許魁 徐前明 張志忠

摘要 [目的]對安徽省泗縣豬附紅細胞體病進行流行病學(xué)調(diào)查。[方法]從泗縣3個鄉(xiāng)鎮(zhèn)收集300份疑似病例血樣，對其進行血液涂片檢查、PCR檢測和基因測序。[結(jié)果]不同規(guī)?；蝻曫B(yǎng)方式的豬場豬附紅細胞體感染情況不同。從調(diào)查地點來看，墩集鎮(zhèn)豬場感染率最高，達65%；其次是黃圩鎮(zhèn)，感染率為44%；大莊鎮(zhèn)豬場豬附細細胞體感染率最低，為39%。仔豬感染率低于育肥豬，育肥豬感染率為54.67%，仔豬感染率僅44.00%。[結(jié)論]安徽省泗縣豬附紅細胞體病感染率較高，應(yīng)加強預(yù)防和控制。

關(guān)鍵詞 泗縣；豬附紅細胞體??；流行病學(xué)；調(diào)查

中圖分類號 S851.31+3文獻標(biāo)識碼 A文章編號 0517-6611（2018）16-0079-03

Abstract [Objective] To make the epidemiological investigation of porcine eperythrozoonosis in Sixian County of Anhui Province.[Method] 300 suspected blood samples were collected from three towns of Sixian County to make blood smear test，PCR detection and gene sequencing.[Result] The infection situations of Eperythrozoon suis in pig farms with different scale or feeding methods were different.From the survey locations，the infection rate in pig farms of Dunji Town was the highest （65%），followed by that in Huangwei Town （44%），the infection rate in pig farms of Dazhuang Town was the lowest（39%）.The infection rate of piglets was lower than that of fattening pigs （54.67%），while the infection rate of piglets was 44.00%.[Conclusion] The infection rate of E.suis in Sixian County was higher，so its prevention and control should be strengthened.

Key words Sixian County；Porcine eperythrozoonosis；Epidemiology；Investigation

豬附紅細胞體病是危害養(yǎng)豬業(yè)較為嚴重的疫病之一，常引起溶血性黃疸、呼吸困難、身體虛弱、體溫升高、血液稀薄等癥狀，造成病豬高熱稽留不退、厭食絕食、咳嗽和氣喘。公豬尿鞘積尿，精神差；母豬產(chǎn)后奶水不足、哺育功能較弱?；疾∝i主要表現(xiàn)為繁殖障礙或生育障礙，這些問題給我國畜牧業(yè)帶來了巨大的經(jīng)濟損失[1-2]。為了全面了解安徽省泗縣豬感染附紅細胞體情況，筆者選取黃圩鎮(zhèn)、大莊鎮(zhèn)和墩集鎮(zhèn)為調(diào)查點，選擇30個具有代表性的豬場作為調(diào)查對象，采集全血300份，對其進行血液涂片檢查、PCR檢測和基因測序。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細胞與載體。大腸桿菌DH5α；pMD-18T載體購自TaKaRa公司。

1.1.2 主要試劑。

血液基因組DNA提取試劑盒和PCR試劑盒，均購自美國Omaga公司；DNA Maker 2000、瓊脂糖和溴化乙錠（EB）等均購自天根生物有限公司。

1.1.3 調(diào)查地點和調(diào)查對象。選擇具有代表性的墩集鎮(zhèn)、黃圩鎮(zhèn)、大莊鎮(zhèn)3個鄉(xiāng)鎮(zhèn)為調(diào)查地點，選取30個具有代表性的豬場作為調(diào)查對象，調(diào)查這3個鄉(xiāng)鎮(zhèn)養(yǎng)殖場豬附紅細胞體的感染情況。

1.2 方法

1.2.1 血液基因組提取。血液基因組提取按照Omaga血液基因組提取試劑盒說明書操作。

1.2.2 引物設(shè)計。

參照Messick[3]的方法進行引物設(shè)計。結(jié)合GenBank數(shù)據(jù)庫中登錄的16S rRNA序列，并將其作為模板，使用Primer primer 5.0軟件設(shè)計引物，P1為AAAAAGGCCCTCGGGTCTTT，P2為TCAATTATGTCCCAGGCACT。

1.2.3 目的基因的PCR擴增。PCR反應(yīng)條件如下：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性1 min，50 ℃退火1 min，72 ℃延伸1 min，30個循環(huán)；72 ℃延伸7 min，最后4 ℃下保存。

1.2.4 基因測序與分析。對菌落PCR鑒定為陽性的菌株進行序列測定，對所測定的序列在NCBI網(wǎng)站進行Blast序列分析，并使用MEGA 4.0軟件構(gòu)建遺傳進化樹。

1.2.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析。

將試驗數(shù)據(jù)進行匯總與統(tǒng)計分析，比較不同地點、規(guī)模、月齡和癥狀豬附紅細胞體的感染情況。

2 結(jié)果與分析

2.1 臨床癥狀觀察

試驗豬均表現(xiàn)出一定的患附紅細胞體病的特征。抽檢豬中，體溫升高30頭，檢出23頭感染附紅細胞體，檢出率為76.67%；皮膚變色40頭，檢出24頭感染附紅細胞體，檢出率為60%；飲食減少60頭，檢出24頭感染附紅細胞體，檢出率為40%；氣喘咳嗽20頭，檢出12頭感染附紅細胞體，檢出率為60%；排泄稀薄70頭，檢出35頭感染附紅細胞體，檢出率為50%；精神萎靡80頭，檢出30頭感染附紅細胞體，檢出率為37.50%。

2.2 血涂片染色鏡檢結(jié)果 取血樣制成血涂片，采用瑞氏血涂片染色法進行染色并鏡檢。從圖1可以看出，豬血液紅細胞發(fā)生變形，且表面有附紅細胞體分布[4-5]。

2.3 PCR檢測結(jié)果

從圖2可以看出，PCR擴增產(chǎn)物經(jīng)電泳檢測后發(fā)現(xiàn)700 bp左右的條帶，與預(yù)期結(jié)果相符。

2.4 基因測序結(jié)果

陽性克隆經(jīng)序列測定后，其大小700 bp，同源性分析結(jié)果表明其與豬附紅細胞體的同源性達85%。

2.5 不同地點養(yǎng)殖場的感染情況比較

由表1可知，雖然取樣豬場都在泗縣范圍內(nèi)，由于地理位置和環(huán)境不同，豬感染附紅細胞體情況也存在差異?？傮w來看，在黃圩鎮(zhèn)檢測的100頭豬中，可檢出44頭附紅細胞體呈陽性，感染率達44%；在大莊鎮(zhèn)檢測的100頭豬中，39頭豬呈陽性，感染率達39%；在對墩集鎮(zhèn)檢測的100頭豬中，有65頭豬體檢測出附紅細胞體，感染率達65%。由此可見，墩集鎮(zhèn)受檢豬附紅細胞體的感染率明顯高于黃圩鎮(zhèn)和大莊鎮(zhèn)。

2.6 不同規(guī)模養(yǎng)殖場的感染情況比較

由表2可知，50頭以下規(guī)模的豬場附紅細胞體感染率明顯高于200頭以上規(guī)模的豬場。200頭以上豬場共檢出48頭（黃圩鎮(zhèn)15頭、大莊鎮(zhèn)12頭、墩集鎮(zhèn)21頭），50頭以下豬場共檢出100頭（黃圩鎮(zhèn)29頭、大莊鎮(zhèn)27頭、墩集鎮(zhèn)44頭）。

2.7 不同月齡豬群的感染情況比較

由表3可知，1～3月齡豬共150頭，附紅細胞體感染檢出頭數(shù)為66頭（黃圩鎮(zhèn)19頭、大莊鎮(zhèn)17頭、墩集鎮(zhèn)30頭），檢出率為44%；4～6月齡豬共150頭，附紅細胞體感染頭數(shù)82頭（黃圩鎮(zhèn)25頭、大莊鎮(zhèn)22頭、墩集鎮(zhèn)35頭），感染率為54.67%。4～6月齡豬附紅細胞體的感染率高于1～3月齡。

3 討論與結(jié)論

3.1 附紅細胞體感染情況

此次對泗縣豬感染附紅細胞體情況的調(diào)查發(fā)現(xiàn)，抽檢豬群感染率總體達49.33%，其中低月齡仔豬感染率為44%。此次調(diào)查結(jié)果與邰秀珍等[6]報道的夏秋季豬群附紅細胞體的感染率基本相一致。這說明該地區(qū)存在豬感染附紅細胞體情況，在不同規(guī)模豬場均有附紅細胞體污染現(xiàn)象，其中育肥感染率相對最高，總體達54.67%。

3.2 豬附紅細胞體病的診斷

建立豬附紅細胞體病的高效診斷方法是控制該病的有力手段和前提條件。附紅細胞體病癥狀臨床上并不是同時發(fā)生和存在的，而且還有別的疾病有同樣的癥狀，這就要求提高鑒別診斷手段的準確率。臨床上最需要鑒別診斷的是豬瘟、豬巴貝斯蟲（豬焦蟲）和豬肺疫，尤其與豬瘟的外部表現(xiàn)較為類似，在發(fā)病初期極端僅僅通過對癥狀進行觀察是很難做出準確判斷，只有等到發(fā)病中后期通過尸體解剖檢測的方式才能夠進行鑒別。

血涂片檢查法是血涂片經(jīng)姆薩染色或吖啶橙染色對血液樣本進行染色，然后用顯微鏡對涂片進行觀察。附紅細胞體姬姆薩氏染色呈藍紫色或粉紅紫色。瑞氏染色呈淡藍色。吖啶橙染色呈淡綠色熒光。它們的優(yōu)點都是簡單易操作，特征明顯易觀察。姬姆薩氏染色、瑞氏染色需注意要避免變性紅細胞如豪-周氏小體紅細胞、嗜堿性點彩紅細胞和多染性紅細胞等以及血小板、抗凝劑、染料顆粒這些因素的干擾；吖啶橙染色過程中也常常會發(fā)生假陽性事件。此外，這2種檢測方法的缺點是敏感性都較低，吖啶橙染色法還需有暗室和熒光顯微鏡[4]。此外，上述這些方法只能觀測到附著于紅細胞表面的附紅細胞體，而游離于紅細胞內(nèi)部的附紅細胞體卻無法得到有效地觀察。若采用改良方法，將血液經(jīng)生理鹽水進行一定比例稀釋后再染色，可在一定程度上減少染色顆粒的發(fā)生，降低假陽性率。該試驗中血涂片檢查也需要對豬全血進行稀釋，然后染色鏡檢，結(jié)果發(fā)現(xiàn)該方法在去除雜質(zhì)和染色顆粒方面有明顯地改善。

PCR診斷方法具有高敏感性和特異性強等優(yōu)點。在分子生物學(xué)診斷方法中最常用此方法。關(guān)于PCR方法診斷附紅細胞體病報道較多。張浩吉等[7]以16S rRNA為檢測目的基因，建立了PCR診斷貓附紅細胞體感染情況的檢測方法，證實該方法具有良好的特異性和敏感性。Oberst等[8]

在豬附紅體感染高峰期取樣，從中分離出豬附紅細胞體。提取DNA后以32P標(biāo)記制成探針，能區(qū)別感染豬和非感染豬，且不與感染其他病的豬血清中DNA發(fā)生雜交反應(yīng)。后來，進一步利用PCR技術(shù)檢測豬附紅細胞體的感染情況，證明其敏感性高，同時證明感染附紅細胞體的豬在24 h后即可檢測出。

獸醫(yī)臨床診斷方法不準確，而PCR檢測方法對于儀器設(shè)備以及操作人員的要求都過高，不適合鄉(xiāng)鎮(zhèn)級畜牧獸醫(yī)水產(chǎn)站和一般規(guī)模養(yǎng)殖場使用，還是需要用病原學(xué)檢測方法（如瑞氏血涂片染色法）進行確診。因為病原學(xué)方法無論是成本還是設(shè)備儀器以及對操作人員的要求，都更適合鄉(xiāng)鎮(zhèn)獸醫(yī)站和一般規(guī)模養(yǎng)殖場使用。

參考文獻

[1] 李昕，張學(xué)軍，王近香，等.豬附紅細胞體病[J].中國畜牧獸醫(yī)，2005，32（11）：54-57.

[2] 韓子強，楊宏軍，李建基.動物附紅細胞體病的研究進展[J].動物科學(xué)與動物醫(yī)學(xué)，2002，19（7）：21-24.

[3] MESSICK J B.Hemotrophic mycoplasmas（hemoplasmas）：A review and new insights into pathogenic potential[J].Veterinary clinical pathology，2004，33（1）：2-13.

[4] 趙曉薇，巴彩鳳.附紅細胞體病的研究進展[J].中國人獸共患病學(xué)報，2007，23（10）：1047-1049，1058.

[5] 魏梅雄，馬杏寶，王龍英.附紅細胞體病及其分子生物學(xué)和發(fā)病機制的研究進展[J].旅行醫(yī)學(xué)科學(xué)，2006，12（3）：1-7.

[6] 邰秀珍，楊殿相，秦林金，等.人類附紅細胞體形態(tài)學(xué)特點[J].中國人獸共患病雜志，1998，14（5）：83-84.

[7] 張浩吉，謝明權(quán)，張健騑，等.豬附紅細胞體PCR檢測方法的建立和初步應(yīng)用[J].中國獸醫(yī)學(xué)報，2005，25（5）：480-483.

[8] OBERST R D，GWALTNAY S M，HAYS M P，et al.Experimental infections and natural outbreaks of eperythrozoonosis in pig identified by PCR-DNA hybridizations[J].J Ver Diagn Invest，1993，5（3）：351-358.