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        淺析豬偽狂犬病的診斷技術(shù)

        2018-05-14 11:14:20何明生
        國外畜牧學(xué)·豬與禽 2018年5期
        關(guān)鍵詞:診斷應(yīng)用

        何明生

        摘 要:本文概述了豬偽狂犬病的臨床、病原學(xué)、血清學(xué)以及分子生物學(xué)診斷技術(shù),以期為尋找合適的快速、準(zhǔn)確的檢測(cè)方法、制定合理的免疫程序和發(fā)展新型的檢測(cè)方法提供參考。

        關(guān)鍵詞:豬偽狂犬病;診斷;應(yīng)用

        中圖分類號(hào):S858.28 文獻(xiàn)標(biāo)志碼:C 文章編號(hào):1001-0769(2018)05-0024-02

        豬偽狂犬?。≒seudorabies,PR)是由偽狂犬病毒(Pseudorabies Virus,PRV)引起的,不同生長階段的豬都可發(fā)病的一種急性、高度接觸性傳染病,其特征癥狀為發(fā)熱、繁殖障礙、腦脊髓炎等。目前該病在全世界廣泛分布,并有不斷蔓延擴(kuò)大的趨勢(shì)。任何年齡的豬對(duì)偽狂犬病毒耐過后均能形成潛伏感染,且終生帶毒,在一定條件下會(huì)引起復(fù)發(fā)性感染并向外散毒,因此,開發(fā)出快速、準(zhǔn)確的診斷方法對(duì)豬偽狂犬病的預(yù)防、控制具有十分重要的意義。

        1 臨床診斷

        臨床診斷就是根據(jù)偽狂犬病典型的臨床癥狀、流行病學(xué)特點(diǎn)、病理剖檢、發(fā)病史等信息判斷豬是否患病的過程。豬患偽狂犬病的臨床癥狀在不同生長時(shí)期、不同性別表現(xiàn)不同。新生仔豬主要表現(xiàn)為神經(jīng)癥狀,消化系統(tǒng)受損,其中對(duì)2~3周齡的仔豬來說死亡率可高達(dá)100%;妊娠母豬感染主要表現(xiàn)為流產(chǎn),產(chǎn)死胎、木乃伊胎等現(xiàn)象;公豬感染則呈現(xiàn)繁殖障礙以及呼吸系統(tǒng)癥狀。隱性感染的豬不表現(xiàn)明顯的臨床癥狀,需進(jìn)行實(shí)驗(yàn)室診斷來確診,以便及時(shí)隔離感染豬,控制感染的蔓延。

        2 病原學(xué)診斷

        病原學(xué)診斷方法主要包括:病毒分離、病毒接種和動(dòng)物感染,該法被稱為PRV診斷的黃金標(biāo)準(zhǔn),但存在敏感性較差的問題。通常取鼻咽拭子、陰道拭子以及組織病料,處理后接種在適宜細(xì)胞上,待細(xì)胞出現(xiàn)病變后,進(jìn)行鏡檢或進(jìn)一步電鏡鑒定。而后將分離出的病毒接種到實(shí)驗(yàn)動(dòng)物上,觀察動(dòng)物的發(fā)病情況。

        3 血清學(xué)診斷技術(shù)

        簡(jiǎn)單、快捷、敏感是血清學(xué)診斷技術(shù)的特點(diǎn),目前診斷PR常用的血清學(xué)方法有:酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定(Enzyme-linked Immuno Sorbent Assay,ELISA)、乳膠凝集試驗(yàn)(Latex Agglutination Test,LAT)、血清中和試驗(yàn)(Serum Agglutination Test,SNT)、瓊脂免疫擴(kuò)散試驗(yàn)(Agar Gel Immunodiffusion,AGID)、血凝(Hemagglutination,HA)試驗(yàn)和血凝抑制(Hemagglutination Inhibition,HI)試驗(yàn)。其中ELISA、LAT和SNT被列為國際貿(mào)易指定實(shí)驗(yàn)技術(shù)。

        3.1 ELISA

        ELISA是在固體載體上以物理方法將抗體(或抗原)進(jìn)行吸附,隨后在此固相載體上進(jìn)行一系列免疫學(xué)和酶促生化反應(yīng)的免疫酶測(cè)定實(shí)驗(yàn),具有特異﹑敏感﹑快速﹑簡(jiǎn)便的優(yōu)點(diǎn),適用于實(shí)驗(yàn)室大批量樣本的檢測(cè)﹑產(chǎn)地檢疫及流行病學(xué)調(diào)查等。

        3.2 LAT

        LAT是利用抗原和抗體特異性結(jié)合的特點(diǎn),先用乳膠將抗原包被,緊接著與相應(yīng)血清進(jìn)行反應(yīng),結(jié)果可在幾分鐘內(nèi)得出,具有操作簡(jiǎn)單﹑方便﹑快速等特點(diǎn)。邱德新等應(yīng)用LAT對(duì)來自35個(gè)豬場(chǎng)的414份血清進(jìn)行了PRV的抗體檢測(cè),檢出168份陽性,陽性率為98.2%。

        3.3 SNT

        SNT是世界上多數(shù)國家診斷PR的法定方法之一,其敏感性和準(zhǔn)確性都較為理想,但操作煩瑣,且受技術(shù)、細(xì)胞等條件限制,不適合作為流行病學(xué)調(diào)查和大批量免疫監(jiān)測(cè)的使用。

        4 分子生物學(xué)診斷方法

        分子生物學(xué)診斷技術(shù)的敏感性和特異性均高于現(xiàn)有的血清學(xué)方法,是診斷疾病最敏感和最特異的方法。尤其當(dāng)偽狂犬病毒隱性感染時(shí),僅靠臨床診斷無法正確判斷,使用分子生物學(xué)技術(shù)可以做出最為細(xì)致的判別,從而及時(shí)隔離出病豬,保障養(yǎng)殖戶的經(jīng)濟(jì)效益。

        4.1 聚合酶鏈反應(yīng)技術(shù)(Polymerase Chain Reaction,PCR)

        PCR的原理與細(xì)胞內(nèi)DNA的復(fù)制過程十分類似,雙鏈DNA分子在臨近沸點(diǎn)時(shí)分離成單鏈的DNA分子,然后以單鏈DNA為模板,DNA聚合酶利用反應(yīng)混合物中的4種脫氧核苷酸(dNTP)合成新生的互補(bǔ)鏈。PCR反應(yīng)可在數(shù)個(gè)小時(shí)之內(nèi)將幾個(gè)拷貝基因放大數(shù)百萬倍。PCR法檢測(cè)速度快,適合PRV的臨床診斷以及流行病學(xué)調(diào)查。該技術(shù)中使用的引物和探針合成方便且適合保存,檢測(cè)時(shí)間短,結(jié)果可靠,同時(shí)還避免了散毒,尤其適合無PRV國家的檢疫。

        4.2 核酸探針技術(shù)

        在多種診斷偽狂犬病的方法中,核酸探針技術(shù)是近年來迅速發(fā)展起來的一種新型分子生物學(xué)技術(shù)。它具有特異性良好﹑敏感性高等優(yōu)點(diǎn),廣泛應(yīng)用于PRV的診斷和檢測(cè)中。利用生物素和地高辛標(biāo)記的探針,Maes等從三叉神經(jīng)節(jié)診斷出了PRV的DNA。2008年,劉志杰等制備了gE基因核酸探針,最低的檢出量達(dá)到4 pg,與PCR檢測(cè)結(jié)果一致,這些數(shù)據(jù)顯示該核酸探針可用于PRV野毒感染的臨床檢測(cè)。

        4.3 基因芯片技術(shù)

        基因芯片技術(shù)是基于PCR技術(shù)和核酸雜交的原理,在載體(如玻片)上可同時(shí)檢測(cè)多種目的基因。張煥容等首次構(gòu)建了PRV-PPV-JEV檢測(cè)的基因芯片,PRV、豬細(xì)小病毒(Porcine Parvovirus,PPV)和流行性乙型腦炎病毒(Japanese Encephalitis Virus,JEV)檢測(cè)的新技術(shù),該基因芯片技術(shù)能夠同步檢測(cè)和鑒別PRV、PPV和JEV,同時(shí)也能夠鑒別PRV的野毒株和基因缺失疫苗株。

        4.4 環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)

        環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)(Loop-Mediated Isothermal Amplification,LAMP)是一種擴(kuò)增DNA的快速新方法,簡(jiǎn)單、實(shí)用、經(jīng)濟(jì)是其主要的特點(diǎn)。根據(jù)PRV gE基因保守序列,楊睿等設(shè)計(jì)了4條引物,凍融處理血液病料后加入熒光染料SYBR Green,應(yīng)用LAMP技術(shù),40 min內(nèi)即檢測(cè)到了PRV的存在。并與標(biāo)準(zhǔn)陰性血清和豬圓環(huán)病毒血清均不反應(yīng)。與PCR技術(shù)相比,LAMP簡(jiǎn)化了病料的前處理過程,從而縮短了檢測(cè)時(shí)間,靈敏度更高,對(duì)病毒DNA的最低檢測(cè)出質(zhì)量濃度為6.2×10-9 mg/L,比普通PCR高出了100倍。根據(jù)PRV DBP基因上的一段序列,王樹芬等設(shè)計(jì)并合成了3對(duì)LAMP引物,通過加入羅丹明B衍生物指示劑,建立了可視化的LAMP方法,可快速準(zhǔn)確檢測(cè)PRV。

        PR的檢測(cè)方法很多,各有其優(yōu)缺點(diǎn)。傳統(tǒng)方法操作較復(fù)雜或耗時(shí)較長,實(shí)際應(yīng)用中有一定的困難;血清學(xué)方法,特別是鑒別ELISA試劑盒的研制成功和廣泛應(yīng)用,不僅使PRV的檢測(cè)變得簡(jiǎn)便﹑快速﹑敏感,還可以鑒別野毒和疫苗毒;分子生物學(xué)方法具有靈敏度高﹑特異性好等特點(diǎn),隨著研究的深入和完善將會(huì)越來越被廣泛應(yīng)用。當(dāng)然,無論哪一種診斷檢測(cè)方法都不能徹底解決所有問題,可以根據(jù)檢測(cè)目的和要求進(jìn)行選擇和配合應(yīng)用,以期達(dá)到早發(fā)現(xiàn)﹑早解決。同時(shí),還應(yīng)不斷深入研究,建立更多快速﹑簡(jiǎn)便﹑實(shí)用的檢測(cè)診斷方法,以更好地促進(jìn)該病的綜合防控和疫病凈化工作的開展。

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