胡耀華，陽慧，吳翔，符春苗，邵運祿，鄭才玲，卓書偉

（海南省中醫(yī)院 1.檢驗科，2.婦產(chǎn)科，海南 海口 570203）

甲型病毒性肝炎（hepatitis a virus，HAV）對人類健康危害極大，2001年MCINTIRE等[1]發(fā)現(xiàn)了1個新的基因T細胞免疫球蛋白域蛋白（T cell immunoglobulin domain and mucin domain，TIM）家族，包括TIM-1、TIM-3及TIM-4。TIM-1是HAV受體-1（hepatitis A virus cellular receptor 1，HAVCR-1），TIM-4是TIM-1的天然配體[2-4]。在HAV發(fā)生、發(fā)展和轉歸的不同階段，目前國內外均未報道TIM-1、TIM-4的表達和作用。本研究擬通過檢測HAV患者外周血TIM-1和TIM-4 mRNA表達水平，探討其與HAV的關系，為防治HAV提供新的思路和靶點。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2016年9月-2016年10月海南省中醫(yī)院收治的30例HAV患者作為HAV組。其中，男性21例，女性9例；年齡35～62歲，平均（46±1.3）歲。同期選取30例健康體檢者作為對照組。所有患者依據(jù)臨床癥狀、體征、肝功能檢查結果及抗-HAV免疫球蛋白M（immunoglobulin M，IgM）陽性確診為HAV，并根據(jù)臨床癥狀和體征分為潛伏期、黃疸期及恢復期。參照2000年9月西安中華醫(yī)學會傳染病與寄生蟲病學分會和肝病學分會修訂的病毒性肝炎防治方案的標準[5]。

1.2 靜脈血標本

根據(jù)HAV疾病進展的3個階段，分別收集30例HAV-IgM陽性患者的靜脈血標本。潛伏期或黃疸前期（患者畏寒發(fā)熱、全身乏力、食欲不振、厭油、惡心、嘔吐及上腹部飽脹感或輕度腹瀉等）：采集乙二胺四乙酸二鉀（Ethylenediaminetetraacetic acid disodium salt，EDTA-K2）全血2 ml及不抗凝血3 ml分離血清；黃疸期（觀察患者鞏膜、皮膚黃染程度，第2～7天）：采集EDTA-K2全血2 ml及不抗凝血3 ml分離血清；恢復期（患者癥狀消失、肝脾正常，第22～42天）：采集EDTA-K2全血2 ml及不抗凝血3 ml分離血清。對照組分別在第1、7及30天采集靜脈血，EDTA-K2全血2 ml及不抗凝血3 ml分離血清。

1.3 實時熒光定量聚合酶鏈反應

1.3.1 引物設計與合成應用生物信息學知識，根據(jù)GeneBank中的TIM-1和TIM-4 mRNA以及甘油醛-3-磷酸脫氫酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）mRNA全長序列，用Primer Express軟件設計目的基因TIM-1、TIM-4和內參照基因GAPDH引物。TIM-1正向引物：5’-CTAGCTAGCGCCACCATG-3’，反向引物：5’-GGGGTACCTTAGTCCGTG-3’；TIM-4正向引物：5’-CCGCTACAGGCCTACCATGTCCA-3’，反向引物：5’-GGGGTACCGTTGGCATTG-3’；GAPDH正向引物：5’-TGAGGTCAATGAAGGGGTCG-3’，反向引物：5’-TCTTGTGCAGTGCCAGCCT-3’。以上引物由上海生工生物工程股份有限公司合成。

1.3.2 外周血單個核細胞的獲取及總RNA的提取與逆轉錄將Ficoll分離液和預先稀釋的抗凝全血加入離心管中，2 000 r/min離心20min，小心吸取密集在血漿層和分層液界面中呈白色霧狀的單個核細胞，經(jīng)RPMI 1640細胞培養(yǎng)液調整細胞濃度為1×106個/L。用Trizol一步法抽提外周血單個核細胞總RNA，分析光密度（optical density,OD）260/OD280純度，選取比值在1.8～2.0的樣品進行檢測，使用Thermo逆轉錄試劑盒進行逆轉錄。

1.3.3 反應條件采用美國Applied Biosystems公司的SYBR? Green PCR Core Reagents試劑盒。在專用檢測板上配制各管反應液，總體系25μl。于聚合酶鏈式（polymerase chain reaction，PCR）反應儀中進行反應。實時熒光定量聚合酶鏈反應（quantitative real-time polymerase chain reaction，qRT-PCR）檢測體10×PCR緩沖液 2μl，25mmol/L Mg2+3.5μl，10mmol/L 高質量的脫氧核糖核苷酸0.4μl，10μmol/L引物各0.5μl，普通TaqDNA聚合酶1u（1 u/μl），SYBR Green I 20×1μl，滅菌H2O補齊。PCR反應條件：94℃預變性2min，94℃變性10 s，59℃退火15 s，72℃延伸15 s，共40個循環(huán)后分別進行熒光檢測，并做熔解曲線對PCR產(chǎn)物的特異性進行鑒定，最后反應冷卻至40℃。

1.3.4 HAV患者外周血HAV RNA含量qRTPCR反應條件同1.3.3，正向引物：5’-TCTTTGTTCCA GGGCTCTCC-3’；反向引物：5’-GCTCTTCCTCA ATGTCTGCC-3’。

1.4 酶聯(lián)免疫吸附法

采用酶聯(lián)免疫吸附法（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）檢測血中IgM和免疫球蛋白G（immunoglobulin G，IgG）抗體，Cut-off值＜0.8為陰性，0.8～1.1為弱陽性（可疑），≥1.1為陽性。具體步驟：向相應微孔中加100μl標準品、陽性對照、陰性對照及待檢標本。室溫（18～25℃）溫育30min，倒掉板內液體，用清洗緩沖液洗板3次，拍干，滴加酶結合物100μl/孔室溫（18～25℃）溫育30min，洗板3次，拍干，滴加顯色液A和B各100μl，室溫（18～25℃）避光溫育15min后加終止液100μl，酶標儀450 nm處測Cut-off值。

1.5 肝功能檢測

采用7600型全自動生化分析儀（日本日立公司）檢測肝功能指標谷丙轉氨酶（glutamic pyruvic transaminase，ALT）、谷草轉氨酶（glutamic oxaloacetic transaminase，AST）及總膽紅素（total bilirubin，TBIL）。使用血清標本，方法參照儀器和試劑盒說明書。

1.6 統(tǒng)計學方法

數(shù)據(jù)分析采用SPSS 13.0統(tǒng)計軟件，計量資料以均數(shù)±標準差（±s）表示，比較用Kruskal-Wallis H檢驗（方差不齊），獨立樣本兩兩比較用Nemenyi檢驗，相關分析用Pearson法，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 兩組患者TIM-1和TIM-4 mRNA表達水平比較

由qRT-PCR反應曲線得到Ct值，計算基因相對表達量，采用GAPDH作為內參照。ΔCt=Ct目的基因－CtGAPDH。其中HAV患者TIM-1和TIM-4 mRNA的Ct值分別為38.029～3.272logX（r=0.927）、32.719～2.582logX（r=0.975）。兩組患者在HAV感染的不同時期TIM-1和TIM-4 mRNA表達水平比較，差異有統(tǒng)計學意義（H=4.768，P=0.013），HAV組高于對照組，其表達水平較潛伏期升高數(shù)倍，黃疸期達峰值，恢復期降低，但仍高于對照組。兩組患者恢復期TIM-1和TIM-4 mRNA表達水平比較，差異有統(tǒng)計學意義（H=3.963，P=0.027）。不同時期的TIM-1和TIM-4 mRNA表達水平比較，差異有統(tǒng)計學意義（H=11.975和15.482，均P=0.000）；潛伏期與恢復期TIM-1和TIM-4 mRNA表達水平比較，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。見圖1。

圖1 兩組患者TIM-1和TIM-4 mRNA表達水平比較

2.2 HAV患者不同時期TIM-1和TIM-4 mRNA表達水平與HAV RNA含量的相關性

由qRT-PCR反應曲線得到Ct值，計算基因相對表達量，采用GAPDH作為內參照。ΔCt=Ct目的基因－CtGAPDH。 得 Ct=40.049～ 3.579logX（r=0.955）。TIM-1和TIM-4 mRNA表達水平的變化趨勢與HAV mRNA表達水平一致，于黃疸期達峰值（r=0.752，P=0.035）。其中HAV在潛伏期、黃疸期及恢復期的陽性率分別為13.3%（4/30）、100%（30/30） 和 46.7%（14/30）。 其mRNA表達水平于黃疸期增高，最高達7.2×104Copies。

2.3 HAV患者外周血TIM-1、TIM-4 mRNA表達水平與HAV抗體、IgM及IgG滴度的相關性

由ELISA法測得外周血中HAV抗體IgM和IgG水平。不同時期IgM、IgG及HAV RNA比較，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。其中IgM潛伏期就有較高水平，隨著病情不斷進展于黃疸期達峰值，恢復期下降，黃疸期、潛伏期和恢復期比較，差異有統(tǒng)計學意義（H=11.221和9.478，均P=0.000）。而IgG在潛伏期水平較低，黃疸期和恢復期持續(xù)升高，潛伏期與黃疸期、恢復期比較，差異有統(tǒng)計學意義（H=5.324和7.332，P=0.011和0.002）。HAV RNA黃疸期與潛伏期、恢復期比較，差異有統(tǒng)計學意義（H=6.145和4.234，P=0.003和0.023），潛伏期與恢復期比較，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。Pearson相關性分析發(fā)現(xiàn)，HAV患者病情進展不同時期血清中TIM-1、TIM-4 mRNA表達水平與IgM滴度變化呈正相關（r=0.790和0.900，均P=0.000）。HAV患者不同時期血清中TIM-1、TIM-4 mRNA表達水平與IgG滴度變化無關（P＞0.05）。見表1、2。

2.4 HAV患者不同時期TIM-1、TIM-4 mRNA表達水平與ALT、AST及TBIL含量的相關性

ALT、AST及TBIL 3個指標均從潛伏期開始增加，至黃疸期達峰值，進入恢復期后逐漸下降并恢復正常。Pearson相關性分析發(fā)現(xiàn)，HAV患者不同時期血清中TIM-1、TIM-4 mRNA表達水平與AST、TBIL含量呈正相關（P＜0.05），ALT含量與TIM-1 mRNA表達呈正相關（P＜0.05）。其中TIM-1、TIM-4 mRNA 表達水平與TBIL含量的最相關。見表2。

表1 HAV患者病情進展不同時期IgM、IgG及HAV RNA水平比較 （±s）

表1 HAV患者病情進展不同時期IgM、IgG及HAV RNA水平比較 （±s）

時期 IgM/（IU/L） IgG/（IU/L） HAV RNA潛伏期 1 115.000±594.392 273.334±181.589 1 506.667±531.906黃疸期 3 193.334±1 478.800 1 361.667±611.342 4 4445.591±1 4445.912恢復期 270.000±165.237 1 461.667±547.358 940.025±1 265.892 H值 11.771 9.972 14.087 P值 0.000 0.000 0.000

表2 HAV患者不同時期TIM-1、TIM-4 mRNA表達水平與IgM、IgG滴度，ALT、AST及TBIL含量的相關性

3 討論

本實驗結果顯示，HAV患者血清中有較高的TIM-1和TIM-4 mRNA表達水平，且高于健康人群。其表達水平與HAV患者HAV RNA、IgM滴度及肝功能損傷水平成正相關。

TIM-1集成表達于T細胞表面，作為一種輔刺激分子，對T細胞的調節(jié)有重要作用，可以促進細胞因子的分泌，增強NKT細胞殺傷能力，以及調節(jié)增強腫瘤抗原相關的1型免疫反應。鼠系研究表明，TIM-4是TIM-1的天然配體，集成性表達于抗原提呈細胞，特別是成熟的樹突狀細胞[5-6]。同時發(fā)現(xiàn)TIM-4可誘導TIM-1胞內尾巴區(qū)酪氨酸磷酸化，從而提供1個共刺激信號，增強白細胞介素-4啟動子的轉錄，并激活T細胞核因子轉錄和活化蛋白-1促使T細胞增殖和細胞因子產(chǎn)生[7-8]。在T細胞增殖調控方面，TIM-1和TIM-4協(xié)同作用有重要意義[9]。同時TIM-1作為HAV的細胞表面受體，可能參與HAV的發(fā)生[6]。筆者研究發(fā)現(xiàn)，在HAV患者潛伏期，HAV RNA、IgM水平還處于較低水平時，TIM-1和TIM-4 mRNA表達水平相比于健康人群升高，其靈敏性高于前者。推測HAV在感染肝細胞前可能先與TIM-1病理性結合從而激活NKT細胞，給NKT細胞提供增殖信號，使NKT細胞大量復制，參與肝細胞的免疫損傷。相關研究也發(fā)現(xiàn)，HAV與TIM-1結合可以介導病毒插入靶細胞膜并進入宿主細胞，具體過程為HAV與TIM-1的D1結構域結合，吸附到易感細胞表面，在黏膜樣區(qū)域的協(xié)同作用下，HAV外殼蛋白的結構發(fā)生變化，將病毒表面與細胞融合相關的區(qū)域暴露出來，HAV與TIM-1融合，隨著融合孔增大，HAV繼而插入靶細胞膜并進入宿主細胞[4,10-11]。

1例HAV患者發(fā)生肝衰竭，其血清中TIM-1和TIM-4 mRNA呈高表達，且迅速發(fā)生黃疸。其肝功能急劇惡化，HAV RNA水平卻在檢測下限，同時HAV IgM也呈低表達，這可能是由于HAV不是本身攻擊肝細胞，而是其抗原所導致的一種免疫損傷。這與國外人群研究，嚴重肝衰竭HAV患者血清中有著低濃度的病毒載量結論一致[11]。也有阿根廷HAV患兒的研究表明，HAV感染從無癥狀疾病到暴發(fā)性肝衰竭與HAV RNA的病毒載量無關，而與TIM-1多態(tài)性（TIM-1長形式）相關，嚴重HAV誘導的肝衰竭可能與長形式TIM-1結合甲肝病毒有效率有關[8,12]。

筆者研究發(fā)現(xiàn)，相比于HAV RNA病毒載量和HAV IgM水平，TIM-1和TIM-4 mRNA水平對于HAV的發(fā)病及預后的預測更加靈敏，但是實驗對于預測的特異性沒有深入研究，接下來將對TIM-1和TIM-4 mRNA在HAV的具體發(fā)病機制作進一步研究。相信對TIM家簇基因與疾病的相關研究，必將加深人們對HAV免疫發(fā)病機制的理解，為HAV的預防、診斷和治療提供新思路。

參 考 文 獻：

[1]MCINTIRE J J, UMETSU S E, AKBARI O, et al.Identification of Tapr (an airway hyperreactivity regulatory locus) and the linked Tim gene family[J].Nat Immunol, 2001, 2(12):1109-1116.

[2]FEIGELSTOCK D, THOMPSON P, MATTOO P, et al.The human homolog of HAVcr-1 codes for a hepatitis A virus cellular receptor[J].J Virol, 1998, 72(8):6621-6628.

[3]DE SOUZA A J, ORISS T B, O’MALLEY K J, et al.T cell Ig and mucin 1 (TIM-1) is expressed on in vivo-activated T cells and provides a costimulatory signal for T cell activation[J].Proc Natl Acad Sci USA, 2005, 102(47):17113-17118.

[4]CORRAL-JARA K F, TRUJILLO-OCHOA J L, REALPE M, et al.Conjugated bilirubin differentially regulates cd4+t effector cells and t regulatory cell function through outside-in and insideout mechanisms:the effects of HAV cell surface receptor and intracellular signaling[J].Mediators Inflamm, 2016, 2016:DOI:10.1155/2016/1759027.

[5]LIN J, CHEN L, KANE L P.Murine Tim-1 is excluded from the immunological synapse[J].F1000Res, 2012, 1:10.

[6]LI J, ZHAO X, LIU X, et al.Disruption of TIM-4 in dendritic cell ameliorates hepatic warm IR injury through the induction of regulatory T cells[J].Mol Immunol, 2015, 66(2):117-125.

[7]RENNERT P D.Novel roles for TIM-1 in immunity and infection[J].Immunology Letters, 2011, 141(1):28.

[8]MEYERS J H, CHAKRAVARTI S, SCHLESINGER D, et al.TIM-4 is the ligand for TIM-1, and the TIM-1–TIM-4 interaction regulates T cell proliferation[J].Nature Immunology, 2005, 6(5):455-464.

[9]RODRIGUEZ-MANZANET R, DEKRUYFF R, KUCHROO V K,et al.The costimulatory role of TIM molecules[J].Immunol Rev,2009, 229(1):259-270.

[10]XU X G, HU J F, MA J X, et al.Essential roles of TIM-1 and TIM-4 homologs in adaptive humoral immunity in a zebrafish model[J].J Immunol, 2016, 196(4):1686-1699.

[11]SUN H W, WU C, TAN H Y, et al.A new development of FG-CC’siRNA blocking interaction of Tim-1 and Tim-4 can enhance DC vaccine against gastric cancer[J].Hepatogastroenterology, 2012,59(120):2677-2682.

[12]KIM H Y, EYHERAMONHO M B, PICHAVANT M, et al.A polymorphism in TIM1 is associated with susceptibility to severe hepatitis A virus infection in humans[J].Journal of Clinical Investigation, 2011, 121(3):1111-1118.