張笑博，孟祥潮，張雪鵬，孫影，賈文婷

（1.華北理工大學(xué)附屬醫(yī)院 腫瘤外科，河北 唐山 063000；2.華北理工大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院 病理科，河北 唐山 063210）

解聚素-金屬蛋白酶17（a disintegrin and metalloteinase 17，ADAM17）作為一種膜蛋白，可剪切活化腫瘤壞死因子-α[1-3]。其剪切活化多種表皮生長因子受體(epidermal growth factor receptor，EGFR)的配體來激活EGFR及下游通路，促進腫瘤細胞的侵襲、轉(zhuǎn)移[4-6]。RNA干擾是將siRNA或短發(fā)夾RNA（short hairpin RNA，shRNA）載體轉(zhuǎn)入靶細胞，高效沉默目的基因，從而實現(xiàn)該基因功能的缺失[7]。本實驗利用慢病毒介導(dǎo)ADAM17-shRNA轉(zhuǎn)染MCF-7乳腺癌細胞，然后種植于裸小鼠皮下，觀察ADAM17-shRNA對乳腺癌生物學(xué)行為的影響并探究其作用機制，為以ADAM17為靶點的新藥開發(fā)提供實驗基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

30只BALB/c-nu/nu裸鼠，4周齡，雌性，體重約16～20 g，由北京華阜康生物科技有限公司提供。人乳腺癌MCF-7細胞系購于中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院天津血液研究所，兔抗鼠ADAM17、EGFR、蛋白激酶B（protein kinase B，PKB）（又稱Akt）及細胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶（extracellular regulated protein kinases，ERK）由英國Abcam公司提供，攜帶紅色熒光的ADAM17-shRNA慢病毒和攜帶紅色熒光的ADAM17-shNC慢病毒由上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司設(shè)計合成。

1.2 培養(yǎng)MCF-7細胞

將乳腺癌細胞置于含10%胎牛血清和1%抗生素（青霉素、鏈霉素）的DMEM高糖培養(yǎng)基中，在37℃、5%二氧化碳CO2飽和濕度培養(yǎng)箱中無菌培養(yǎng)。

1.3 ADAM17-shRNA轉(zhuǎn)染MCF-7細胞

取生長至60%融合的乳腺癌細胞，用攜帶紅色熒光蛋白且感染復(fù)數(shù)約為100的ADAM17-shRNA慢病毒轉(zhuǎn)染，轉(zhuǎn)染試劑為Lipofectamine 2000，根據(jù)說明書操作。24 h后換液，置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)。3 d后熒光顯微鏡下觀察轉(zhuǎn)染效率，拍片，3次平行實驗。

1.4 腫瘤細胞的種植與組織處理

將30只裸鼠隨機分為轉(zhuǎn)染組（接種轉(zhuǎn)染ADAM17-shRNA的乳腺癌MCF-7細胞）、空載體組（接種轉(zhuǎn)染shNC的乳腺癌MCF-7細胞）及對照組（接種正常乳腺癌MCF-7細胞），每組10只。3組細胞分別制成密度為5×105個/ml的單細胞懸液，裸鼠腹腔內(nèi)注射雌激素3 d后，稱重，麻醉。將現(xiàn)制的3組細胞懸液以0.2 ml/只，分別種植在各組裸鼠右側(cè)鼷部皮下，SPF環(huán)境中繼續(xù)飼養(yǎng)。12 d后接種部位出現(xiàn)明顯質(zhì)地較硬的腫瘤結(jié)節(jié)，1次/4 d，測量腫瘤最長徑及其與之垂直方向的最大橫徑并計算瘤結(jié)節(jié)體積和抑瘤率。

移植后第28天處死裸鼠，取出移植瘤，繪制腫瘤生長曲線。將瘤體組織分成2份，一份用4%低聚甲醛固定、包埋及切片，行蘇木精-伊紅染色法（hematoxylin-eosin staining，HE）染色。另一份于-80℃冰箱保存，待后續(xù)實驗使用。

1.5 HE染色

將固定好的腫瘤組織依次經(jīng)過石蠟包埋、切片，常規(guī)行HE染色，分別于100和400倍光學(xué)顯微鏡下觀察移植瘤組織的形態(tài)變化。

1.6 Western blot檢測

Western blot檢測 ADAM17、EGFR、Akt及 ERK蛋白的表達，將3組瘤體分別用預(yù)冷的磷酸鹽緩沖液清洗3次后，稱取100 mg左右腫瘤組織，置于5 ml EP管中，滴加1 ml預(yù)冷的組織裂解液（含2%蛋白酶抑制劑），4℃冰上裂解1 h。用眼科剪將移植瘤組織剪碎，組織懸液4℃，12 000 r/min，離心10min?？捡R斯亮藍法測定蛋白濃度，煮沸變性，各組取30 μg樣本加入泳道，配制5%濃縮膠和10%分離膠，進行8% SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳。在4℃冰浴條件下，90 V電壓電泳至出現(xiàn)紅色Marker，調(diào)電壓至120 V，隨后電轉(zhuǎn)至聚偏氟乙烯膜。以5%脫脂奶粉室溫封閉1 h后，滴加一抗anti-ADAM17、anti-EGFR、anti-phosphorylatedEGFR、anti-Akt、antiphosphorylated Akt、anti-ERK、anti-phosphorylated ERK及β-actin，比例均為1∶1 000，4℃孵育過夜。TBST清洗，滴加辣根過氧化物酶標記的二抗室溫孵育1 h，增強化學(xué)發(fā)光劑顯色，凝膠成像系統(tǒng)掃描條帶，Image J軟件分析光密度值。

1.7 統(tǒng)計學(xué)方法

數(shù)據(jù)分析采用SPSS 20.0統(tǒng)計軟件，計量資料以均數(shù)±標準差（±s）表示，比較用單因素或重復(fù)測量設(shè)計的方差分析，兩兩比較用LSD-t檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 ADAM17-shRNA轉(zhuǎn)染率

將攜帶紅色熒光且感染復(fù)數(shù)為100的慢病毒轉(zhuǎn)染MCF-7乳腺癌細胞72 h，置于熒光顯微鏡下，根據(jù)轉(zhuǎn)染細胞的最強熒光判斷轉(zhuǎn)染率，可見熒光率＞80%，證明慢病毒介導(dǎo)的ADAM17-shRNA成功轉(zhuǎn)染MCF-7細胞。見圖1。

圖1 MCF-7細胞轉(zhuǎn)染效果 （熒光顯微鏡×400）

2.2 各組裸鼠體內(nèi)抑瘤效果

根據(jù)各組移植瘤平均體積，繪制腫瘤生長曲線。3組裸鼠成瘤后12、16、20、24和28 d的瘤體體積比較，采用重復(fù)測量設(shè)計的方差分析，結(jié)果：①不同時間點的瘤體體積比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（F=8452.421，P=0.000）；②3組裸鼠的瘤體體積比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（F=934.321，P=0.000），轉(zhuǎn)染組較對照組、空載體組瘤體體積生長緩慢，相對抑瘤效果較好；③3組裸鼠的腫瘤體積變化趨勢比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（F=768.389，P=0.000）。見表1和圖2、3。

表1 3組裸鼠不同時間點腫瘤體積比較 （n =10，mm3，±s）

表1 3組裸鼠不同時間點腫瘤體積比較 （n =10，mm3，±s）

組別 12 d 16 d 20 d 24 d 28 d對照組 148.331±11.008 190.837±13.346 282.412±15.648 473.118±16.700 639.821±15.429空載體組 146.931±11.417 191.581±15.490 283.675±19.734 479.950±21.359 643.350±15.543轉(zhuǎn)染組 72.743±8.702 108.668±9.567 147.156±14.015 194.037±14.842 240.233±10.536

2.3 移植瘤組織的形態(tài)學(xué)變化

HE染色結(jié)果顯示，移植瘤組織呈乳腺浸潤性導(dǎo)管癌特征：實質(zhì)與間質(zhì)分界清楚，癌細胞呈巢狀、梁索狀及腺管狀分布，異型性明顯，染色質(zhì)凝集呈粗顆粒狀，核仁增大，并可見多數(shù)核分裂相；對照組與空載體組無明顯差異；轉(zhuǎn)染組較對照組、空載體組壞死多。見圖4。

2.4 3組裸鼠ADAM17、EGFR、p-EGFR、Akt、p-Akt、ERK及p-ERK蛋白表達水平

3 組裸鼠的 ADAM17、EGFR、p-EGFR、Akt、p-Akt、ERK及p-ERK蛋白表達水平比較，采用單因素方差分析，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），轉(zhuǎn)染組腫瘤組織中 ADAM17、EGFR、p-EGFR、Akt、p-Akt、ERK 及 p-ERK的蛋白表達水平與對照組和空載體組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），轉(zhuǎn)染組低于對照組和空載體組見表2和圖5。

圖2 處死后的荷瘤裸鼠及其腫瘤

圖3 3組裸鼠不同時間點的腫瘤體積變化趨勢

圖4 移植瘤組織的形態(tài)學(xué)變化 （HE染色）

表2 3組裸鼠ADAM17、EGFR、p-EGFR、Akt、p-Akt、ERK及p-ERK蛋白表達水平比較 （n =10，±s）

表2 3組裸鼠ADAM17、EGFR、p-EGFR、Akt、p-Akt、ERK及p-ERK蛋白表達水平比較 （n =10，±s）

組別 ADAM17 EGFR p-EGFR Akt p-Akt ERK p-ERK對照組 0.57±0.03 0.92±0.10 0.46±0.07 0.63±0.06 0.61±0.04 1.18±0.04 0.81±0.38空載體組 0.64±0.05 0.98±0.13 0.48±0.03 0.69±0.05 0.67±0.03 1.25±0.21 0.83±0.89轉(zhuǎn)染組 0.18±0.02 0.34±0.05 0.33±0.05 0.21±0.05 0.26±0.05 0.36±0.10 0.40±0.69 F值 90.049 39.210 8.230 65.090 53.360 35.330 39.150 P值 0.001 0.000 0.010 0.000 0.000 0.000 0.000

圖5 3組裸鼠腫瘤組織中p-EGFR、EGFR、ADAM17、p-Akt、Akt、p-ERK及ERK蛋白的表達

3 討論

乳腺癌是全球女性最常見的惡性腫瘤之一。近年來，乳腺癌發(fā)病日趨年輕化，已嚴重影響年輕女性的身心健康，在女性惡性腫瘤死因中居首位[8-9]。據(jù)統(tǒng)計，2008年全球新發(fā)女性乳腺癌患者140萬，占全部女性惡性腫瘤發(fā)病率的24.1%[10]。盡管外科手術(shù)、放化療技術(shù)水平逐漸提高，但并沒有改善乳腺癌患者預(yù)后。其中腫瘤細胞高度侵襲是乳腺癌患者的主要死因，因此，靶向治療受到極大關(guān)注。

ADAM其重要功能是水解細胞膜上的腫瘤壞死因子，故又稱為腫瘤壞死因子α前體轉(zhuǎn)換酶[11]。ADAM17具有多個功能結(jié)構(gòu)域，這些結(jié)構(gòu)有水解蛋白、釋放活性因子功能[12]。其與ADAMs家族其他成員一樣，可以剪切多種EGFR配體，進而激活EGFR等相關(guān)信號傳導(dǎo)通道，影響腫瘤細胞的增殖、侵襲及轉(zhuǎn)移[13]。RNA干擾是雙鏈RNA所導(dǎo)致的特異性序列轉(zhuǎn)錄后基因沉默，已成為沉默目的基因表達的有效手段[14]。蔡準等[15]在細胞水平研究發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)染ADAM17-shRNA的人MCF-7乳腺癌細胞中ADAM17 mRNA和ADAM17蛋白表達水平下降，機制與其對ADAM17基因有沉默作用有關(guān)。陳國福等[16]利用shRNA干擾沉默人乳腺癌MCF-7細胞中ADAM17，發(fā)現(xiàn)實驗組的MCF-7細胞進入S期和G2/M期的比例低于對照組和干擾組。劉永存等[17]采用免疫組織化學(xué)、Western blot檢測法發(fā)現(xiàn)，通過抑制ADAM17的表達可以進一步沉默Hep G2的血管內(nèi)皮細胞生長因子受體2蛋白的表達水平。研究發(fā)現(xiàn)，ADAM17在多種惡性腫瘤組織，如胃癌、乳腺癌及腦膠質(zhì)瘤中高表達，與腫瘤的增殖、侵襲及轉(zhuǎn)移等密切相關(guān)。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，利用siRNA沉默ADAM17表達后，在細胞和動物水平可有效抑制乳腺癌的增殖、轉(zhuǎn)移及侵襲，同時將ADAM17-siRNA注射到MCF-7裸鼠移植瘤周圍，腫瘤的生長受到抑制[1,18-20]。因為shRNA比siRNA作用更穩(wěn)定、高效且特異性更強，本課題組在細胞水平也證實ADAM17-shRNA可有效抑制乳腺癌的生長和侵襲[19-20]。本研究針對ADAM17基因設(shè)計合成特異性慢病毒介導(dǎo)的ADAM17-shRNA，并將其成功轉(zhuǎn)染入MCF-7細胞，然后將其種植于裸鼠皮下，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染ADAM17-shRNA的MCF-7細胞在裸鼠體內(nèi)的生長受到抑制。

多項體外研究證明，ADAM17活化EGFR后，激活EGFR-PI3K-Akt和/或EGFR-MEK-ERK信號傳導(dǎo)通道，進一步影響腫瘤細胞的增殖、侵襲及遷移[8,13-17]。ZHENG 等[21]證明，ADAM17通過活化EGFR-PI3K-Akt促進膠質(zhì)瘤細胞的增殖和侵襲。GIRICZ等[22]證明，ADAM17通過激活EGFRPI3K-Akt信號通路促進乳腺癌細胞的增殖和轉(zhuǎn)移。THOMPSON等[23]研究發(fā)現(xiàn)，MEK-ERK通路在腫瘤形成及發(fā)展過程中起重要作用。但目前在動物水平驗證ADAM17作用機制的報道少見。本研究利用轉(zhuǎn)染ADAM17-shRNA的MCF-7乳腺癌裸鼠移植瘤模型，發(fā)現(xiàn)伴隨著ADAM17蛋白在轉(zhuǎn)染組腫瘤組織中的表達下降，轉(zhuǎn)染組腫瘤組織中 EGFR、p-EGFR、Akt、p-Akt、ERK及p-ERK的蛋白表達水平低于對照組和空載體組。說明ADAM17-EGFR-PI3K-Akt和ADAM17-EGFR-MEK-ERK 2條信號傳導(dǎo)通路均參與ADAM17-shRNA的作用過程。

參 考 文 獻：

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