張秋云 朱曉華 楊洪生 沈美芳 譚秀慧 夏莉萍

摘要 [目的]以文蛤中的腹瀉性貝類毒素大田軟海綿酸貝類毒素（OA）、鰭藻毒素-1（DTX1）、鰭藻毒素-2（DTX2）為研究對象，建立腹瀉性貝類毒素的超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜（LC-MS/MS）檢測方法。[方法]以文蛤樣品為代表，用甲醇提取，采用堿水解將乙酰酯化的OA、DTX1、DTX2轉化成游離OA、DTX1、DTX 通過Strata-X柱凈化，過膜后，用液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜測定，以基質(zhì)標準曲線進行外標法定量。該試驗以流動相A為水溶液（含2 mmol/L甲酸銨和1‰甲酸），流動相B為乙腈溶液（含2 mmol/L甲酸銨和1‰甲酸），流速350 μL/min，柱溫40 ℃，負離子掃描，多反應監(jiān)測模式下進行定性與定量分析。[結果]3種腹瀉性貝類毒在1～100 μg/L關系良好，3個添加水產(chǎn)的回收率都在75%～90%，RSD都在3.0%～6.6%。[結論]利用此方法檢測文蛤中的腹瀉性貝類毒素具有靈敏度高、重復性好、操作簡單的特點?；厥章实染軡M足日常對3種常見的腹瀉性貝類毒素的檢測要求。

關鍵詞 腹瀉性貝類毒素;液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜;文蛤

中圖分類號 TS254.7文獻標識碼 A文章編號 0517-6611（2018）34-0166-03

腹瀉性貝類毒素（diarrhetic shellfish poisoning，DSP）是由有毒赤潮藻類鰭藻屬和原甲藻屬的一些種類產(chǎn)生的脂溶性多環(huán)醚類生物活性物質(zhì)，不易溶于水，熱穩(wěn)定性極高[1]，主要包括大田軟海綿酸貝類毒素（OA）、鰭藻毒素-1（DTX1）、鰭藻毒素-2（DTX2）[2]。該毒素可在貝類等濾食性動物體內(nèi)富集，通過食物鏈傳遞至人類，引起腹瀉性中毒，危害食用者健康[3]。腹瀉性貝類毒素在全球沿岸海域均有分布，是世界范圍內(nèi)最具威脅的赤潮藻毒素之一。腹瀉性貝毒雖然不是一種可致命的毒素，通常也只是引起輕微的腸胃疾病，而且癥狀消失也較快，沒有強烈的急性毒素，但是大田軟海綿酸貝類毒素是強烈的致癌因子，其長期毒性應該引起重視。目前常用腹瀉性貝類毒素檢測分析方法主要包括小鼠生物法[4]、液相色譜法[5]、液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法[6]、細胞毒性檢測法[7]、免疫熒光層析檢測法[8]等。小鼠生物法主要缺陷是操作繁瑣，不能確定樣本中毒素成分和結構;免疫熒光層析檢測法檢測成分假陽性率較高，結果不能代表樣本整體毒性;液相色譜法需要繁瑣的衍生步驟，衍生試劑存在性質(zhì)不穩(wěn)定等問題，可能會導致DSP不能夠完全衍生化[9-12]，而且對結構類似物不能有效地分離，在靈敏度和選擇性上還有待改進;液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜檢測方法結合了質(zhì)譜強大的定性定量功能和液相色譜優(yōu)越的分離能力，現(xiàn)在越來越多地被應用到腹瀉性貝類毒素的分析檢測中。

筆者建立了3種代表性DSP毒素OA、DTX1、DTX2的液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜（LC-MS/MS）檢測方法。

1 材料與方法

1.1 試材 OA、DTX1、DTX2 標準品購自加拿大海洋生物科學研究所（NRC）。色譜級甲醇（TEDIA公司），色譜級乙腈（TEDIA公司），色譜級甲酸、色譜級氨水（ROE公司），色譜級甲酸銨（含量≥99.0%），色譜級氫氧化鈉（含量≥980%），實驗室用水為超純水。文蛤購買于南京市某水產(chǎn)品市場。

1.2 儀器

1290 型高效液相色譜（美國 Agilent 公司），AB 4500Trap 三重四級桿液質(zhì)聯(lián)用儀（Applied Biosystems C），TE612-L型電子天平（S 公司），Allegra 64R型高速冷凍離心機（BECKMAN COULTER 公司），Maxi Mix Ⅱ型旋渦混勻儀（美國 Thermolyne 公司），烘箱。

1.3 標準溶液的配制

根據(jù)需求，分別吸取適量的各腹瀉性貝類毒素標準溶液于5 mL棕色容量瓶中，用50%甲醇水溶液稀釋并定容，配制成標準儲備液。用空白基質(zhì)液稀釋儲備液配制成各個不同濃度的標準工作液。各類標準溶液避光保存于-12 ℃。

1.4 樣品預處理

準確稱?。?.00±0.05） g樣品于25 mL離心管中，加入4.5 mL甲醇，渦旋混勻后，超聲5 min，離心5 min，取重復提取1次，合并上清液用甲醇定容至10 mL。取1 mL中提取液，加入125 μL 2.5 mol/L氫氧化鈉溶液，于76 ℃溫育40 min。冷卻后，加入125 μL 2.5 mol/L鹽酸。水解液用3 mL水稀釋，過Strata-X柱（Strata-X柱活化：1 mL 甲醇，1 mL 30% 甲醇），再用1 mL 20%甲醇淋洗，用1 mL 03% 氨水甲醇洗脫，收集洗脫液。用0.22 μm的有機濾膜過濾，供超高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜分析。

1.5 LC-MS/MS 分析條件

1.5.1 色譜條件。

色譜柱：Agilent C8（2.1 mm×100 mm，2.7 μm）;柱溫40 ℃;進樣量為10 μL，流動相：A為水溶液（含2 mmol/L甲酸銨和1‰甲酸），B為乙腈溶液（含2 mmol/L甲酸銨和1‰甲酸），采用等度洗脫方式，A/B=20/80（V/V）;流速350 μL/min。

1.5.2 質(zhì)譜條件。

離子源：電噴霧離子源 ESI;掃描方式：負離子（ESI-）掃描;檢測方式：多反應監(jiān)測模式（MRM）;噴霧電壓：-4 500 V;離子源溫度：550? ℃;氣簾氣壓力：206.8 kPa;霧化氣壓力：379.2 kPa;輔助加熱氣壓力：379.2 kPa。碰撞氣CAD：Medium。

2 結果與分析

2.1 質(zhì)譜分析條件的優(yōu)化

該試驗采用ESI源，多反應監(jiān)測（MRM）。母離子的選擇（Q1 Scan）將用50%甲醇水溶液稀釋的標準毒素溶液，采用以10 μL/min流速的流動注射泵進樣分析，在負離子模式下進行一級離子掃描，尋找各毒素的母離子分子離子峰OA（[M-H]-，m/z 803.5）、DTX1（[M-H]-，m/z 817.5）、DTX2（[M-H]-，m/z 803.5），然后，在離子掃描模式下（Product lon MS2）選擇干擾性較小、信號強度較高的2個子離子，在多反應監(jiān)測模式（MRM）下建立合適的MRM離子對通道，優(yōu)化并獲得最佳的去簇電壓（DP）、碰撞能量（CE）。各個毒素選擇的母離子、去簇電壓（DP）、碰撞能量（CE）參數(shù)見表1。

2.2 流動相的選擇

流動相的pH和在純?nèi)軇┲刑砑拥奈镔|(zhì)會影響目標化合物的峰型和保留時間。該試驗分別采用乙腈-水、乙腈-甲酸銨（含有2 mmol/mL甲酸銨）、乙腈-甲酸銨（含有2 mmol/mL甲酸銨，0.1%甲酸）作為流動相，經(jīng)測定分析發(fā)現(xiàn)，乙腈-水作為流動相時峰型較寬，響應值較低;而乙腈-甲酸銨（含有2 mmol/mL甲酸銨）作為流動相時，3種DSP的峰型較好，靈敏度提高;乙腈-甲酸銨（含有2 mmol/mL甲酸銨，0.1%甲酸）作為流動相，對3種DSP的響應值有所抑制。但是在實際檢測已經(jīng)添加含有3種DSP的文蛤樣品時發(fā)現(xiàn)，在乙腈-甲酸銨（含有2 mmol/mL甲酸銨）作為流動相時，響應值很低，幾乎不出峰，在乙腈-甲酸銨（含有2 mmol/mL甲酸銨，0.1%甲酸）作為流動相時，響應值較高，峰型較好，甲酸能有效地降解基質(zhì)中某些雜質(zhì)的干擾，流動相的pH對3種DSP毒素的影響較大。因此最終選擇了乙腈-甲酸銨（含有2 mmol/mL甲酸銨，0.1%甲酸）作為流動相。

為了能使3種DSP分離開，通過流動相條件的篩選，最終選擇梯度洗脫的方式分離毒素。流動相A：水溶液，流動相B：乙腈溶液，二者均含有2 mmol/L甲酸銨和0.1%甲酸;0.01～7.00 min流動相B的比例從20%升高至90%;7.00～10.00 min，維持90%流動相B;10.00～10.01 min，流動相B降為20%，平衡色譜柱2 min。流動相梯度洗脫條件見表 在此流動相洗脫梯度下的3種DSP的總離子流圖見圖1。

2.3 凈化條件的優(yōu)化

選用3種不同的固相萃取柱Strata-X柱、HLB柱和C18柱進行凈化效果分析比較，結果顯示，Strata-X柱OA、DTX1、DTX2回收率都可以達到70%以上。HLB柱和C18柱3種DSP各目標組分的回收率都低于60%。因此綜合考慮，最終選擇的固相萃取柱為Strata-X柱。

2.4 溫度條件的選擇

選擇在室溫下靜置40 min、50 ℃溫育40 min、76 ℃溫育40 min的3種試驗效果對比分析，結果顯示，在76 ℃溫育40 min下OA、DTX1、DTX2加標回收率最高，而且能夠有效地去除一些雜質(zhì)基質(zhì)的干擾。因此該試驗選擇76 ℃溫育40 min作為溫度條件。

2.5 基質(zhì)效應影響

采用LC-MS/MS檢測時，基質(zhì)效應會直接影響目標物的測定結果。為了測定基質(zhì)對3種DSP測定的結果影響，用文蛤空白樣品的基質(zhì)液和提取溶劑（50%甲醇水）分別配置了同一濃度的標準溶液上機分析。結果發(fā)現(xiàn)，用空白基質(zhì)液配置的DSP標準溶液的響應值明顯偏低，表明基質(zhì)對DSP的響應值有抑制作用。為了提高DSP的檢測結果的準確性，因此選擇采用空白基質(zhì)液配制DSP系列的標準工作液。

2.6 線性關系和檢出限

用空白基質(zhì)液分別配制OA、DTX1、DTX2質(zhì)量濃度為1.00、5.00、10.00、20.00、100.00 μg/L的混合標準溶液系列，按試驗方法進行測定，繪制標準曲線，線性回歸方程及相關系數(shù)表見表3。結果表明，各元素的線性范圍為1.00～100.00 μg/L，3種脂溶性貝類毒素的相關系數(shù)均達0.999以上。

2.7 回收率與精密度

在空白文蛤樣品中添加3個濃度水平的DSP混合標準溶液，每個添加水平6個平行樣品，計算回收率和測定值的相對標準偏差（RSD），結果如表4。由表4可知，各毒素的加標回收率都在75%～90%，RSD都在30%～6.6%。

3 結論

該研究建立了同時測定腹瀉性貝類毒素OA（大田軟海綿酸）及其衍生物DTX1（鰭藻毒素-1）和DTX2（鰭藻毒素-2）的超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法。該方法前處理比較簡單，靈敏度高，重現(xiàn)性好，方法的回收率等均能滿足日常對DSP的檢測要求，適用于實際樣品的檢測分析。

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