曾繁暢，唐正嚴(yán)，岑松，康新立

（1.中南大學(xué)湘雅醫(yī)院 泌尿外科，湖南 長沙 410008；2.海南省人民醫(yī)院 泌尿外科，海南 ?？?570311）

膀胱癌是威脅人類健康的常見泌尿系統(tǒng)惡性腫瘤，膀胱癌發(fā)生、發(fā)展與染色體異常、基因多態(tài)性、表觀遺傳學(xué)改變等分子學(xué)機(jī)制關(guān)系密切[1]。但是膀胱癌發(fā)病機(jī)制目前仍不清楚。因此，本文從在分子生物學(xué)角度探討膀胱癌發(fā)生、發(fā)展的可能機(jī)制，尋找新的膀胱癌診斷和預(yù)后評(píng)判指標(biāo)，以及基因治療靶點(diǎn)。

氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白家族在正常細(xì)胞和轉(zhuǎn)化細(xì)胞生長、增殖及生存中發(fā)揮重要作用[2]。L型氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)載體1（L-type amino acid transporter 1，LAT1）、 系統(tǒng)ASC氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白2（system ASC amino acid transporter-2，ASCT2）、胱氨酸/谷氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)體功能亞基（x-C-type cystine/glutamate transporter，xCT）3種氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白家族成員被認(rèn)為與腫瘤發(fā)病機(jī)制和致癌作用關(guān)系密切[3-4]。這些氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)載體在人類腫瘤組織中呈異常高表達(dá)狀態(tài)[5-7]。LAT1、ASCT2和xCT的過度表達(dá)與多種人類癌癥不良結(jié)局相關(guān)，提示氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白家族成員可能是腫瘤的重要病理預(yù)測(cè)因子[3，8-11]。但這些氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)載體LAT1、ASCT2和xCT在膀胱癌患者中的臨床病理意義目前尚未見報(bào)道。本研究采用免疫組織化學(xué)法檢測(cè)膀胱癌手術(shù)切除組織標(biāo)本中LAT1、ASCT2和xCT蛋白的表達(dá)，并分析其表達(dá)水平與患者臨床病理參數(shù)的相關(guān)性。此外，還檢測(cè)細(xì)胞核增殖相關(guān)抗原Ki-67和血管生成標(biāo)志物CD34在膀胱癌組織中的表達(dá)，以探討膀胱腫瘤增殖、血管生成與氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的相關(guān)性。

1 資料與方法

1.1 研究對(duì)象

選取2008年1月-2009年12月中南大學(xué)湘雅醫(yī)院手術(shù)切除并經(jīng)病理證實(shí)的膀胱癌患者93例，取膀胱癌及其癌旁正常膀胱組織，癌旁組織為距腫瘤2cm處膀胱上皮組織。另取手術(shù)治療的良性疾病正常膀胱組織27例作為對(duì)照。標(biāo)本切除離體后用10%甲醛固定。膀胱癌組患者男性71例，女性22例；年齡37～68歲，平均48.2歲；患者術(shù)前未接受放、化療（包括膀胱灌注）。收集患者的臨床資料，包括腫瘤大小、數(shù)目、形態(tài)、病理分級(jí)、病理分期（按AJCC2002標(biāo)準(zhǔn)）、復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移情況、生存時(shí)間等。

1.2 主要試劑

小鼠抗人CD34、Ki-67、ASCT2、xCT和LAT1單克隆抗體購自美國Abcam公司，SP試劑盒和二氨基聯(lián)苯氨（Diaminobezidin，DAB）顯色試劑盒購自北京中杉金橋生物公司。

1.3 免疫組織化學(xué)法

免疫組織化學(xué)法檢測(cè)CD34、Ki-67、ASCT2、xCT、LAT1的表達(dá)。將蠟塊制成4mm厚切片，常規(guī)脫蠟至水，0.3%過氧化氫孵育30min以阻斷內(nèi)源性過氧化物酶。0.01 mol/L PBS沖洗3次，5min/次，高壓抗原修復(fù)。將切片浸入0.01 mol/L檸檬酸鹽抗原修復(fù)液（pH=6.0），高壓3min，自然冷卻至室溫。0.01 mol/L PBS沖洗3次，5min/次，滴加一抗（1∶100），4℃孵育過夜。0.01 mol/L PBS沖洗3次，5min/次，滴加生物素標(biāo)記的二抗，室溫孵育30min。0.01 mol/L PBS沖洗3次，5min/次，DAB顯色，蘇木精復(fù)染，中性樹膠封片，光鏡觀察。PBS代替一抗作為陰性對(duì)照。結(jié)果判定采用雙盲法，同時(shí)由2位資深病理科醫(yī)師獨(dú)立觀察每張切片后進(jìn)行判定。判定標(biāo)準(zhǔn)采用半定量評(píng)分法，根據(jù)染色強(qiáng)度和陽性細(xì)胞百分比進(jìn)行判定。染色強(qiáng)度：無色為0分，淡黃色為1分，棕黃色為2分，棕褐色為3分。陽性細(xì)胞百分比：無陽性細(xì)胞為0分，1%～9%為1分，10%～49%為2分，50%～74%為3分，75%～100%為4分。2項(xiàng)評(píng)分乘積≤4為陰性，＞4分為陽性。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

數(shù)據(jù)分析采用SPSS 18.0統(tǒng)計(jì)軟件，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，比較用方差分析，兩兩比較用LSD-t檢驗(yàn)，計(jì)數(shù)資料以百分比或率表示，比較用χ2檢驗(yàn)，用cox風(fēng)險(xiǎn)模型進(jìn)行多變量回歸分析，相關(guān)性分析用Spearman法，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 免疫組織化學(xué)法染色結(jié)果

LAT1、ASCT2和xCT主要表達(dá)于細(xì)胞膜上，在腫瘤組織部分以島狀形式表達(dá)，所有陽性細(xì)胞顯示出較強(qiáng)的細(xì)胞膜染色。膀胱癌組織中LAT1、ASCT2和xCT的陽性表達(dá)率分別為55.9%（52/93）、77.4%（72/93）和65.6%（61/93）。按照半定量評(píng)分法，LAT1、ASCT2和 xCT表達(dá)的分?jǐn)?shù)分別為（0.72±0.18）、（1.74±0.26）和（1.42±0.23）分，經(jīng)方差分析，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=3.829，P=0.001）。LAT1的分?jǐn)?shù)低于ASCT2和 xCT（P＜0.05），ASCT2與 xCT比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見附圖。

膀胱癌組織中CD34和Ki-67高表達(dá)率分別為52.7%（49/93）和50.5%（47/93）。ASCT2陽性表達(dá)與Ki-67相關(guān)（P＜0.05）。LAT1的表達(dá)與臨床病理特征無關(guān)（P＞0.05）。xCT陽性表達(dá)只與腫瘤分化程度相關(guān)（P＜0.05）。見表1。

附圖 LAT1、ASCT2和xCT在膀胱癌組織中的表達(dá) （SP×400）

表1 LAT1、ASCT2、xCT陽性表達(dá)與患者臨床病理特征的關(guān)系 例（%）

續(xù)表1

2.2 ASCT2表達(dá)與各因素的相關(guān)性

ASCT2與 LAT1、Ki-67呈正相關(guān)（P＜0.05），與腫瘤大小、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、復(fù)發(fā)、xCT及CD34無關(guān)（P＞0.05）。見表2。

2.3 膀胱癌患者5年總生存率和無復(fù)發(fā)生存率的單因素分析

本研究引入可能影響膀胱癌患者術(shù)后生存的臨床病理因素，包括患者年齡、性別、分化程度、疾病分期、腫瘤大小、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、復(fù)發(fā)、ASCT2、LAT1、xCT、Ki-67及CD34表達(dá)。ASCT2表達(dá)、疾病分期與總生存率相關(guān)（P＜0.05）。腫瘤大小、疾病分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移與無復(fù)發(fā)生存率相關(guān)（P＜0.05）。見表3。

2.4 膀胱癌患者5年總生存率的Cox多因素分析

將單因素分析有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的影響因素納入Cox多因素回歸分析。結(jié)果顯示，疾病分期和ASCT2蛋白表達(dá)是影響膀胱癌患者預(yù)后最有價(jià)值的因素。疾病分期和ASCT2蛋白表達(dá)是影響膀胱癌患者術(shù)后5年總生存率的獨(dú)立預(yù)后因素。本研究發(fā)現(xiàn)，ASCT2蛋白是影響膀胱癌患者預(yù)后的獨(dú)立分子標(biāo)志物，并且對(duì)膀胱癌患者的5年總生存率和無復(fù)發(fā)生存率具有重要的預(yù)測(cè)價(jià)值。見表4。

表2 ASCT2表達(dá)與各因素的相關(guān)性

表3 各因素與5年總生存率和無復(fù)發(fā)生存率的相關(guān)性

表4 膀胱癌患者5年總生存率的多因素分析參數(shù)

3 討論

本研究探討氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白家族成員LAT1、ASCT2和xCT在膀胱癌中的表達(dá)及其臨床意義。結(jié)果表明，3種氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白中，ASCT2表達(dá)在膀胱癌發(fā)展和惡化過程中發(fā)揮重要作用。此外，ASCT2表達(dá)與細(xì)胞核增殖相關(guān)抗原Ki-67呈正相關(guān)，提示ASCT2表達(dá)與膀胱癌細(xì)胞增殖關(guān)系密切，ASCT2表達(dá)是預(yù)測(cè)膀胱癌患者不良轉(zhuǎn)歸的獨(dú)立預(yù)后標(biāo)志。此外，ASCT2表達(dá)與細(xì)胞增殖、血管生成相關(guān)。但ASCT2在膀胱癌中的表達(dá)低于其他人類腫瘤，如肺癌[4]、胰腺癌[6]、乳腺癌[12]和頭頸部癌[5]。尚未見關(guān)于ASCT2在膀胱癌中表達(dá)低于其他癌的研究報(bào)道。

SHIMIZU等[4]研究104例非小細(xì)胞肺癌發(fā)現(xiàn)，ASCT2的陽性表達(dá)率為86%，且ASCT2陽性表達(dá)與疾病分期、淋巴結(jié)浸潤、血管浸潤、CD98表達(dá)、細(xì)胞增殖、血管生成、mTOR磷酸化及肺腺癌關(guān)系密切；其研究表明，ASCT2是肺腺癌患者預(yù)后差的獨(dú)立預(yù)測(cè)因素。蔡燦鋒等[13]研究表明，ASCT2的高表達(dá)與結(jié)直腸癌進(jìn)展關(guān)系密切，是其獨(dú)立預(yù)后不良因素之一，可能與增強(qiáng)谷氨酰胺代謝，促進(jìn)腫瘤進(jìn)展有關(guān)。這些研究結(jié)果與本研究在膀胱癌中的實(shí)驗(yàn)結(jié)果類似，但是以往這些研究未探討氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白其他家族成員在腫瘤中的表達(dá)情況，未對(duì)ASCT2影響腫瘤進(jìn)展的機(jī)制進(jìn)行分析。本研究也是國內(nèi)首次在膀胱癌中分析氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)家族成員與膀胱癌細(xì)胞增殖Ki-67、血管生成CD34的相關(guān)性。結(jié)果表明，ASCT2在膀胱癌細(xì)胞增殖、新生血管中發(fā)揮重要作用，尤其是在膀胱癌細(xì)胞增殖過程中。此外，本研究還發(fā)現(xiàn)，LAT1在ASCT2表達(dá)中發(fā)揮重要作用。有研究證實(shí)在舌癌中LAT1與ASCT2相關(guān)[5]。膀胱癌患者中，ASCT2是預(yù)測(cè)不良結(jié)果的有效指標(biāo)，但LAT1不是明確的預(yù)后指標(biāo)。然而在其他腫瘤中，LAT1是一個(gè)獨(dú)立的預(yù)后指標(biāo)，LAT1表達(dá)與晚期癌癥患者不良預(yù)后關(guān)系密切。目前認(rèn)為，肺癌中LAT1與氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)、整合素信號(hào)、促進(jìn)腫瘤的生長和轉(zhuǎn)移等功能關(guān)系密切[14]。膀胱癌患者中，LAT1可能促進(jìn)ASCT2的表達(dá)，腫瘤的惡性特征可能是LAT1和ASCT2共同表達(dá)的結(jié)果。這些結(jié)果表明，ASCT2的表達(dá)對(duì)腫瘤進(jìn)展和膀胱細(xì)胞存活是非常必要的，LAT1是一個(gè)潛在的預(yù)后標(biāo)志。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果還發(fā)現(xiàn)，膀胱癌組織中ASCT2的陽性表達(dá)低于肺癌[4]、胰腺癌[6]和結(jié)腸癌[13]，胰腺癌、膽管癌和肺癌的平均陽性表達(dá)率分別為86%、85%和89%。但膀胱癌患者中陽性表達(dá)率僅為77%。雖然ASCT2在膀胱癌中的表達(dá)低于其他癌，但膀胱癌細(xì)胞中ASCT2陽性與腫瘤細(xì)胞增殖和存活關(guān)系密切。膀胱癌中LAT1、ASCT2和xCT均為陽性表達(dá)，這些氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白在膀胱癌的發(fā)展和惡化過程中發(fā)揮至關(guān)重要的作用。以往研究報(bào)道，LAT1和ASCT2可以作為重要的預(yù)后因素，其過度表達(dá)與人類腫瘤的轉(zhuǎn)移、浸潤關(guān)系密切[15]。其他癌中ASCT2表達(dá)低于LAT1和xCT，但膀胱癌患者ASCT2表達(dá)高于LAT1和xCT。目前尚未見氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白在不同腫瘤中表達(dá)差異的機(jī)制研究，因此需要進(jìn)一步研究LAT1和xCT表達(dá)在膀胱癌的作用。

最近研究表明，抑制ASCT2會(huì)降低腫瘤生長和哺乳動(dòng)物雷帕霉素mTOR靶位的磷酸化水平[16]。氨基酸營養(yǎng)通過mTOR耦合到細(xì)胞信號(hào)上，激活的信號(hào)通路引起細(xì)胞生長。據(jù)報(bào)道，ASCT2在mTOR途徑中扮演關(guān)鍵角色，人類腫瘤組織中ASCT2表達(dá)與mTOR磷酸化關(guān)系密切。但膀胱患者中ASCT2與mTOR的關(guān)系仍不清楚，有必要進(jìn)一步研究ASCT2在膀胱癌mTOR通路中的作用。

總之，膀胱癌組織中ASCT2陽性表達(dá)與LAT1、細(xì)胞增殖相關(guān)。本研究結(jié)果提示，ASCT2表達(dá)是預(yù)測(cè)膀胱癌術(shù)后不良轉(zhuǎn)歸重要且獨(dú)立的預(yù)后因素，抑制ASCT2可能成為膀胱癌患者治療的潛在目標(biāo)。

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