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        液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測定文蛤中3種腹瀉性貝類毒素

        2018-05-14 08:59:55張秋云朱曉華楊洪生沈美芳譚秀慧夏莉萍
        安徽農(nóng)業(yè)科學 2018年34期
        關鍵詞:串聯(lián)質(zhì)譜文蛤液相色譜

        張秋云 朱曉華 楊洪生 沈美芳 譚秀慧 夏莉萍

        摘要 [目的]以文蛤中的腹瀉性貝類毒素大田軟海綿酸貝類毒素(OA)、鰭藻毒素-1(DTX1)、鰭藻毒素-2(DTX2)為研究對象,建立腹瀉性貝類毒素的超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜(LC-MS/MS)檢測方法。[方法]以文蛤樣品為代表,用甲醇提取,采用堿水解將乙酰酯化的OA、DTX1、DTX2轉化成游離OA、DTX1、DTX 通過Strata-X柱凈化,過膜后,用液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜測定,以基質(zhì)標準曲線進行外標法定量。該試驗以流動相A為水溶液(含2 mmol/L甲酸銨和1‰甲酸),流動相B為乙腈溶液(含2 mmol/L甲酸銨和1‰甲酸),流速350 μL/min,柱溫40 ℃,負離子掃描,多反應監(jiān)測模式下進行定性與定量分析。[結果]3種腹瀉性貝類毒在1~100 μg/L關系良好,3個添加水產(chǎn)的回收率都在75%~90%,RSD都在3.0%~6.6%。[結論]利用此方法檢測文蛤中的腹瀉性貝類毒素具有靈敏度高、重復性好、操作簡單的特點?;厥章实染軡M足日常對3種常見的腹瀉性貝類毒素的檢測要求。

        關鍵詞 腹瀉性貝類毒素;液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜;文蛤

        中圖分類號 TS254.7文獻標識碼 A文章編號 0517-6611(2018)34-0166-03

        腹瀉性貝類毒素(diarrhetic shellfish poisoning,DSP)是由有毒赤潮藻類鰭藻屬和原甲藻屬的一些種類產(chǎn)生的脂溶性多環(huán)醚類生物活性物質(zhì),不易溶于水,熱穩(wěn)定性極高[1],主要包括大田軟海綿酸貝類毒素(OA)、鰭藻毒素-1(DTX1)、鰭藻毒素-2(DTX2)[2]。該毒素可在貝類等濾食性動物體內(nèi)富集,通過食物鏈傳遞至人類,引起腹瀉性中毒,危害食用者健康[3]。腹瀉性貝類毒素在全球沿岸海域均有分布,是世界范圍內(nèi)最具威脅的赤潮藻毒素之一。腹瀉性貝毒雖然不是一種可致命的毒素,通常也只是引起輕微的腸胃疾病,而且癥狀消失也較快,沒有強烈的急性毒素,但是大田軟海綿酸貝類毒素是強烈的致癌因子,其長期毒性應該引起重視。目前常用腹瀉性貝類毒素檢測分析方法主要包括小鼠生物法[4]、液相色譜法[5]、液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法[6]、細胞毒性檢測法[7]、免疫熒光層析檢測法[8]等。小鼠生物法主要缺陷是操作繁瑣,不能確定樣本中毒素成分和結構;免疫熒光層析檢測法檢測成分假陽性率較高,結果不能代表樣本整體毒性;液相色譜法需要繁瑣的衍生步驟,衍生試劑存在性質(zhì)不穩(wěn)定等問題,可能會導致DSP不能夠完全衍生化[9-12],而且對結構類似物不能有效地分離,在靈敏度和選擇性上還有待改進;液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜檢測方法結合了質(zhì)譜強大的定性定量功能和液相色譜優(yōu)越的分離能力,現(xiàn)在越來越多地被應用到腹瀉性貝類毒素的分析檢測中。

        筆者建立了3種代表性DSP毒素OA、DTX1、DTX2的液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜(LC-MS/MS)檢測方法。

        1 材料與方法

        1.1 試材 OA、DTX1、DTX2 標準品購自加拿大海洋生物科學研究所(NRC)。色譜級甲醇(TEDIA公司),色譜級乙腈(TEDIA公司),色譜級甲酸、色譜級氨水(ROE公司),色譜級甲酸銨(含量≥99.0%),色譜級氫氧化鈉(含量≥980%),實驗室用水為超純水。文蛤購買于南京市某水產(chǎn)品市場。

        1.2 儀器

        1290 型高效液相色譜(美國 Agilent 公司),AB 4500Trap 三重四級桿液質(zhì)聯(lián)用儀(Applied Biosystems C),TE612-L型電子天平(S 公司),Allegra 64R型高速冷凍離心機(BECKMAN COULTER 公司),Maxi Mix Ⅱ型旋渦混勻儀(美國 Thermolyne 公司),烘箱。

        1.3 標準溶液的配制

        根據(jù)需求,分別吸取適量的各腹瀉性貝類毒素標準溶液于5 mL棕色容量瓶中,用50%甲醇水溶液稀釋并定容,配制成標準儲備液。用空白基質(zhì)液稀釋儲備液配制成各個不同濃度的標準工作液。各類標準溶液避光保存于-12 ℃。

        1.4 樣品預處理

        準確稱?。?.00±0.05) g樣品于25 mL離心管中,加入4.5 mL甲醇,渦旋混勻后,超聲5 min,離心5 min,取重復提取1次,合并上清液用甲醇定容至10 mL。取1 mL中提取液,加入125 μL 2.5 mol/L氫氧化鈉溶液,于76 ℃溫育40 min。冷卻后,加入125 μL 2.5 mol/L鹽酸。水解液用3 mL水稀釋,過Strata-X柱(Strata-X柱活化:1 mL 甲醇,1 mL 30% 甲醇),再用1 mL 20%甲醇淋洗,用1 mL 03% 氨水甲醇洗脫,收集洗脫液。用0.22 μm的有機濾膜過濾,供超高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜分析。

        1.5 LC-MS/MS 分析條件

        1.5.1 色譜條件。

        色譜柱:Agilent C8(2.1 mm×100 mm,2.7 μm);柱溫40 ℃;進樣量為10 μL,流動相:A為水溶液(含2 mmol/L甲酸銨和1‰甲酸),B為乙腈溶液(含2 mmol/L甲酸銨和1‰甲酸),采用等度洗脫方式,A/B=20/80(V/V);流速350 μL/min。

        1.5.2 質(zhì)譜條件。

        離子源:電噴霧離子源 ESI;掃描方式:負離子(ESI-)掃描;檢測方式:多反應監(jiān)測模式(MRM);噴霧電壓:-4 500 V;離子源溫度:550? ℃;氣簾氣壓力:206.8 kPa;霧化氣壓力:379.2 kPa;輔助加熱氣壓力:379.2 kPa。碰撞氣CAD:Medium。

        2 結果與分析

        2.1 質(zhì)譜分析條件的優(yōu)化

        該試驗采用ESI源,多反應監(jiān)測(MRM)。母離子的選擇(Q1 Scan)將用50%甲醇水溶液稀釋的標準毒素溶液,采用以10 μL/min流速的流動注射泵進樣分析,在負離子模式下進行一級離子掃描,尋找各毒素的母離子分子離子峰OA([M-H]-,m/z 803.5)、DTX1([M-H]-,m/z 817.5)、DTX2([M-H]-,m/z 803.5),然后,在離子掃描模式下(Product lon MS2)選擇干擾性較小、信號強度較高的2個子離子,在多反應監(jiān)測模式(MRM)下建立合適的MRM離子對通道,優(yōu)化并獲得最佳的去簇電壓(DP)、碰撞能量(CE)。各個毒素選擇的母離子、去簇電壓(DP)、碰撞能量(CE)參數(shù)見表1。

        2.2 流動相的選擇

        流動相的pH和在純?nèi)軇┲刑砑拥奈镔|(zhì)會影響目標化合物的峰型和保留時間。該試驗分別采用乙腈-水、乙腈-甲酸銨(含有2 mmol/mL甲酸銨)、乙腈-甲酸銨(含有2 mmol/mL甲酸銨,0.1%甲酸)作為流動相,經(jīng)測定分析發(fā)現(xiàn),乙腈-水作為流動相時峰型較寬,響應值較低;而乙腈-甲酸銨(含有2 mmol/mL甲酸銨)作為流動相時,3種DSP的峰型較好,靈敏度提高;乙腈-甲酸銨(含有2 mmol/mL甲酸銨,0.1%甲酸)作為流動相,對3種DSP的響應值有所抑制。但是在實際檢測已經(jīng)添加含有3種DSP的文蛤樣品時發(fā)現(xiàn),在乙腈-甲酸銨(含有2 mmol/mL甲酸銨)作為流動相時,響應值很低,幾乎不出峰,在乙腈-甲酸銨(含有2 mmol/mL甲酸銨,0.1%甲酸)作為流動相時,響應值較高,峰型較好,甲酸能有效地降解基質(zhì)中某些雜質(zhì)的干擾,流動相的pH對3種DSP毒素的影響較大。因此最終選擇了乙腈-甲酸銨(含有2 mmol/mL甲酸銨,0.1%甲酸)作為流動相。

        為了能使3種DSP分離開,通過流動相條件的篩選,最終選擇梯度洗脫的方式分離毒素。流動相A:水溶液,流動相B:乙腈溶液,二者均含有2 mmol/L甲酸銨和0.1%甲酸;0.01~7.00 min流動相B的比例從20%升高至90%;7.00~10.00 min,維持90%流動相B;10.00~10.01 min,流動相B降為20%,平衡色譜柱2 min。流動相梯度洗脫條件見表 在此流動相洗脫梯度下的3種DSP的總離子流圖見圖1。

        2.3 凈化條件的優(yōu)化

        選用3種不同的固相萃取柱Strata-X柱、HLB柱和C18柱進行凈化效果分析比較,結果顯示,Strata-X柱OA、DTX1、DTX2回收率都可以達到70%以上。HLB柱和C18柱3種DSP各目標組分的回收率都低于60%。因此綜合考慮,最終選擇的固相萃取柱為Strata-X柱。

        2.4 溫度條件的選擇

        選擇在室溫下靜置40 min、50 ℃溫育40 min、76 ℃溫育40 min的3種試驗效果對比分析,結果顯示,在76 ℃溫育40 min下OA、DTX1、DTX2加標回收率最高,而且能夠有效地去除一些雜質(zhì)基質(zhì)的干擾。因此該試驗選擇76 ℃溫育40 min作為溫度條件。

        2.5 基質(zhì)效應影響

        采用LC-MS/MS檢測時,基質(zhì)效應會直接影響目標物的測定結果。為了測定基質(zhì)對3種DSP測定的結果影響,用文蛤空白樣品的基質(zhì)液和提取溶劑(50%甲醇水)分別配置了同一濃度的標準溶液上機分析。結果發(fā)現(xiàn),用空白基質(zhì)液配置的DSP標準溶液的響應值明顯偏低,表明基質(zhì)對DSP的響應值有抑制作用。為了提高DSP的檢測結果的準確性,因此選擇采用空白基質(zhì)液配制DSP系列的標準工作液。

        2.6 線性關系和檢出限

        用空白基質(zhì)液分別配制OA、DTX1、DTX2質(zhì)量濃度為1.00、5.00、10.00、20.00、100.00 μg/L的混合標準溶液系列,按試驗方法進行測定,繪制標準曲線,線性回歸方程及相關系數(shù)表見表3。結果表明,各元素的線性范圍為1.00~100.00 μg/L,3種脂溶性貝類毒素的相關系數(shù)均達0.999以上。

        2.7 回收率與精密度

        在空白文蛤樣品中添加3個濃度水平的DSP混合標準溶液,每個添加水平6個平行樣品,計算回收率和測定值的相對標準偏差(RSD),結果如表4。由表4可知,各毒素的加標回收率都在75%~90%,RSD都在30%~6.6%。

        3 結論

        該研究建立了同時測定腹瀉性貝類毒素OA(大田軟海綿酸)及其衍生物DTX1(鰭藻毒素-1)和DTX2(鰭藻毒素-2)的超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法。該方法前處理比較簡單,靈敏度高,重現(xiàn)性好,方法的回收率等均能滿足日常對DSP的檢測要求,適用于實際樣品的檢測分析。

        參考文獻

        [1]LEE J S,YANAGI T,KENMA R,et al.Fluorometric determination of diarrhetic shellfish toxins by high-performance liquid chromatography [J].Agricultural and biological chemical,1987,51(3):877-881.

        [2]李偉才,欒剛,李立,等.中國沿海部分海區(qū)貝毒毒素的調(diào)查[J].海洋科學,2000,24(9):19-22.

        [3]YASUMOTO T,OSHIMA Y,YAMAGUCHI M.Occurrence of a new type of shellfish poisoning in the Tohoku district[J].Bull Japan Soc Sci Fish,1978,44(11):1249-1255.

        [4]柳俊秀,胡樂琴,何培民.腹瀉性貝毒素軟海綿酸的昆明系小鼠生物學檢測法的建立[J].生態(tài)毒理學報,2009,4(3):446-451.

        [5]傅云娜,陳則玲.腹瀉性貝毒的高效液相色譜法測定條件改進及其運用[J].海洋通報,2003,22(1):92-95.

        [6]馬景剛.LC-MS/MS(液相色譜—質(zhì)譜聯(lián)用)同步分析多種脂溶性貝毒的方法及應用[D].青島:中國海洋大學,2012.

        [7]黃海燕,黃愛君,莊志雄,等.腹瀉性貝類毒素肝細胞毒性研究及其熒光檢測法的建立[C]//中國毒理學會第三屆中青年學者科技論壇暨2011年全國前列腺藥理毒理學研討會論文集.北京:中國毒理學會,2011.

        [8]李軍濤,候水平,姬澤薇,等.腹瀉性貝類毒素的免疫熒光層析檢測方法的初步建立 [J].熱帶醫(yī)學雜志,2015,15(2):189-192.

        [9]丁君.赤潮毒素中腹瀉性貝毒和麻痹性貝毒的研究及進展[J].大連水產(chǎn)學院學報,200 16(3):212-218.

        [10]趙曉芳,計融.國內(nèi)外腹瀉性貝類毒素管理控制措施的比對分析[J].中國熱帶醫(yī)學,2006,6(2):350-354.

        [11]楊維東,彭喜春,劉潔生,等.腹瀉性貝毒研究現(xiàn)狀[J].海洋科學,2005,29(5):66-72.

        [12]劉仁沿.我國貝類中赤潮毒素腹瀉性貝毒免疫檢測技術研究[D].大連:大連海事大學,2008.

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