高清松 孫輝 陳國沖 韋雨亭 黃雨晴 史勝男 胥明 周建

摘要 [目的]鑒定出玉米基因組中的β-甘露聚糖酶基因（MAN），并分析其進化機制和表達模式。[方法]利用擬南芥MAN蛋白序列在玉米基因組數(shù)據(jù)庫以及NCBI非冗余蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫中比對搜索，獲取玉米MAN家族全部成員；通過檢索植物基因組復制數(shù)據(jù)庫查找玉米MAN基因的片段復制事件；利用GSDS 2.0服務器分析基因外顯子/內(nèi)含子結(jié)構(gòu)；采用MEGA7軟件極大似然法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹；利用芯片數(shù)據(jù)分析基因在不同組織器官中的表達模式。[結(jié)果]玉米基因組中含有6個MAN基因，分布于5條染色體上。沒有玉米MAN基因起源于片段復制或串聯(lián)重復事件。系統(tǒng)發(fā)育分析將植物MAN蛋白分為3個亞族（I～Ⅲ），說明其序列已發(fā)生分化。玉米MAN基因結(jié)構(gòu)較為保守，蛋白質(zhì)均含有甘露聚糖酶的核心基序。玉米MAN基因具有不同的表達模式，部分基因在發(fā)育葉片中表達量較高，部分基因在減數(shù)分裂期雄穗中表達量較高，而其余基因在胚芽鞘、初生根、授粉前果穗、花絲和發(fā)育種子中表達量較高。[結(jié)論]該研究結(jié)果為

進一步研究玉米MAN基因功能奠定了基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞 玉米；甘露聚糖酶；基因家族；進化分析；表達分析

中圖分類號 S188+.1文獻標識碼 A文章編號 0517-6611（2018）16-0093-04

Abstract [Objective] To identify βmannanase genes （MAN） in maize and analyze their evolutionary mehanisms and expression profiles.[Method] The protein sequences of Arabidopsis MANs were used to search the Maize Genetics and Genomics and NCBI nonredundant protein databases to identify all maize MAN genes.The segmental duplication events of maize MAN genes were retrieved in the Plant Genome Duplication Database.The GSDS 2.0 server was used to analyze the exon/intron structures of genes.The phylogenetic tree was constructed using MEGA7 with a maximum likelihood method.The expression profiles of maize MAN genes were examined using microarray data.[Result] The maize genome contains six MAN genes，which are distributed on five chromosomes.No maize MAN genes were found to originate through segmental or tandem duplication events.Phylogenetic analysis divided plant MAN proteins into three subfamilies （ⅠⅢ），suggesting that their sequences have diverged.The structures of maize MAN genes are relatively conserved，and their encoding proteins all have the core motifs for mannanase activity.Maize MAN genes have distinct expression patterns； some of them have higher expressions in developing leaves，some in meiotic tassels，while others in coleoptiles，primary roots，prepollination cobs，silks and developing seeds.[Conclusion] These results lay a solid foundation for further functional analysis of maize MAN genes.

Key words Maize；Mannanase；Gene family；Evolutionary analysis；Expression analysis

植物細胞壁由纖維素、半纖維素和果膠等多糖及蛋白質(zhì)組成。細胞壁降解在植物種子萌發(fā)、葉片形成、花發(fā)育、果實成熟等生長發(fā)育過程及環(huán)境應答中發(fā)揮重要作用[1]。甘露聚糖是由甘露糖通過β-1，4-糖苷鍵連接而成的線狀多糖。如果主鏈中的部分甘露糖殘基被葡萄糖取代，或者甘露糖殘基上連有半乳糖，則形成異甘露聚糖，包括葡甘露聚糖、半乳甘露聚糖和半乳葡甘露聚糖[2]。甘露聚糖和異甘露聚糖是構(gòu)成植物半纖維素的第二大組分[3-4]。這些物質(zhì)的分解主要依靠β-甘露聚糖酶（Endo-β-Mannanase，MAN）完成。MAN在細菌、真菌和植物中均能合成。根據(jù)糖類活性酶數(shù)據(jù)庫（CAZY）的分類，MAN屬于糖基水解酶超家族中的家族5和26，而在植物中合成的MAN均屬于家族5[5]。由于MAN具有較高的工業(yè)、食品以及醫(yī)藥方面的應用價值，且其在微生物中來源豐富、活性高、提取方便，因此研究多集中在酶的微生物生產(chǎn)以及基因工程改造等方面[6]，而在植物中的報道相對較少。

植物中首個MAN基因LeMAN1是從番茄種子中分離出來的，主要在萌發(fā)后種子的胚乳中表達，可能通過分解胚乳細胞壁中半乳甘露聚糖為幼苗生長提供營養(yǎng)[7]。隨后，在番茄中又分離出4個MAN基因LeMAN2、LeMAN3、LeMAN4和LeMAN5[8-9]。其中，LeMAN2和3也主要在萌發(fā)種子中表達；LeMAN4主要在番茄果實中表達，參與果實的成熟；LeMAN5主要在花藥和花粉中表達，參與花藥和花粉的發(fā)育[9-10]。擬南芥和水稻基因組中分別含有8個和9個MAN基因，分別命名為AtMAN1～AtMAN7和AtMANP以及OsMAN1～OsMAN8和OsMANP[11]。其中，擬南芥AtMAN3和4主要在角果中表達，AtMAN2、5、6和7在根、莖、葉、角果和種子中均有表達，AtMAN1在各組織器官中表達量很低，而AtMANP被證實為假基因[12]。AtMAN5、6和7基因的敲除突變體種子萌發(fā)速度顯著變緩[12]。水稻OsMAN1、2、4、6和8基因在根、莖、葉片和種子中均有表達，OsMAN3和OsMANP特異地在種子中表達，而OsMAN5和7在各組織器官中均未檢測到表達[11]。此外，楊樹基因組含有8個MAN基因[11]。其中，PtMAN4、6和8在分化的木質(zhì)部組織中特異表達，PtMAN5在木質(zhì)部、韌皮部和葉片中均有表達，PtMAN7主要在幼葉和葉尖中表達，而其他基因在上述組織中未檢測到表達[13]。過表達PtMAN6導致楊樹細胞壁松弛，并抑制木質(zhì)部次生細胞壁增厚，而下調(diào)其表達則促進次生細胞壁增厚[13]。進一步分析發(fā)現(xiàn)，PtMAN6降解作用產(chǎn)生的寡糖作為重要的信號分子發(fā)揮作用。

玉米是我國第一大糧食作物。雖然MAN基因在番茄、水稻、擬南芥、楊樹等植物中已有報道，但在重要作物玉米中的成員及其功能還不清楚。筆者采用生物信息學方法對玉米基因組中的MAN基因進行系統(tǒng)鑒定，并對其進化機制和表達模式進行分析，旨在為玉米MAN基因的功能研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 玉米MAN基因的鑒定

以擬南芥中8個MAN蛋白的氨基酸序列作為查詢序列，在玉米遺傳學和基因組學數(shù)據(jù)庫（MaizeGDB，https：//www.maizegdb.org/）以及NCBI非冗余蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫中進行BlastP比對搜索，獲取候選序列，閾值設(shè)定為E≤10-10。將候選序列輸入Pfam數(shù)據(jù)庫（http：//pfam.xfam.org/）驗證是否存在糖基水解酶家族5結(jié)構(gòu)域（獲取號：PF00150），如果存在，則認為屬于MAN家族。去除不完整序列和冗余序列，下載其余序列的座位號、基因組位置等信息。利用ProtParam工具（https：//web.expasy.org/protparam/）計算蛋白質(zhì)等電點和分子量，利用TargetP（http：//www.cbs.dtu.dk/services/TargetP/）進行蛋白質(zhì)亞細胞定位預測。

1.2 染色體分布、基因復制和基因結(jié)構(gòu)分析

利用MapChart軟件繪制染色體分布圖。通過檢索植物基因組復制數(shù)據(jù)庫（PGDD，http：//chibba.agtec.uga.edu/duplication/index/locus）查找玉米MAN基因的片段復制事件。利用GSDS 2.0服務器（http：//gsds.cbi.pku.edu.cn/）分析玉米MAN基因的外顯子/內(nèi)含子結(jié)構(gòu)。

1.3 蛋白質(zhì)系統(tǒng)發(fā)育和保守序列分析

利用ClustalW工具進行蛋白質(zhì)多序列比對，采用MEGA7軟件極大似然法基于JTT模型構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹[14]，gap處理設(shè)置為partial deletion，位點覆蓋閾值設(shè)定為95%。Bootstrap重抽樣進行了100次。利用MEME程序（http：//memesuite.org/tools/meme）預測玉米MAN蛋白的保守基序，采用InterProScan工具（http：//www.ebi.ac.uk/interpro/search/sequencesearch）對基序序列做進一步注釋。

1.4 基因表達分析

從植物表達數(shù)據(jù)庫（PLEXDB，http：//www.plexdb.org/）下載利用Nimblegen玉米全基因組芯片平臺生產(chǎn)的玉米B73全生育期基因表達數(shù)據(jù)，從中檢索玉米MAN基因的表達值，利用Cluster 3.0軟件完全連鎖法對平均表達值進行層級聚類，繪制基因表達熱圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 玉米MAN基因的鑒定

利用擬南芥MAN蛋白序列在MaizeGDB和NCBI非冗余蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫中比對搜索，共鑒定出玉米基因組中6個MAN基因。根據(jù)基因在染色體上的位置系統(tǒng)命名為ZmMAN1～ZmMAN6（表1）。所有玉米MAN基因均有EST記錄支持，表明它們均是表達的基因。玉米MAN蛋白的長度為314～470 aa，等電點為5.4～10.8，蛋白質(zhì)分子量為35 291.3～52 465.3 Da（表1）。蛋白質(zhì)亞細胞定位預測表明，多數(shù)玉米MAN蛋白為分泌蛋白，與其他植物MAN蛋白的定位一致[11，13]。

2.2 玉米MAN基因的染色體分布和蛋白質(zhì)系統(tǒng)發(fā)育分析

玉米MAN基因分布于5條染色體上，其中3號染色體含有2個基因，其余染色體均含有1個基因（圖1）?；驈椭品治霰砻?，沒有基因起源于片段復制事件。此外，玉米MAN基因在染色體上相距較遠，也不是起源于串聯(lián)重復事件。轉(zhuǎn)錄方向分析表明，有2個基因（ZmMAN2和3）為反向轉(zhuǎn)錄，其余基因均為正向轉(zhuǎn)錄（圖1）。

為研究植物MAN蛋白的進化歷史與機制，對番茄、擬南芥、楊樹、水稻和玉米MAN蛋白共36條序列構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。結(jié)果表明，植物MAN蛋白可以分為3個亞族（Ⅰ～Ⅲ，圖2），說明該家族蛋白的序列和功能可能已經(jīng)發(fā)生分化；每個亞族均含有單、雙子葉植物序列，說明該家族的基本特征在單、雙子葉植物分化之前就已經(jīng)建立。在系統(tǒng)發(fā)育樹的末端各發(fā)現(xiàn)了2對番茄、擬南芥、楊樹和水稻旁系同源基因，說明該家族在這些物種中以物種特異的方式進行了擴張。玉米MAN蛋白在3個亞族中均有分布，但未發(fā)現(xiàn)旁系同源基因。所有番茄MAN蛋白均位于亞族I中。

2.3 玉米MAN基因結(jié)構(gòu)和蛋白質(zhì)保守序列分析

通過將玉米MAN基因的cDNA序列與基因組序列比較確定基因的外顯子/內(nèi)含子結(jié)構(gòu)。除ZmMAN3和4基因含有4個外顯子之外，其余基因均含有5個外顯子（圖3）。ZmMAN6含有較大的內(nèi)含子。內(nèi)含子相位分析表明，亞族Ⅱ基因具有相同的內(nèi)含子相位，而其余亞族基因的內(nèi)含子相位均不保守。

蛋白質(zhì)保守序列分析共鑒定出玉米MAN蛋白中8個保守的基序（圖4）。其中，ZmMAN4不含基序6和8，ZmMAN5不含基序6，ZmMAN6不含基序8，其余蛋白均含有8個基序。通過在InterPro數(shù)據(jù)庫中檢索，對基序序列做進一步分析。結(jié)果表明，基序1、2、4、5和7為甘露聚糖酶活性的核心基序；基序3屬于未命名蛋白家族（獲取號：PTHR31451）；基序6和8為糖基水解酶家族的共有基序。

2.4 玉米MAN基因表達模式分析

為研究玉米MAN基因的功能，利用芯片數(shù)據(jù)詳細分析了基因在20個組織中的表達模式，結(jié)果表明，玉米MAN基因的表達已經(jīng)發(fā)生了顯著的分化（圖5）。其中，ZmMAN1在發(fā)育葉片中的表達量較高，而在莖稈和授粉24 d后胚乳中表達量較低；ZmMAN4和5在減數(shù)分裂期雄穗中表達量較高；ZmMAN2在胚芽鞘、初生根、授粉前果穗和授粉4 d后的種子中表達量較高，而在萌發(fā)種子、發(fā)育中的葉片、花藥和授粉24 d后的胚乳中表達量較低；ZmMAN3在幼葉、花絲、授粉4 d和12 d后的種子中表達量較高；ZmMAN6在9葉期葉片、授粉前果穗、花絲和授粉4 d后種子中表達量較高，而在萌發(fā)種子和授粉24 d后胚乳中表達量較低。值得注意的是，基于基因表達模式的聚類結(jié)果與系統(tǒng)發(fā)育樹的亞族劃分并不一致，說明氨基酸序列的相似性不能完全反映基因表達模式的相似。

3 結(jié)論與討論

甘露聚糖是組成植物細胞壁的重要半纖維素多糖。MAN通過水解甘露聚糖使細胞壁松弛，在植物分生組織生長、果實成熟、程序性細胞死亡以及種子萌發(fā)等過程中發(fā)揮重要功能[5]。該研究采用生物信息學方法鑒定出玉米基因組中6個MAN基因，分布于5條染色體上。這些基因的外顯子/內(nèi)含子結(jié)構(gòu)相對保守，并且編碼蛋白都含有甘露聚糖酶的核心基序，但基因的表達模式已經(jīng)發(fā)生了顯著的分化。這些結(jié)果為玉米MAN基因的進一步功能研究奠定了基礎(chǔ)。

基因復制是植物基因家族進化的重要動力?；驈椭瓶梢酝ㄟ^片段復制、串聯(lián)重復和逆轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座等方式產(chǎn)生[15]。玉米基因組中含有6個MAN基因?；驈椭品治霰砻鳎瑳]有玉米MAN基因起源于片段復制或串聯(lián)重復事件，這可能是復制后基因丟失的結(jié)果。另一方面，由于玉米基因組的注釋還不夠完善，可能部分基因未被注釋出來。近來研究表明，禾本科植物二穗短柄草基因組也含有6個MAN基因，并且沒有基因起源于復制事件[16]。

擬南芥、水稻和楊樹MAN基因的外顯子/內(nèi)含子結(jié)構(gòu)分析表明，多數(shù)基因含有5個外顯子，說明該結(jié)構(gòu)是植物MAN基因的典型結(jié)構(gòu)，可能來自于共同的祖先基因[11]。此外，雖然植物MAN基因的內(nèi)含子位置相對保守，但同一內(nèi)含子的大小在不同基因之間變化較大。該研究中多數(shù)玉米MAN基因含有5個外顯子，且外顯子大小相對保守，但部分基因的內(nèi)含子大小變異較大（圖3），與其他植物中的研究一致。蛋白質(zhì)保守基序分析表明，玉米MAN蛋白均含有甘露聚糖酶催化的核心基序，表明它們可能都是有活性的甘露聚糖酶。

甘露聚糖存在于植物的各種組織中，如在擬南芥中整株都有分布，但在花、角果和莖稈中含量更為豐富[17]。其在植物細胞壁中的功能一方面通過與纖維素結(jié)合發(fā)揮支撐作用，另一方面在胚乳細胞壁以及種子和營養(yǎng)組織的液泡中作為非淀粉碳水化合物儲藏[2]。MAN是催化甘露聚糖骨架水解的關(guān)鍵酶[3]。基因表達模式分析表明，水稻、擬南芥和楊樹MAN基因的表達已經(jīng)發(fā)生了顯著的分化。部分基因在各組織器官中呈組成型表達，部分基因在角果、種子或木材木質(zhì)部中特異表達。這些結(jié)果表明，植物MAN基因可能在不同的生物過程中發(fā)揮功能[11]。該研究中玉米MAN基因的表達也已發(fā)生分化，部分基因在發(fā)育葉片中表達量較高，部分基因在減數(shù)分裂期雄穗中表達量較高，而另外一些基因在胚芽鞘、初生根、授粉前果穗、花絲和發(fā)育種子中表達量較高，說明玉米MAN基因可能在不同組織細胞壁甘露聚糖的降解中發(fā)揮作用。此外，系統(tǒng)發(fā)育分析將植物MAN蛋白分為3個不同的亞族，說明其序列已經(jīng)發(fā)生分化，推測不同亞族的蛋白可能分解不同類型的甘露聚糖。進一步通過突變體和過表達分析將有助于闡明玉米MAN基因的生理功能。

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