王汝都 李燕 柴建亭 楊小杰

摘 要：為了解種豬場公豬感染偽狂犬病病毒（Pseudorabies Virus，PRV）野毒和精液中PRV散毒情況，自2016年10月至2018年3月，我們對河南省22家豬場的219頭杜洛克公豬的血清進(jìn)行了PRV野毒gE抗體檢測，同時對這219頭公豬相對應(yīng)的219份杜洛克精液樣本進(jìn)行PRV-gE基因的聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（Polymerase Chain Reaction，PCR）檢測。結(jié)果顯示：這22家豬場中有2家豬場的公豬PRV野毒gE抗體和精液中PRV-gE基因的PCR檢測結(jié)果均為陰性；在20家PRV野毒gE抗體檢測陽性的豬場中，PRV野毒感染率最低為44.44%，最高為100%；在22家豬場中，公豬PRV野毒平均感染率為79.45%，精液中通過PCR可檢測到PRV野毒的平均比例為20.55%；在PRV野毒gE抗體檢測結(jié)果為陽性的公豬中，25.86%的公豬可通過PCR方法檢測證明其精液攜帶PRV的野毒。結(jié)果說明河南省受調(diào)查豬場公豬感染PRV比率較高，但PRV野毒gE抗體陽性的公豬通過PCR技術(shù)能在精液中檢測到陽性的比率較低。

關(guān)鍵詞：豬精液；豬PRV；PCR檢測

中圖分類號：S855.3 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號：1001-0769（2018）09-0020-04

偽狂犬?。≒seudorabies，PR）是一種由偽狂犬病病毒（Pseudorabies Virus，PRV）引起的多種動物共患的重要傳染病。PRV的主要宿主是豬，PRV感染豬既可通過水平傳播，也可通過母豬胎盤和公豬精液垂直傳播。豬感染后：母豬一般表現(xiàn)為返情、不發(fā)情或?qū)遗洳辉?；懷孕豬則出現(xiàn)流產(chǎn)、產(chǎn)死胎和木乃伊胎；公豬常出現(xiàn)睪丸腫脹、萎縮等，種用性能降低或喪失；2周齡以內(nèi)的仔豬感染后的癥狀以中樞神經(jīng)系統(tǒng)障礙為主要特征，也伴有嘔吐或腹瀉；成年豬多呈隱性感染或出現(xiàn)呼吸系統(tǒng)癥狀，且長期帶毒、排毒。

近年來，隨著人工授精技術(shù)的普及，規(guī)?；B(yǎng)豬業(yè)得到迅速發(fā)展，隨之而來的健康公豬精液帶毒傳播問題也日益凸顯。雖然我國自20世紀(jì)70年代中期以來，養(yǎng)豬業(yè)廣泛使用PRV-gE基因缺失弱毒疫苗進(jìn)行免疫，這對PRV的防控起到了重要的作用，但攜帶病原的種豬精液可能被輸送到多家豬場，由母豬垂直傳播給仔豬，導(dǎo)致疫病的暴發(fā)與流行。王金濤在調(diào)查中發(fā)現(xiàn)某感染豬場在2015年5月全場豬群抽檢PRV-gE抗體時還均為陰性，后因6月引種時未對后備種豬進(jìn)行嚴(yán)格的檢疫，從而導(dǎo)致PR在豬場內(nèi)迅速傳播，導(dǎo)致其他豬群被感染。本研究主要應(yīng)用ELISA和聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（Polymerase Chain Reaction，PCR）方法對河南22家豬場采集的219頭杜洛克種公豬的血清和精液進(jìn)行PRV-gE野毒抗體和PRV野毒的病原學(xué)檢測，為了解河南地區(qū)部分豬場種公豬PRV野毒感染狀況和精液散毒情況提供評估意見和參考數(shù)據(jù)，為科學(xué)預(yù)防、控制和凈化該疾病提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 精液和血清樣本

精液和血清來源于河南省受調(diào)查的22家豬場的219頭杜洛克生產(chǎn)公豬，這些公豬均免疫過某品牌的進(jìn)口PRV-gE基因缺失疫苗，每年免疫3～4次，肌注2頭份/頭。精液樣本采集后再進(jìn)行前腔靜脈采血獲得血清，統(tǒng)一進(jìn)行編號。

1.2 主要試劑

IDEXX豬PRV抗體檢測試劑盒——HerdChek PRV-gE抗體檢測試劑盒購自北京愛德士生物科技有限公司，DNA提取試劑盒購自Roche公司，dNTPs、2×ExTaq MasterMix購自北京康為世紀(jì)有限公司；DL-2000 DNAMarker購自TaKaRa公司。

1.3 PRV野毒gE抗體的檢測方法

具體操作步驟參照試劑盒說明書進(jìn)行。

1.4 引物合成及檢測方法

引物的合成參照參考文獻(xiàn)合成PRV-gE基因的檢測引物。采用PCR方法檢測，擴(kuò)增特異性目的片段基因，大小為276 bp。

1.5 精液中PRV DNA提取

用DNA提取試劑盒，分別從每份精液中提取總DNA。具體操作步驟按照試劑盒說明書進(jìn)行。取200 μL精液，加入200 μL結(jié)合緩沖液（Binding Buffer）、40 μL蛋白酶K，立即混勻，70 ℃孵育10 min；加入100 μL異丙醇，混勻；將處理樣本加到過濾管，8 000 r/min離心1 min；離心棄液體，加入500 μL除抑制劑緩沖液（Inhibitor Removal Buffer），8 000 r/min離心1 min；棄液體，加入500 μL清洗緩沖液（Wash Buffer），8 000 r/min離心1 min； 12 000 r/min空離心10 s；加入200 μL 70 ℃預(yù)熱的洗脫緩沖液（Elution Buffer），放置3 min～5 min，8 000 r/min 離心1 min，于-70 ℃凍存。

1.6 目的基因片段的擴(kuò)增

PCR反應(yīng)體系以及反應(yīng)參數(shù)參照參考文獻(xiàn)中的說明設(shè)置。PCR反應(yīng)體系為：10×PCR Buffer 5 μL、Taq酶0.5 μL、dNTPs 4 μL、上下游引物（20 μmol/μL） 各0.5 μL、4 μL DNA，加水至50 μL。PCR反應(yīng)參數(shù)為：94 ℃，4 min；94 ℃，30 s，62 ℃，30 s，72 ℃，30 s，30個循環(huán)；72 ℃，10 min。反應(yīng)結(jié)束后取5 μL PCR產(chǎn)物在1%的瓊脂糖凝膠上進(jìn)行電泳，在凝膠成像系統(tǒng)上觀察。

2 結(jié)果與分析

2.1 豬PRV野毒gE抗體檢測情況

抗體檢測實(shí)驗成立條件為：陰性對照OD650平均值-陽性對照OD650平均值≥0.30。S/N=待檢樣本OD650/陰性對照OD450均值，檢測結(jié)果判定：S/N值≤0.60，判斷為樣本抗體陽性；S/N值>0.70，判斷為樣本抗體陰性；0.60

豬PRV野毒gE抗體檢測結(jié)果表明：在22家豬場中，有7家豬場的公豬PRV野毒感染的概率為100%，有2家豬場公豬PRV野毒感染的概率為0；在公豬有PRV野毒感染的豬場中，感染率最低的為44.44%，最高的為100%。

2.2 精液中PRV PCR檢測結(jié)果

在凝膠成像系統(tǒng)中，PRV的特異性引物可以從部分樣本中擴(kuò)增出大小約276 bp的特異性條帶，說明檢測的某些樣本中含有PRV（圖1）。

2.3 不同豬場公豬精液中PRV野毒的檢測結(jié)果

對來自河南22家豬場采集的219份種公豬精液樣本進(jìn)行了PCR檢測。根據(jù)PCR檢測結(jié)果，發(fā)現(xiàn)16家豬場的公豬精液存在不同程度的帶毒情況，占檢測豬場總數(shù)的72.73%（表2）。在219份精液中，通過PCR技術(shù)檢測出的偽狂犬陽性率為20.55%。血清PRV野毒gE抗體陰性的公豬個體，其精液通過PCR檢測未檢出PRV野毒。血清PRV野毒gE抗體陽性的公豬群體，其精液通過PCR檢測出PRV野毒的比率為25.86%。

3 討論

豬的繁殖障礙性疾病主要包括由病毒、細(xì)菌、寄生蟲和一些霉形體引發(fā)的疾病，其中病毒性疫病危害最大，一旦發(fā)生和流行，就會給養(yǎng)豬業(yè)帶來嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。在豬場常發(fā)生的各類病毒性疾病中，古典豬瘟病毒、豬繁殖與呼吸障礙綜合征病毒、豬圓環(huán)病毒2型、PRV、豬細(xì)小病毒是引起豬繁殖障礙性疾病的重要病原，而這些病毒的顯著特征是均可通過交配或精液輸入而引起垂直傳播。隨著人工授精技術(shù)的普及，這些病原通過精液垂直傳播的概率也大大增加。孫泉云等報告過某豬場用2頭PRV陽性的公豬配種引發(fā)豬PR疫情，最終導(dǎo)致近百萬元的損失。黨占國等報告2012年1月—2015年8月PR流行情況呈逐年遞增趨勢，說明近年來在規(guī)模豬場疫病防控中PR呈高發(fā)態(tài)勢。

本試驗通過ELISA和PCR分別對公豬血清和精液進(jìn)行了PRV野毒gE抗體檢測和PRV-gE基因的PCR檢測，結(jié)果顯示雖然受檢公豬血清PRV野毒gE抗體陽性率很高（平均陽性率為79.45%），但公豬精液能檢測出PRV野毒陽性的比例卻較低，只有20.55%。且血清PRV野毒抗體為陰性的公豬其精液中也檢測不到PRV野毒。由于受檢公豬均為生產(chǎn)公豬，可排除母源抗體的影響，所以血清中PRV-gE抗體的存在證明該公豬已經(jīng)感染了PRV野毒。但血清PRV野毒抗體為陽性的公豬，其精液中檢測到PRV野毒的比率只有25.86%，這說明已經(jīng)感染PRV野毒的公豬大多數(shù)不會通過精液排毒，或者說明感染PRV野毒的公豬，其精液存在階段性排毒現(xiàn)象。我們應(yīng)高度重視這些存在PRV的精液，它們將在偽狂犬病的垂直傳播中起到重要作用。帶毒精液可將病毒傳染給母豬或直接垂直傳播感染胎兒。

因此，研究感染PRV野毒的公豬精液排毒規(guī)律和消滅公豬精液中PRV，將是在無法徹底凈化公豬中PR時防治PR通過公豬進(jìn)行擴(kuò)散的可行措施，也可為PR的徹底凈化提供理論依據(jù)。豬場特別是種豬場應(yīng)進(jìn)行這方面的監(jiān)測工作，建立一套詳細(xì)的疫病監(jiān)測和凈化措施，將可有效避免PR通過精液傳播和擴(kuò)散。