-63 cells. Mean±SD.n=4.*P<0.05,**P<0.01vsexperiment group.

圖3敲減TTTY15表達對MG-63細胞活力的影響

4 敲減TTTY15表達抑制MG-63細胞周期的進展

轉染TTTY15-siRNA及對照空質粒后，流式細胞術結果顯示，敲減MG-63細胞的TTTY15表達后，實驗組較對照組細胞位于G0/G1期的比例明顯增多(P<0.01)，表明敲減TTTY15表達抑制MG-63細胞周期的進展，見圖4。

5 敲減TTTY15表達可抑制MG-63細胞的侵襲能力

轉染TTTY15-siRNA及對照空質粒后，Transwell實驗結果提示，敲減TTTY15表達后,實驗組穿膜細胞數(shù)較對照組顯著減少，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)，見圖5。

Figure 4. The effect of TTTY15 expression knockdown on the cell cycle distribution of MG-63 cells. Mean±SD.n=4.*P<0.05,**P<0.01vscontrol group.

圖4敲減TTTY15表達對MG-63細胞周期分布的影響

Figure 5. The effect of TTTY15 expression knockdown on the invasion ability of MG-63 cells (×100). Mean±SD.n=4.**P<0.01vscontrol group.

圖5敲減TTTY15表達對MG-63細胞侵襲能力的影響

6 生物信息學預測TTTY15的下游miRNA及靶基因

LncBase Predicted v.2分析網站顯示，TTTY15可與miR-216b-5p互補配對結合。microRNA.org靶基因預測網站提示，miR-216b-5p可能的下游靶基因為FOXM1，mirSVR score為-0.7800，PhastCons score為0.5133。具體序列結合位點見圖6。

7 敲減TTTY15表達對MG-63細胞中miR-216b-5p和FOXM1 mRNA相對表達量的影響

通過qPCR檢測顯示，實驗組和對照組中miR-216b-5p相對表達量分別為2.81±0.41和1.06±0.19(P<0.01)；實驗組和對照組FOXM1 mRNA的相對表達量分別為0.35±0.05和1.03±0.15(P<0.01)。實驗結果表明敲減TTTY15表達能夠升高miR-216b-5p的表達，降低FOXM1的mRNA表達。

Figure 6. The complementary binding sequence of TTTY15 and miR-216b-5p, and the complementary binding sequence of miR-216b-5p and FOXM1.

圖6TTTY15與miR-216b-5p的互補配對結合序列以及miR-216b-5p與FOXM1的互補配對結合序列

8 敲減TTTY15表達對相關蛋白表達的影響

將細胞裂解提取總蛋白后行Western blot檢測發(fā)現(xiàn)，敲減TTTY15表達后，MG-63細胞的FOXM1、CDK4、cyclin D1、MMP-2和N-cadherin的蛋白水平降低(P<0.05)， E-cadherin的蛋白水平增加(P<0.01)，見圖7。

Figure 7. The effect of TTTY15 expression knockdown on the protein expression of related proteins in the MG-63 cells. Mean±SD.n=4.*P<0.05,**P<0.01vscontrol group.

圖7敲減TTTY15表達對MG-63細胞相關蛋白表達的影響

討 論

人類基因組中除了能夠編碼蛋白的基因外，還有大量的非編碼RNA，其中針對microRNA功能和機制的研究已經非常深入，然而對lncRNA的研究尚處于起步階段[7-9]。lncRNA 在表觀遺傳學水平發(fā)揮重要作用，近年來越來越多的研究表明，lncRNA在骨肉瘤的發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮著重要作用[10-11]。lncRNA如SNHG1和NEAT1可顯著促進骨肉瘤的增殖和轉移能力，發(fā)揮促癌作用[12-13]；而另一些lncRNA 如p21和XIST可明顯抑制骨肉瘤的增殖和轉移能力，發(fā)揮抑癌作用[14-15]。TTTY15是我們最新篩選出的在骨肉瘤組織和細胞株中高表達的lncRNA，其在腫瘤特別是骨肉瘤中的表達及功能尚不清楚。

本研究在TTTY15表達量最高的骨肉瘤細胞株MG-63中，通過轉染siRNA質粒使TTTY15低表達，觀察并驗證了TTTY15 的功能。結果發(fā)現(xiàn)，敲減TTTY15表達使細胞活力減弱，細胞周期被抑制于G0/G1期。通過預鋪好Matrigel基質膠的Transwell小室模擬骨肉瘤侵襲時需要穿透的組織細胞基底膜，本研究進一步的結果顯示，敲減TTTY15表達可減少MG-63細胞的穿膜數(shù)量，提示TTTY15低表達抑制了MG-63細胞的侵襲能力。lncRNA 發(fā)揮作用的重要機制是通過內源性 “miRNA 海綿”功能，通過吸附miRNA，抑制miRNA靶向干擾下游基因的表達[16]。本研究通過LncBase Predicted v.2分析網站發(fā)現(xiàn)，TTTY15可與miR-216b-5p互補配對結合。miR-216b-5p在多種腫瘤如結直腸癌、宮頸癌和胰腺癌中表達降低，與腫瘤細胞的增殖或轉移能力密切相關[17-19]。高表達miR-216b-5p可顯著抑制腫瘤細胞的增殖或轉移能力[20-21]。進一步通過microRNA.org預測網站發(fā)現(xiàn)，miR-216b-5p可與轉錄因子FOXM1互補配對結合。FOXM1表達升高可引起細胞周期相關蛋白及基質金屬蛋白酶2表達升高，促進細胞的增殖和轉移能力，參與腫瘤的發(fā)生發(fā)展[22]。本研究發(fā)現(xiàn)，敲減TTTY15表達可誘導miR-216b-5p表達升高，引起FOXM1基因的低表達，同時導致CDK4、cyclin D1、MMP-2和N-cadherin蛋白表達降低，E-cadherin蛋白表達上升。上皮間質轉化(epithelial-mesenchymal transition，EMT)是腫瘤細胞侵襲轉移能力增加的重要機制，E-cadherin和N-cadherin蛋白表達改變是EMT過程的特征表現(xiàn)[23]。TTTY15低表達能夠抑制骨肉瘤MG-63細胞的EMT過程。

綜上所述，TTTY15在骨肉瘤組織和細胞株中表達升高，在MG-63細胞株中表達最高。敲減TTTY15表達可抑制MG-63細胞的活力和侵襲能力，其作用機制可能是低表達TTTY15誘使miR-216b-5p的表達升高，通過基因干擾作用抑制癌基因FOXM1的表達。本研究提示TTTY15可能參與骨肉瘤的發(fā)生發(fā)展，為骨肉瘤的臨床治療提供了新的基因靶點及監(jiān)測指標。

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