何明生

摘 要：本文概述了豬偽狂犬病的臨床、病原學、血清學以及分子生物學診斷技術，以期為尋找合適的快速、準確的檢測方法、制定合理的免疫程序和發(fā)展新型的檢測方法提供參考。

關鍵詞：豬偽狂犬??；診斷；應用

中圖分類號：S858.28 文獻標志碼：C 文章編號：1001-0769（2018）05-0024-02

豬偽狂犬?。≒seudorabies，PR）是由偽狂犬病毒（Pseudorabies Virus，PRV）引起的，不同生長階段的豬都可發(fā)病的一種急性、高度接觸性傳染病，其特征癥狀為發(fā)熱、繁殖障礙、腦脊髓炎等。目前該病在全世界廣泛分布，并有不斷蔓延擴大的趨勢。任何年齡的豬對偽狂犬病毒耐過后均能形成潛伏感染，且終生帶毒，在一定條件下會引起復發(fā)性感染并向外散毒，因此，開發(fā)出快速、準確的診斷方法對豬偽狂犬病的預防、控制具有十分重要的意義。

1 臨床診斷

臨床診斷就是根據偽狂犬病典型的臨床癥狀、流行病學特點、病理剖檢、發(fā)病史等信息判斷豬是否患病的過程。豬患偽狂犬病的臨床癥狀在不同生長時期、不同性別表現(xiàn)不同。新生仔豬主要表現(xiàn)為神經癥狀，消化系統(tǒng)受損，其中對2～3周齡的仔豬來說死亡率可高達100%；妊娠母豬感染主要表現(xiàn)為流產，產死胎、木乃伊胎等現(xiàn)象；公豬感染則呈現(xiàn)繁殖障礙以及呼吸系統(tǒng)癥狀。隱性感染的豬不表現(xiàn)明顯的臨床癥狀，需進行實驗室診斷來確診，以便及時隔離感染豬，控制感染的蔓延。

2 病原學診斷

病原學診斷方法主要包括：病毒分離、病毒接種和動物感染，該法被稱為PRV診斷的黃金標準，但存在敏感性較差的問題。通常取鼻咽拭子、陰道拭子以及組織病料，處理后接種在適宜細胞上，待細胞出現(xiàn)病變后，進行鏡檢或進一步電鏡鑒定。而后將分離出的病毒接種到實驗動物上，觀察動物的發(fā)病情況。

3 血清學診斷技術

簡單、快捷、敏感是血清學診斷技術的特點，目前診斷PR常用的血清學方法有：酶聯(lián)免疫吸附測定（Enzyme-linked Immuno Sorbent Assay，ELISA）、乳膠凝集試驗（Latex Agglutination Test，LAT）、血清中和試驗（Serum Agglutination Test，SNT）、瓊脂免疫擴散試驗（Agar Gel Immunodiffusion，AGID）、血凝（Hemagglutination，HA）試驗和血凝抑制（Hemagglutination Inhibition，HI）試驗。其中ELISA、LAT和SNT被列為國際貿易指定實驗技術。

3.1 ELISA

ELISA是在固體載體上以物理方法將抗體（或抗原）進行吸附，隨后在此固相載體上進行一系列免疫學和酶促生化反應的免疫酶測定實驗，具有特異﹑敏感﹑快速﹑簡便的優(yōu)點，適用于實驗室大批量樣本的檢測﹑產地檢疫及流行病學調查等。

3.2 LAT

LAT是利用抗原和抗體特異性結合的特點，先用乳膠將抗原包被，緊接著與相應血清進行反應，結果可在幾分鐘內得出，具有操作簡單﹑方便﹑快速等特點。邱德新等應用LAT對來自35個豬場的414份血清進行了PRV的抗體檢測，檢出168份陽性，陽性率為98.2%。

3.3 SNT

SNT是世界上多數國家診斷PR的法定方法之一，其敏感性和準確性都較為理想，但操作煩瑣，且受技術、細胞等條件限制，不適合作為流行病學調查和大批量免疫監(jiān)測的使用。

4 分子生物學診斷方法

分子生物學診斷技術的敏感性和特異性均高于現(xiàn)有的血清學方法，是診斷疾病最敏感和最特異的方法。尤其當偽狂犬病毒隱性感染時，僅靠臨床診斷無法正確判斷，使用分子生物學技術可以做出最為細致的判別，從而及時隔離出病豬，保障養(yǎng)殖戶的經濟效益。

4.1 聚合酶鏈反應技術（Polymerase Chain Reaction，PCR）

PCR的原理與細胞內DNA的復制過程十分類似，雙鏈DNA分子在臨近沸點時分離成單鏈的DNA分子，然后以單鏈DNA為模板，DNA聚合酶利用反應混合物中的4種脫氧核苷酸（dNTP）合成新生的互補鏈。PCR反應可在數個小時之內將幾個拷貝基因放大數百萬倍。PCR法檢測速度快，適合PRV的臨床診斷以及流行病學調查。該技術中使用的引物和探針合成方便且適合保存，檢測時間短，結果可靠，同時還避免了散毒，尤其適合無PRV國家的檢疫。

4.2 核酸探針技術

在多種診斷偽狂犬病的方法中，核酸探針技術是近年來迅速發(fā)展起來的一種新型分子生物學技術。它具有特異性良好﹑敏感性高等優(yōu)點，廣泛應用于PRV的診斷和檢測中。利用生物素和地高辛標記的探針，Maes等從三叉神經節(jié)診斷出了PRV的DNA。2008年，劉志杰等制備了gE基因核酸探針，最低的檢出量達到4 pg，與PCR檢測結果一致，這些數據顯示該核酸探針可用于PRV野毒感染的臨床檢測。

4.3 基因芯片技術

基因芯片技術是基于PCR技術和核酸雜交的原理，在載體（如玻片）上可同時檢測多種目的基因。張煥容等首次構建了PRV-PPV-JEV檢測的基因芯片，PRV、豬細小病毒（Porcine Parvovirus，PPV）和流行性乙型腦炎病毒（Japanese Encephalitis Virus，JEV）檢測的新技術，該基因芯片技術能夠同步檢測和鑒別PRV、PPV和JEV，同時也能夠鑒別PRV的野毒株和基因缺失疫苗株。

4.4 環(huán)介導等溫擴增技術

環(huán)介導等溫擴增技術（Loop-Mediated Isothermal Amplification，LAMP）是一種擴增DNA的快速新方法，簡單、實用、經濟是其主要的特點。根據PRV gE基因保守序列，楊睿等設計了4條引物，凍融處理血液病料后加入熒光染料SYBR Green，應用LAMP技術，40 min內即檢測到了PRV的存在。并與標準陰性血清和豬圓環(huán)病毒血清均不反應。與PCR技術相比，LAMP簡化了病料的前處理過程，從而縮短了檢測時間，靈敏度更高，對病毒DNA的最低檢測出質量濃度為6.2×10-9 mg/L，比普通PCR高出了100倍。根據PRV DBP基因上的一段序列，王樹芬等設計并合成了3對LAMP引物，通過加入羅丹明B衍生物指示劑，建立了可視化的LAMP方法，可快速準確檢測PRV。

PR的檢測方法很多，各有其優(yōu)缺點。傳統(tǒng)方法操作較復雜或耗時較長，實際應用中有一定的困難；血清學方法，特別是鑒別ELISA試劑盒的研制成功和廣泛應用，不僅使PRV的檢測變得簡便﹑快速﹑敏感，還可以鑒別野毒和疫苗毒；分子生物學方法具有靈敏度高﹑特異性好等特點，隨著研究的深入和完善將會越來越被廣泛應用。當然，無論哪一種診斷檢測方法都不能徹底解決所有問題，可以根據檢測目的和要求進行選擇和配合應用，以期達到早發(fā)現(xiàn)﹑早解決。同時，還應不斷深入研究，建立更多快速﹑簡便﹑實用的檢測診斷方法，以更好地促進該病的綜合防控和疫病凈化工作的開展。