許永　孔維松　王晉　黃海濤　劉欣　李雪梅　楊葉昆　向明　田麗梅　李晶

摘要[目的]采用超高效液相色譜法測(cè)定卷煙主流煙氣中的7種酚類物質(zhì)。[方法]卷煙主流煙氣中的酚類用劍橋?yàn)V片捕集，然后用自主設(shè)計(jì)的新型樣品前處理裝置以1%乙酸超聲提取，萃取液采用ACQUITYUPLCBEHC₁₈色譜柱（50mm×2.1mm，1.7μm）分離，以1%乙酸（內(nèi)含0.01moL/LB-CD）和70%乙腈（內(nèi)含1%乙酸和0.01moL/LB-CD）為流動(dòng)相進(jìn)行梯度洗脫，卷煙主流煙氣中的主要7種酚類物質(zhì)在5.0min內(nèi)可達(dá)到基線分離。[結(jié)果]采用新的樣品前處理裝置可以有效簡(jiǎn)化前處理步驟，提高分析效率；7種酚類物質(zhì)在濃度為0.02～25.00μg/mL時(shí)具有較好的線性關(guān)系，線性相關(guān)系數(shù)>0.99900；檢出限為2.5～6.5μg/L；在不同添加水平下，平均回收率為93.8%～98.5%，日內(nèi)精密度和日間精密度考察均小于5%，具有較好的重復(fù)性。[結(jié)論]該方法能較好地應(yīng)用于卷煙主流煙氣中7種酚類物質(zhì)的測(cè)定。

關(guān)鍵詞 卷煙；主流煙氣；酚類；超高效液相色譜法（UPLC）；新型前處理裝置

中圖分類號(hào) 0657.7⁺2；TS41⁺1 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A 文章編號(hào) 0517-6611（2018）11-0157-04

簡(jiǎn)單酚類化合物（苯酚、苯二酚、甲基苯酚等）是卷煙主流煙氣中的一類重要有害成分，它們不但有較難聞的氣味，很難被掩蓋，對(duì)卷煙感觀評(píng)吸產(chǎn)生不良影響，而且還對(duì)皮膚及呼吸道黏膜有強(qiáng)烈的刺激作用和致癌作用。該類化合物被加拿大政府列入46種有害成分名單，并被世界衛(wèi)生組織（WHO）“煙草制品管制研究小組”列為建議的管制成分清單。因此準(zhǔn)確測(cè)定卷煙主流煙氣中酚類物質(zhì)對(duì)于降低卷煙中的有害成分，提高卷煙的抽吸品質(zhì)十分重要。

主流煙氣中酚類物質(zhì)的測(cè)定已有較多報(bào)道，主要有液相色譜法、氣相色譜法、連續(xù)流動(dòng)分析法、分光光度法等。用連續(xù)流動(dòng)分析法和分光光度法只能測(cè)定酚類的總量，而采用氣相色譜直接測(cè)定時(shí)峰形易拖尾，一般需要用衍生化。液相色譜法由于分離效率高，選擇性好，檢測(cè)靈敏度高，操作自動(dòng)化，在簡(jiǎn)單酚類化合物分析中得到了廣泛應(yīng)用。按照我國(guó)煙草行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)YC/T255-2008，采用高效液相色譜法測(cè)定卷煙主流煙氣中的酚，方法色譜分離時(shí)間長(zhǎng)，每個(gè)樣品需要40min以上，不能滿足樣品快速測(cè)定的要求。

為了尋找更簡(jiǎn)便、快速的分析方法，筆者采用超高效液相色譜法縮短了樣品分析時(shí)間，并通過(guò)自主設(shè)計(jì)的樣品萃取瓶，簡(jiǎn)化樣品前處理流程，使樣品前處理周期明顯縮短。改進(jìn)方法和目前常規(guī)液相色譜分析方法相比，日樣品分析量明顯提高。該方法的建立為卷煙主流煙氣中酚類化合物的測(cè)定提供了快速、準(zhǔn)確、可靠的高通量分析方法。

1材料與方法

1.1材料與試劑

1.1.1主要材料。市售卷煙5種，購(gòu)自昆明市某超市。

1.1.2主要試劑。鄰甲酚、間甲酚、對(duì)甲酚、鄰苯二酚、間苯二酚、對(duì)苯二酚和苯酚標(biāo)準(zhǔn)品（純度>99%，購(gòu)自瑞士Fluka公司）；β-環(huán)糊精（β-CD，分析純，購(gòu)自上海國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）；乙腈（HPLC級(jí)，購(gòu)自Merk公司）；乙酸（分析純，購(gòu)自上海國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）。

無(wú)酚蒸餾水：每升水中加入1g硫酸銅，用石英亞沸蒸餾器重蒸，并用Millipore-Q50超純水儀（美國(guó)Millipore公司）處理。

1.1.3主要儀器。SM400直線型吸煙機(jī)（英國(guó)斯茹林公司）；WatersAcQUITY超高效液相色譜系統(tǒng)，包括二元梯度泵，Empower色譜工作站，熒光檢測(cè)器（美國(guó)waters公司）；AE240電子分析天平（精確至0.0001g，Mettler公司）；電熱恒溫超聲波水浴鍋（常州諾基儀器有限公司）；Millipore-Q50超純水儀（美國(guó)Millipore公司）。

1.2方法

1.2.1樣品前處理裝置。試驗(yàn)設(shè)計(jì)的新型樣品前處理裝置結(jié)構(gòu)見(jiàn)圖1，裝置由帶密封圈的外套管（圖1a）和帶0.45μm過(guò)濾篩板的內(nèi)套管（圖1b）組成。樣品提取狀態(tài)為圖lc，樣品過(guò)濾及轉(zhuǎn)移狀態(tài)為圖1d。

1.2.2標(biāo)準(zhǔn)溶液配制。分別準(zhǔn)確稱取50mg的7種酚類化合物于50mL容量瓶中，用乙腈溶解并定容，得1.0mg/mL的7種酚類標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，儲(chǔ)備液在4℃下避光保存。使用時(shí)分別取1.0mL儲(chǔ)備液于10mL容量瓶中，用乙腈定容，得O.1mg/mL的酚類混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，用該混合標(biāo)準(zhǔn)溶液逐級(jí)稀釋成所需濃度的標(biāo)準(zhǔn)工作液。

1.2.3色譜條件。色譜柱：ACQUITYUPLCBEHC₁₈色譜柱（50mm×2.1mm，1.7μm）；柱溫30℃；柱流速0.5mL/min；進(jìn)樣量5.0μL；流動(dòng)相A：1%的乙酸水溶液（內(nèi)含0.01mol/LB-CD）；流動(dòng)相B：70%的乙腈（內(nèi)含1%的乙酸和0.01mol/LB-CD）；洗脫梯度：0～1.5min，10%B；>1.5～3.0min，10%～40%B；>3.0～4.5min，40%～80%B；>4.5～5.0min，80%B；>5.0～5.5min，10%B；>5.5～7.5min，10%B。

采用熒光檢測(cè)器程序波長(zhǎng)檢測(cè)，檢測(cè)波長(zhǎng)（激發(fā)波長(zhǎng)/發(fā)射波長(zhǎng)，mm）為0～1.5min，284/332nm；>1.5～2.0min，275/315nm；>2.0～2.8min，277/319nm；>2.8～3.8min，272/309nm；>3.8～6.0min，273/323nm。采用比較標(biāo)樣與樣品的熒光光譜色譜峰保留時(shí)間法定性，外標(biāo)法定量。

1.2.4試驗(yàn)設(shè)計(jì)。每種卷煙樣品取1條，在GB/T16447規(guī)定的條件下進(jìn)行平衡，參照文獻(xiàn)用SM400直線型吸煙機(jī)按照標(biāo)準(zhǔn)GB/T19609-2004規(guī)定的條件抽吸卷煙，每個(gè)孔道抽吸4支煙，用44mm劍橋?yàn)V片捕集卷煙主流煙氣。吸煙完畢，空吸一口空氣后，取出濾片。

將裝置放到固定架上，并將劍橋?yàn)V片置于外套管中（圖1a），用50mL移液槍在裝有樣品的套管中加入50mL1%的乙酸水溶液，然后把內(nèi)套管卡在外套管的口部（圖1c）。裝好后將固定架放到恒溫超聲波水浴鍋中超聲萃取25min。萃取完后把內(nèi)套管向下壓，萃取溶液通過(guò)過(guò)濾篩板進(jìn)入到內(nèi)套管中，并從內(nèi)套管中的細(xì)彎管流出，達(dá)到樣品過(guò)濾的效果（圖1d）。從細(xì)彎管口收集萃取液，棄去最初的2.0～3.0mL，然后用色譜進(jìn)樣瓶直接收集1.0～1.5mL的樣品萃取液，供液相色譜分析。

2結(jié)果與分析

2.1樣品前處理 試驗(yàn)參照YC/T255-2008的方法，每個(gè)44mm劍橋?yàn)V片抽吸4支卷煙，用50mL1%的乙酸水溶液超聲萃取。試驗(yàn)結(jié)果表明，超聲萃取20min左右7種酚類化合物可萃取完全，收集殘?jiān)佥腿?次，已經(jīng)沒(méi)有酚類化合物檢出，延長(zhǎng)超聲萃取時(shí)間對(duì)酚類化合物的測(cè)定結(jié)果沒(méi)有影響，該試驗(yàn)選擇超聲萃取25min。

為了進(jìn)一步減少樣品前處理環(huán)節(jié)，該研究設(shè)計(jì)了樣品前處理裝置（圖1），該裝置由帶密封圈的外套管（圖la）和帶0.45μm過(guò)濾篩板的內(nèi)套管（圖1b）組成。在外套管中加入劍橋?yàn)V片（圖1a），然后加入萃取溶劑（1%乙酸水溶液）。把內(nèi)套管卡在外套管的口部（圖1c），可防止樣品萃取過(guò)程中萃取溶液濺出或超聲水浴鍋中的水濺入。裝好后將裝置放到超聲波水浴鍋中超聲萃取，萃取完后將萃取瓶的內(nèi)套管向下壓，萃取溶液就通過(guò)過(guò)濾篩板進(jìn)入到內(nèi)套管中，并從內(nèi)套管中的細(xì)彎管流出，用色譜進(jìn)樣瓶從細(xì)彎管口部收集流出的萃取溶液，可直接進(jìn)行液相色譜分析。

整個(gè)樣品前處理過(guò)程中不需要樣品轉(zhuǎn)移就能得到過(guò)濾好的待分析樣品，前處理操作得到簡(jiǎn)化。試驗(yàn)操作過(guò)程中樣品前處理步驟得到簡(jiǎn)化，有可能會(huì)增加引入誤差的環(huán)節(jié)也會(huì)相應(yīng)減少，分析結(jié)果的精密度也會(huì)提高。另外，按常規(guī)方法進(jìn)行樣品前處理操作，用針頭過(guò)濾器過(guò)濾，超聲過(guò)程中產(chǎn)生的劍橋?yàn)V片碎屑會(huì)堵塞過(guò)濾頭，過(guò)濾速度較慢。而在改進(jìn)的處理方法中，超聲萃取完成后稍加放置，劍橋?yàn)V片碎屑就沉到底下，過(guò)濾時(shí)內(nèi)套管中的篩板只與上層清液接觸，這樣可有效避免過(guò)濾過(guò)程中的篩板堵塞，過(guò)濾速度更快，過(guò)濾操作更容易實(shí)現(xiàn)。

2.2色譜條件優(yōu)化 為了縮短分析時(shí)間，該試驗(yàn)通過(guò)超高效液相色譜分析，采用ACQUITYUPLCBEHC₁₈色譜柱（50mm×2.1mm，1.7μm）分離7種酚類化合物，參照YC/T255--2008的流動(dòng)相條件，對(duì)甲酚和問(wèn)甲酚無(wú)法實(shí)現(xiàn)分離。根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，對(duì)甲酚、間甲酚和鄰甲酚與β-環(huán)糊精（β-CD）空腔的契合程度不同，所形成的包結(jié)物穩(wěn)定性不同，會(huì)導(dǎo)致保留時(shí)間有更大差異，可將甲酚異構(gòu)體分離。該試驗(yàn)參照文獻(xiàn)的方法，在流動(dòng)相中添加β-CD，使鄰、對(duì)、間甲酚達(dá)到分離。用1%乙酸（內(nèi)含0.01mol/Lβ-CD）和70%乙腈（內(nèi)含1%乙酸和0.01mol/Lβ-CD）為流動(dòng)相，試驗(yàn)結(jié)果表明，A為1%乙酸，B為70%乙腈，按0～1.5min，10%B；>1.5～3.0min，10%～40%B；>3.0～4.5min，40%B～80%B；>4.5～5.0min，80%B；>5.0～5.5min，10%B；>5.5～7.5min，10%B梯度條件，7種酚類化合物均可達(dá)到基線分離且分離時(shí)間短，因此試驗(yàn)優(yōu)選該流動(dòng)相條件進(jìn)行色譜分離。

采用熒光檢測(cè)器檢測(cè)，不同的酚類化合物具有不同的激發(fā)波長(zhǎng)和發(fā)射波長(zhǎng)，對(duì)苯二酚激發(fā)波長(zhǎng)284nm，發(fā)射波長(zhǎng)332nm；間苯二酚激發(fā)波長(zhǎng)275nm，發(fā)射波長(zhǎng)315nm；鄰苯二酚激發(fā)波長(zhǎng)277nm，發(fā)射波長(zhǎng)319nm；苯酚激發(fā)波K272nm，發(fā)射波長(zhǎng)309nm；對(duì)甲酚、間甲酚、鄰甲酚激發(fā)波長(zhǎng)273nm，發(fā)射波長(zhǎng)323nm。試驗(yàn)參照YC/T255-2008采用程序波長(zhǎng)檢測(cè)，選擇的檢測(cè)波長(zhǎng)（激發(fā)波影發(fā)射波長(zhǎng)，nm）為0～1.5min，284/332nm；>1.5～2.0min，275/315nm；>2.0～2.8min，277/319nm；>2.8～3.8min，272/309nm；>3.8～6.0min，273/323nm。

2.3方法的線性關(guān)系和檢出限 分別配制不同濃度酚類化合物的標(biāo)準(zhǔn)溶液，在選定試驗(yàn)條件下進(jìn)行色譜進(jìn)樣，圖2為7種酚類物質(zhì)的標(biāo)準(zhǔn)色譜圖。從圖2可看出，各待測(cè)組分均達(dá)到了基線分離，而且色譜峰對(duì)稱性好，無(wú)明顯拖尾。包括回到起始梯度和平衡時(shí)間在內(nèi)，整個(gè)樣品色譜分析時(shí)間只需7.5min，與YC/T255-2008方法相比分離時(shí)間縮短至1/5。

根據(jù)不同濃度的峰面積，計(jì)算出回歸方程，根據(jù)信噪比S/N=3計(jì)算檢測(cè)限，根據(jù)信噪比S/N=10計(jì)算定量限，結(jié)果見(jiàn)表1。

2.4加標(biāo)回收率及方法精密度 取相同卷煙2份，其中1份作為空白，另外1份加入已知量酚類物質(zhì)的標(biāo)樣（2.5、10.0、40.0μg），另1份不加，通過(guò)加標(biāo)樣品測(cè)出量減去未加標(biāo)樣品測(cè)出量再除以標(biāo)準(zhǔn)加入量計(jì)算回收率，結(jié)果見(jiàn)表2。從表2可以看出，方法的回收率為93.8%～98.5%，說(shuō)明方法具有很高的回收率。取3個(gè)不同卷煙樣品，按選定試驗(yàn)條件在同一天內(nèi)和不同天內(nèi)分別平行測(cè)定7次，計(jì)算7次平行測(cè)定結(jié)果的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差。結(jié)果表明7種酚類物質(zhì)測(cè)定結(jié)果的日內(nèi)精密度RSD為1.4%～2.5%，日間精密度RSD為1.8%～3.3%，說(shuō)明方法精密度好，可以應(yīng)用于主流煙氣中酚類物質(zhì)的檢測(cè)。

2.5實(shí)際樣品分析 選擇不同類型的5個(gè)卷煙樣品，按選定試驗(yàn)條件進(jìn)行測(cè)定，圖3為某個(gè)實(shí)際樣品色譜圖。實(shí)驗(yàn)室方法結(jié)果與煙草行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)YC/T255-2008的分析結(jié)果比較見(jiàn)表3。從表3可以看出，5個(gè)樣品中7種酚類化合物的分析結(jié)果均和煙草行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)的測(cè)定結(jié)果相符合。說(shuō)明該方法測(cè)定結(jié)果準(zhǔn)確，可以應(yīng)用于實(shí)際樣品檢測(cè)，相較于行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)檢測(cè)效率明顯提高。

3結(jié)論

該研究針對(duì)目前煙草行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)測(cè)定卷煙主流煙氣中的酚類化合物分析周期長(zhǎng)的特點(diǎn)，對(duì)超高效液相色譜技術(shù)在卷煙煙氣酚類化合物分析中的應(yīng)用進(jìn)行了研究。研究通過(guò)自主設(shè)計(jì)的樣品前處理裝置，明顯簡(jiǎn)化了樣品前處理操作，使樣品前處理周期有效縮短，改進(jìn)方法和目前行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)相比，日樣品分析量可提高5倍以上；色譜分離方面，實(shí)現(xiàn)了煙草中的7種酚類物質(zhì)在5min內(nèi)完全分離，提高了樣品分析效率。該方法的建立為卷煙主流煙氣中酚類化合物的測(cè)定提供了快速、準(zhǔn)確、可靠的高通量分析方法。