摘 要：本文研究并建立了牛奶中四環(huán)素、土霉素、金霉素和強(qiáng)力霉素這4種四環(huán)素類獸藥的鹽析液-液微萃取-超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜（UPLC-MS/MS）的檢測方法。牛奶樣品經(jīng)Na2EDTA-Mcllvaine 緩沖液提取，在硫酸銨輔助下采用乙腈萃取濃縮后，以0.1%（V/V）甲酸水溶液和乙腈為流動相梯度洗脫，經(jīng)BEH C18柱分離，電噴霧正離子掃描，多反應(yīng)監(jiān)測模式（MRM）檢測，外標(biāo)法進(jìn)行定量。結(jié)果顯示，該方法下4種四環(huán)素類獸藥的最低檢出限為0.71μg/kg；4種化合物在1～100μg/kg濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)均大于0.999；在1、5、50μg/kg加標(biāo)水平下回收率為81.71～109.06%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差均小于8%。本方法簡單快速、靈敏度高，經(jīng)濟(jì)可靠，環(huán)境友好，適用于牛奶中四環(huán)素類獸藥的定性定量分析。

關(guān)鍵詞：鹽析液液萃??；超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法；四環(huán)素類獸藥

目前，牛奶中四環(huán)素類獸藥的檢測方法主要有液相色譜-紫外檢測法、高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法和超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法。樣品中四環(huán)素類獸藥的提取凈化方法主要有固相萃取法和液-液萃取法。近年來，在液-液萃取法的基礎(chǔ)上，又衍生出了鹽析液-液萃取法。這種方法是向樣品溶液和強(qiáng)極性有機(jī)溶劑組成的混合物中加入適當(dāng)?shù)柠}類化合物，促使有機(jī)溶劑更好地從混合物中分離出來[8]。該方法簡單、快速，在大大減少有機(jī)溶劑使用量的同時(shí)，能夠提高像四環(huán)素類獸藥這類極性化合物的萃取效率。

一、材料與方法

1.材料與試劑

鹽酸四環(huán)素（Tetracycline hydrochloride，97.7%）、鹽酸土霉素（Oxytetracycline hydrochloride，97.5%）、鹽酸金霉素（Chlortetracycline hydrochloride，93%）、鹽酸強(qiáng)力霉素（Doxycycline hyclate，98%），4種標(biāo)準(zhǔn)品購于Sigma公司。

乙腈、甲醇、甲酸，購于德國CNW公司，均為色譜純。

乙酸乙酯、乙腈、十二水合磷酸氫二鈉、一水合檸檬酸、乙二胺四乙酸二鈉、硫酸銨、草酸銨均為分析純。

牛奶，由佛山市南海區(qū)水牛奶研究開發(fā)有限公司提供。

2.儀器與設(shè)備

Quattro Premier XE超高效液相色譜-三重四級桿串聯(lián)質(zhì)譜儀（UPLC-MS/MS），美國Waters公司；OA-SYS水浴氮吹儀，美國Organomation公司；電子天平；旋渦混合器；超聲波清洗器；振蕩器；離心機(jī)。

3.實(shí)驗(yàn)方法

（1）溶液配制

Na2EDTA-Mcllvaine 緩沖液：分別稱取2.10g檸檬酸和2.84g磷酸氫二鈉，用水溶解并定容至100mL；將100mL0.1mol/L檸檬酸溶液與62.5mL0.2mol/mL磷酸氫二鈉溶液混合，并加入6.05g乙二胺四乙酸二鈉，使其溶解，搖勻，必要時(shí)用氫氧化鈉或鹽酸調(diào)pH至4.0±0.05，即得0.1mol/L的Na2EDTA-Mcllvaine 緩沖液。

標(biāo)準(zhǔn)溶液配制：分別精確稱取4種四環(huán)素類獸藥標(biāo)準(zhǔn)品2.5mg，用甲醇溶解并定容至25mL，配制成質(zhì)量濃度為100μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)儲備液，于-18℃下避光保存。根據(jù)需要用50%乙腈水溶液逐級稀釋，配制成合適濃度的混合標(biāo)準(zhǔn)工作液。

（2）樣品溶液的制備

稱取1g樣品置于50mL離心管中，添加5mL Na2EDTA-Mcllvaine 緩沖溶液，于旋渦混合器上充分混勻后，置于超聲波清洗器中超聲20min。然后，加入5mL乙腈，置于振蕩器上振蕩混勻15min。隨后，加入5g（NH4）2SO4，渦旋混勻后，4500rpm離心5min，上清液于50℃下N2吹干。殘?jiān)?mL50%乙腈水溶液溶解定容，過0.22μmPTFE濾膜，濾液供超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀測定。

（3）UPLC-MS/MS檢測條件

UPLC條件：色譜柱：Acquity UPLC BEH C18，1.7 μm，100×2.1 mm；柱溫：30 ℃；進(jìn)樣體積：5 μL；流動相：A為0.1%的甲酸水溶液，B為色譜純乙腈；流速：0.2 mL/min；采用梯度洗脫。

質(zhì)譜參數(shù)：電離方式：電噴霧正離子（ESI+）模式；毛細(xì)管電壓：2.5 kV；離子源溫度：120 ℃；脫溶劑溫度：300 ℃；脫溶劑氣流：N2，流速500 L/h；錐孔氣流：N2，流速50 L/h；碰撞氣：氬氣，流速0.12mL/min；掃描模式：多反應(yīng)監(jiān)測（MRM）。

二、結(jié)果與討論

1.質(zhì)譜條件的優(yōu)化

本實(shí)驗(yàn)在調(diào)諧條件下通過注射器直接進(jìn)樣，分別對1μg/mL的各個(gè)標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行母離子和子離子掃描，確定定量和定性離子對，對毛細(xì)管電壓、錐孔電壓、碰撞能和駐留時(shí)間等參數(shù)進(jìn)行了優(yōu)化，表2列出了主要的優(yōu)化參數(shù)。4種四環(huán)素類獸藥混標(biāo)的總離子中可看出 4種獸藥在4min內(nèi)即可實(shí)現(xiàn)快速分離檢測。

2.提取條件的優(yōu)化

液-液萃取方法中，有機(jī)萃取溶劑的選擇至關(guān)重要。在日常的食品安全檢測中，常用的有機(jī)溶劑有甲醇、乙腈、乙酸乙酯、丙酮等。本文選取了乙腈和乙酸乙酯作為研究對象，按照1.3.2的方法處理樣品，通過目標(biāo)化合物的平均回收率來評價(jià)兩者的萃取效果，結(jié)果見圖1。從圖中數(shù)據(jù)可見，采用乙腈作為萃取溶劑時(shí)，4種四環(huán)素類獸藥的平均回收率較高，說明相比于極性較弱的乙酸乙酯，具有強(qiáng)極性的乙腈萃取含有極性基團(tuán)的四環(huán)素類獸藥的效果更好。而且，乙腈還具有沉淀蛋白質(zhì)的能力，能夠提高凈化效果。

不同類型的銨鹽對液-液微萃取過程中相分離的程度存在一定的影響。銨鹽相比于其它鹽類，在電離室能夠輕易揮發(fā)或分解，從而避免對質(zhì)譜造成損害，是一類質(zhì)譜友好的鹽類化合物。本文研究了硫酸銨和草酸銨在液液萃取方法中對相分離程度的影響。從目標(biāo)化合物的加標(biāo)回收率實(shí)驗(yàn)結(jié)果圖2可見，硫酸銨在液-液萃取過程中，能更好地促進(jìn)乙腈和水相的分離，從而提高目標(biāo)化合物的萃取效率，而且回收率的重現(xiàn)性也比草酸銨的要好。

根據(jù)國際純粹與應(yīng)用化學(xué)聯(lián)合會（IUPAC）對檢出限的定義，本實(shí)驗(yàn)在陰性牛奶中添加低濃度的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，使各標(biāo)準(zhǔn)品濃度水平分別為0.5μg/kg和1μg/kg，按1.3.2的方法處理，每個(gè)水平平行測定6次，計(jì)算標(biāo)準(zhǔn)偏差，以3倍標(biāo)準(zhǔn)偏差計(jì)算各個(gè)化合物的檢出限（置信水平P=95%），最終選取檢出限最低的化合物所對應(yīng)的結(jié)果作為本方法的檢出限。結(jié)果顯示，這兩個(gè)水平的檢出限分別為0.71μg/kg和0.95μg/kg。然后，向陰性牛奶中添加0.71μg/kg的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，按照1.3.2中的方法驗(yàn)證，結(jié)果顯示4種四環(huán)素類獸藥在超高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀上仍然有響應(yīng)，且信噪比S/N>3，因此，確定本方法的檢出限為0.71μg/kg。

三、結(jié)論

本文研究了鹽析液液萃取-超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法檢測牛奶中四環(huán)素、土霉素、金霉素和強(qiáng)力霉素這4種四環(huán)素類獸藥的檢測方法。該方法下4種四環(huán)素類獸藥最低檢出限為0.71μg/kg；4種化合物在1～100μg/kg質(zhì)量濃度范圍內(nèi)線性相關(guān)性較好，相關(guān)系數(shù)均大于0.999；在1、5、50μg/kg加標(biāo)水平下平均回收率為81.71～109.06%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差均小于7%，滿足四環(huán)素類獸藥日常檢測工作的需要。本方法簡單快速、經(jīng)濟(jì)可靠、靈敏度高、環(huán)境友好，適用于牛奶中四環(huán)素類獸藥的定性定量分析。

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作者簡介：

羅瑞漣（1991--）女，碩士，主要從事食品風(fēng)險(xiǎn)檢測的工作。