費(fèi)理文，王勇

1(上海市農(nóng)業(yè)科學(xué)院 食用菌研究所，農(nóng)業(yè)部南方食用菌資源利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，國(guó)家食用菌工程技術(shù)研究中心，國(guó)家食用菌加工技術(shù)研發(fā)分中心，上海市農(nóng)業(yè)遺傳育種重點(diǎn)開放實(shí)驗(yàn)室，上海, 201403) 2(中科院上海生命科學(xué)研究院 植物生理生態(tài)研究所，上海, 200032)

來自甜葉菊的甜菊糖苷類化合物因其甜度高、熱量低、無(wú)毒性、耐高溫、耐酸堿和水溶性好等優(yōu)點(diǎn)，受到了科學(xué)界、產(chǎn)業(yè)界等多個(gè)領(lǐng)域的廣泛重視。其中含量相對(duì)豐富的甜菊糖、萊鮑迪苷A(Rebaudioside A，RA)等已廣泛應(yīng)用于飲料、食品、調(diào)味劑、酒類、乳制品等食品加工領(lǐng)域[1-9]。雖然RA和甜菊糖具有高甜度，但是口感上與蔗糖相比仍有除了甜味之外的苦后味等非純粹甜味[10]。而甜菊糖苷類化合物組分眾多，目前已知四十多種組分均具有四環(huán)二萜母核及不同程度的糖基化修飾，具有不同程度甜味口感[3, 11-13]。在這一點(diǎn)上萊鮑迪苷D(Rebaudioside D，RD)具有更好的口感特性，是甜菊糖苷類甜味劑開發(fā)的升級(jí)方向之一，美國(guó)食品藥品監(jiān)督管理局(Food and Drug Administration, FDA)于2017年認(rèn)證RD為“一般安全”物質(zhì)(Generally Recognized as Safe，GRAS)應(yīng)用于食品行業(yè)[14]。

然而甜葉菊中RD這樣高品質(zhì)的組分含量低，僅占干葉質(zhì)量的約0.5%，用傳統(tǒng)分離方法難以得到高純度產(chǎn)品且產(chǎn)量也無(wú)法滿足市場(chǎng)需要[3]。為解決這一問題, 歐美等國(guó)都在研發(fā)甜菊糖苷類化合物的微生物異源合成方法, 期望能夠定向、高效地合成高品質(zhì)的甜菊糖苷組分。目前甜菊糖苷母核以及后續(xù)糖基化的生物合成過程及其相關(guān)的催化酶已基本清楚，為定向催化合成RD提供了基礎(chǔ)[3]。RD可由RA在尿苷二磷酸葡萄糖(uridine diphosphate glucose, UDPG)的存在下經(jīng)一步糖基轉(zhuǎn)移反應(yīng)獲得，本實(shí)驗(yàn)室在前期工作中用水稻糖基轉(zhuǎn)移酶EUGT11構(gòu)建大腸桿菌異源表達(dá)體系，實(shí)現(xiàn)體外催化來源相對(duì)豐富的前體RA通過一步糖基化反應(yīng)生產(chǎn)RD[15]。但是該工程菌催化RD產(chǎn)量低下，需要向催化體系外源添加活化糖配體UDPG，而UDPG成本高昂，以外源添加形式進(jìn)行生產(chǎn)不可行，因此需要進(jìn)一步探索增加異源催化細(xì)胞內(nèi)源性UDPG供給的改造策略。為了增加大腸桿菌內(nèi)源性UDPG供應(yīng)，需要對(duì)宿主進(jìn)行代謝工程改造，主要策略包括兩個(gè)方面：一方面是對(duì)宿主自身的代謝流進(jìn)行改造，引導(dǎo)代謝物往UDPG富集的方向流動(dòng)，并且減少UDPG的消耗途徑；另一方面是挖掘自然界其他物種的UDPG合成通路，將其引入大腸桿菌系統(tǒng)。本文利用基因重組技術(shù)對(duì)大腸桿菌宿主BL21(DE3)進(jìn)行UDPG合成途徑中分支代謝的相關(guān)基因敲除改造，并且在染色體中整合可以利用蔗糖并將其磷酸化為UDPG合成前體1-磷酸葡萄糖(glucose-1-phosphate，G1P)的蔗糖磷酸化酶(E.C 2.4.1.7)以及催化UDPG合成的G1P尿苷基轉(zhuǎn)化酶基因，從而實(shí)現(xiàn)內(nèi)源性UDPG的富集。在經(jīng)UDPG富集化改造的宿主內(nèi)表達(dá)糖基轉(zhuǎn)移酶EUGT11可實(shí)現(xiàn)RD的高效全細(xì)胞催化(圖1)。該項(xiàng)工作探索出了切實(shí)可行的大腸桿菌全細(xì)胞催化糖基化產(chǎn)物的轉(zhuǎn)化平臺(tái)催化平臺(tái)。

圖1 改造底盤細(xì)胞UDPG合成代謝路徑高效催化RA合成RD
Fig.1 Schematic diagram of chassis modification for enhanced biosynthesis of UDPG used in biocatalysis of RD from RA

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

起始菌株E.coliBL21(DE3)為本實(shí)驗(yàn)室保藏，其他改造菌株為本實(shí)驗(yàn)構(gòu)建，具體信息見表1。質(zhì)粒pYF09為本實(shí)驗(yàn)室前期構(gòu)建[15]。

表1 底盤改造菌株與質(zhì)粒Table 1 Host strains and plasmids used in this study

引物合成及測(cè)序：上海生工；各限制性內(nèi)切酶：New England Biolabs公司；PrimeSTAR Max：大連TaKaRa公司；質(zhì)粒抽提及DNA片段純化與膠回收試劑盒：AXYGEN公司；Vazyme ClonExpress II 一步法克隆試劑盒：南京諾維贊；RA標(biāo)準(zhǔn)品(純度>97%)：Thermo Fisher；RD標(biāo)準(zhǔn)品(純度>95%)：四川盈嘉合生物科技；異丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)、氨芐青霉素及卡納霉素：上海生工；酵母提取物及胰蛋白胨：OXOID公司；其余各種化學(xué)試劑：上海國(guó)藥集團(tuán)。

1.2 儀器設(shè)備

PCR儀,Thermo Fisher；小型離心機(jī),Eppendorf；高速冷凍離心機(jī),Eppendorf；高效液相色譜儀Ultra 3000,Thermo Fisher(前戴安)；搖床,智誠(chéng)。

1.3 方法

1.3.1 大腸桿菌E.coliBL21(DE3)底盤細(xì)胞改造

改造工作分為兩個(gè)部分，一方面是對(duì)E.coliBL21(DE3)1-磷酸葡萄糖(G1P)的非UDPG合成消耗途徑進(jìn)行基因敲除，包括磷酸變位酶基因(phosphoglucomutase，pgm)、1-磷酸葡萄糖腺苷?；D(zhuǎn)移酶基因(G1P adenylyltransferase，glgC)以及1-磷酸葡萄糖磷酸酶基因(G1P phosphatases，agp)。這3個(gè)基因分別負(fù)責(zé)將1-磷酸葡萄糖轉(zhuǎn)化成供應(yīng)糖酵解途徑的6-磷酸葡萄糖、形成糖原儲(chǔ)存前體ADP-葡萄糖以及降解。另一方面在染色體中引入異源途徑，提高G1P以及UDPG的合成。引入染色體的異源基因包括來源于青春雙歧桿菌(Bifidobacteriumadolescentis)的蔗糖磷酸化酶基因(BasP，NCBI Gene ID: 4556453)以及來源于兩歧雙歧桿菌(Bifidobacteriumbifidum)的G1P尿苷基轉(zhuǎn)化酶基因(UgpA，NCBI Gene ID: 9889115)。各改造菌株信息見表1, 突變菌株SG1～SG4依次敲除基因glgC、pgm、agp以及替換原有UDPG合成酶基因ushA為全合成的包含Basp和ugpA的T5 操縱子。E.coliBL21(DE3)染色體基因敲除參照經(jīng)改良的λRed-CRISPR/Cas技術(shù)方法[16]，首先針對(duì)各個(gè)被敲除基因設(shè)計(jì)CRISPR/Cas9特異性靶點(diǎn)gRNA，然后設(shè)計(jì)同源臂，接著構(gòu)建相應(yīng)pTargetT-Δ目標(biāo)基因質(zhì)粒，電轉(zhuǎn)化含有pCas質(zhì)粒(表達(dá)Cas9)的目標(biāo)菌株，對(duì)目標(biāo)基因進(jìn)行無(wú)痕敲除(表1和表2)。SG1以E.coliBL21(DE3)為目標(biāo)菌株，隨后的SG菌株依此以前一個(gè)SG菌株為基因編輯目標(biāo)菌株?；蚯贸安迦牍ぷ骶赡暇┙鹚谷鹕锟萍纪瓿?。

表2 基因敲除突變所用gRNA序列Table 2 List of gRNA sequences used for the creation of knockouts

1.3.2 全細(xì)胞催化合成RD

將pYF09轉(zhuǎn)化改造菌株，挑取含100 μg/mL氨芐青霉素的LB轉(zhuǎn)化平板上的單克隆接種至含抗生素的液體LB，37 ℃搖床轉(zhuǎn)速250 r/min培養(yǎng)過夜。然后以1%接種量接種至100 mL含抗生素的LB培養(yǎng)基，同樣條件培養(yǎng)約1.5 h監(jiān)測(cè)OD600值達(dá)到0.3～0.4左右時(shí)停止培養(yǎng)，菌液降溫至16 ℃左右后加入IPTG誘導(dǎo)，誘導(dǎo)劑IPTG終濃度0.1 mmol/L。隨后將培養(yǎng)菌液置于16 ℃，180 r/min轉(zhuǎn)速培養(yǎng)18 h培養(yǎng)結(jié)束后離心收集菌體，以100 mmol/L pH 8磷酸鈉緩沖液重懸清洗2遍后用于細(xì)胞催化反應(yīng)。基本催化體系為2 mL，以100 mmol/L pH8 磷酸鈉緩沖液配制，每mL 含0.2 g 濕菌體、60 mmol/L 檸檬酸三鈉、1 mmol/L RA、1 mmol/L UDPG、質(zhì)量分?jǐn)?shù)5%蔗糖、0.1%體積分?jǐn)?shù)Triton X-100，0.1 mmol/L ZnCl2。催化反應(yīng)條件為37 ℃，反應(yīng)時(shí)間24 h。隨后對(duì)SG4菌株的細(xì)胞催化進(jìn)行單因素研究，在體系內(nèi)完全不添加UDPG的情況下，以基本催化體系和條件為基礎(chǔ)分別考察表面活性劑Triton X100體積分?jǐn)?shù)(0、0.1%、0.5%、1%)、磷酸鈉緩沖液pH(6.4、7.0、7.2、7.4、8.0)、RA添加濃度(0.25、0.5、1、2、3 mmol/L)、蔗糖質(zhì)量濃度(0、100、150、200、300、400、500、600 g/L)、菌濃度(25、50、100、200、300 mL培養(yǎng)菌液離心所收集菌體)、檸檬酸鈉濃度(0、20、40、60、80、100 mmol/L)、反應(yīng)溫度(20、25、30、37、42、45、50 ℃)及轉(zhuǎn)化時(shí)間(0.5、1、2、3、4、5 d)8個(gè)因素對(duì)全細(xì)胞催化RA生產(chǎn)RD能力的影響。每個(gè)條件平行3組實(shí)驗(yàn)。

1.3.3 檢測(cè)與統(tǒng)計(jì)分析

細(xì)胞催化結(jié)束后離心取上清，過濾0.2 μm濾膜后由高效液相進(jìn)行檢測(cè)。色譜柱Thermo Hypersil Gold AQ 250 mm×4.6 mm×5 μm，檢測(cè)波長(zhǎng)205 nm，柱溫控制40 ℃，進(jìn)樣量40 μL。色譜條件為：A相水，B相乙腈，0～5 min 75% A +25% B，5～30 min 從25% B相乙腈濃度升高至65%，30～34 min保持65% B，34～35 min B相比例從65%降至25%，35～40 min 25% B。以標(biāo)品配置濃度梯度溶液制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，RA標(biāo)準(zhǔn)曲線為UV205峰面積=0.260 6×RA濃度-0.931 8；RD標(biāo)準(zhǔn)曲線為UV 205 nm峰面積=0.202 5×RD濃度-0.1357。催化反應(yīng)結(jié)束后的反應(yīng)體系離心取上清，0.2 μm濾膜過濾后進(jìn)行液相分析。數(shù)據(jù)由SPSS軟件中GLM one-way ANOVA進(jìn)行分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 底盤改造菌株催化RA生產(chǎn)RD

本工作采用蔗糖磷酸化酶(EC 2.4.1.7)催化蔗糖產(chǎn)生果糖和G1P來分流糖酵解與UDPG的生物合成，同時(shí)引入U(xiǎn)TP-1-磷酸葡萄糖尿苷轉(zhuǎn)移酶以實(shí)現(xiàn)UDPG的富集。表達(dá)宿主E.coliBL21(DE3)以方法1.3.1進(jìn)行不同程度的改造，獲得突變宿主菌SG1、SG2、SG3和SG4。將含糖基轉(zhuǎn)移酶EUGT11的重組質(zhì)粒pYF09分別轉(zhuǎn)化到這些不同程度改造的宿主菌中，同時(shí)以原始菌株E.coliBL21(DE3)為陰性對(duì)照進(jìn)行全細(xì)胞催化實(shí)驗(yàn)，比較不同宿主菌的催化效果。結(jié)果顯示，各個(gè)改造宿主菌發(fā)酵生物量無(wú)明顯差別(圖2)。從催化生產(chǎn)RD的結(jié)果看，重組大腸桿菌pYF09-SG1及pYF09-SG2同改造前pYF09-BL21(DE3)相比催化活性沒有顯著差異，pYF09-SG3雖有所提高但差異并不顯著，只有pYF09-SG4催化所得RD則比未改造宿主及SG1、SG2有顯著提高，SG4宿主催化產(chǎn)生RD達(dá)317.3 mg/L(圖3)。

圖2 表達(dá)EUGT11的各重組菌生物量(誤差線：±SE)
Fig.2 Biomass of different engineered strains expressing EUGT11

圖3 表達(dá)EUGT11的不同重組菌株對(duì)轉(zhuǎn)化RA生產(chǎn)RD的影響
Fig.3 Effect of different EUGT 11 expressing E. coli strains on biocatalysis of RD from RA
誤差線: ± SE; 不同字母比較不同表達(dá)EUGT11 突變改造宿主的全細(xì)胞催化RA 生產(chǎn)RD 的能力，p<0.05

菌株SG1～SG3均為僅敲除大腸桿菌底盤中原有的G1P消耗途徑的突變株，以它們?yōu)樗拗鞅磉_(dá)EUGT11催化生產(chǎn)RD的結(jié)果顯示針對(duì)底盤原有G1P的改造并不能有效提高內(nèi)源UDPG的供應(yīng)(圖3)。而結(jié)合引入異源途徑增加G1P的合成后，RD產(chǎn)量就獲得了顯著增加，說明以大腸桿菌為宿主過表達(dá)糖基轉(zhuǎn)移酶進(jìn)行全細(xì)胞催化糖基化反應(yīng)時(shí)，僅僅對(duì)原有UDPG合成通路進(jìn)行分支代謝敲除是不夠的，還需要引入外源途徑方可滿足催化反應(yīng)需要(圖3)。針對(duì)UDPG代謝通路的改造以提高其內(nèi)源性供應(yīng)的嘗試已有不少，F(xiàn)AN[17]等人嘗試通過增強(qiáng)表達(dá)從6-磷酸葡萄糖到UDPG這條代謝路徑中的參與酶基因(pgm、ugp、glgX以及spy)來增加內(nèi)源性UDPG的供給，但除了增加ugp表達(dá)之外，其余針對(duì)6-磷酸葡萄糖(glucose-6-phosphate，G6P)及G1P的改造效果并不明顯。BRUYN[18-19]等人也發(fā)現(xiàn)，僅僅針對(duì)底盤自身的G1P消耗通路的相關(guān)基因敲除不能有效提高G1P含量，這可能與G6P與G1P均系中心代謝的樞紐，受到嚴(yán)格調(diào)控有關(guān)。本文中僅敲除E.coliBL21(DE3)G1P消耗途徑并不能有效提高RD產(chǎn)量，與前人工作結(jié)果一致?，F(xiàn)有文獻(xiàn)結(jié)果表明針對(duì)底盤內(nèi)源性UDPG供給的改造，需要引入外源合成UDPG的模塊才能有效提高UDPG供應(yīng)[18-25]，這也與本研究所得結(jié)果一致。

2.2 轉(zhuǎn)化條件對(duì)轉(zhuǎn)化反應(yīng)的影響

獲得UDPG供給改造工程菌pYF09-SG4后需要進(jìn)一步研究各催化條件對(duì)催化反應(yīng)的影響。前期以E.coliBL(DE3)為宿主構(gòu)建工程菌催化生產(chǎn)RD時(shí)，已經(jīng)研究了包括反應(yīng)緩沖液pH、表面活性劑、細(xì)胞用量、檸檬酸鈉濃度、UDPG濃度、反應(yīng)溫度、反應(yīng)時(shí)間等催化條件，獲得了一些表達(dá)EUGT11細(xì)胞催化的優(yōu)化參數(shù)[15]。本文針對(duì)改造后宿主構(gòu)建的工程菌可能發(fā)生變化的催化條件，均進(jìn)行了單因素研究。

在不添加外源UDPG進(jìn)行全細(xì)胞催化時(shí)，表面活性劑Triton X100的最佳添加量為體積分?jǐn)?shù)0.1%，繼續(xù)增加用量不僅無(wú)法提高RD產(chǎn)量，還會(huì)使整個(gè)體系在后續(xù)分離純化過程中產(chǎn)生乳化現(xiàn)象，增加分離難度，且高濃度Triton X100還可能存在細(xì)胞毒性，降低RD產(chǎn)量(圖4-A)。催化反應(yīng)在磷酸鈉緩沖液pH 8.0時(shí)效果最佳，這與前期的研究結(jié)果一致，提示在催化反應(yīng)體系pH 8.0糖基轉(zhuǎn)移酶EUGT11效率高(圖4-B)[15]。檸檬酸鈉濃度在80及100 mmol/L時(shí)相較其他低濃度的RD產(chǎn)量更高，可能是在高濃度檸檬酸鈉條件下，細(xì)胞EMP途徑可獲得更有效的抑制，即細(xì)胞可更好地維持在靜息狀態(tài)進(jìn)行生物催化反應(yīng) (圖4-C)。細(xì)胞用量在50 mL發(fā)酵液對(duì)應(yīng)菌體時(shí)RD產(chǎn)量最高(圖4-D)，過低的細(xì)胞用量達(dá)不到催化效果，而多余的細(xì)胞可能會(huì)影響催化體系的傳質(zhì)從而無(wú)法實(shí)現(xiàn)高效催化，這與前期以BL21(DE3)進(jìn)行催化的趨勢(shì)相同[15]。RD產(chǎn)量隨底物RA添加量的增加而有所增加，但變化并不顯著，提示還有其他更關(guān)鍵的因素在影響生物催化反應(yīng)(圖4-E)。轉(zhuǎn)化時(shí)間1 d時(shí)達(dá)到最高，隨后開始下降，2 d后趨于平衡(圖4-F)。催化反應(yīng)最佳溫度為42 ℃，進(jìn)一步升高溫度可能破壞蛋白結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致催化活性下降(圖4-G)。所有條件中，蔗糖濃度對(duì)RD產(chǎn)量的影響是最大的，增加體系內(nèi)蔗糖濃度可以極大提高RD產(chǎn)量，實(shí)現(xiàn)〉95%的底物轉(zhuǎn)化，提示低蔗糖濃度條件下UDPG的合成機(jī)制沒有充分運(yùn)轉(zhuǎn)起來，導(dǎo)致UDPG供應(yīng)不足，從而使之成為了整個(gè)催化反應(yīng)的瓶頸(圖4-H)。催化反應(yīng)的體系需要添加500 g/L高濃度蔗糖才能到達(dá)最高產(chǎn)量,可能是源于大腸桿菌B株系列的BL21(DE3)缺乏蔗糖透性酶，胞外蔗糖無(wú)法有效地進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)部[26]。而高濃度的蔗糖一方面可以通過濃度梯度進(jìn)入細(xì)胞，另一方面可以通過高滲透壓導(dǎo)致細(xì)胞通透性提高而進(jìn)入細(xì)胞。在SCHM?LZER[20]的研究中，以E.coliBL21(DE3)為宿主催化合成UDPG，外源添加蔗糖的濃度也高達(dá)50%，與本研究結(jié)果相似。

A-表面活性劑Triton X100對(duì)RD產(chǎn)量的影響；B-緩沖液pH對(duì)RD產(chǎn)量的影響；C-檸檬酸鈉對(duì)RD產(chǎn)量的影響；D-菌量對(duì)RD產(chǎn)量的影響；E-RA濃度對(duì)RD產(chǎn)量的影響；F-生物轉(zhuǎn)化時(shí)間對(duì)生產(chǎn)RD的影響；G-催化溫度對(duì)RD產(chǎn)量的影響；H-蔗糖濃度對(duì)RD產(chǎn)量的影響
圖4 細(xì)胞催化條件對(duì)pYF09-SG4生物催化RA生產(chǎn)RD的影響
Fig.4 Effect of different conditions on biocatalysis of RD by pYF09-SG4
(誤差線±SE，不同字母表示顯著差異，p<0.05)

3 結(jié)論

本研究建立了利用水稻糖基轉(zhuǎn)移酶EUGT11及經(jīng)過UDPG通路改造的大腸桿菌全細(xì)胞催化合成甜菊糖苷RD的方法。為了解決大腸桿菌內(nèi)源糖供體不足UDPG的問題，對(duì)E.coliBL21(DE3)進(jìn)行UDPG合成途徑中代謝分支的相關(guān)基因敲除改造，同時(shí)在染色體中整合了蔗糖磷酸化酶基因(BasP)及G1P尿苷基轉(zhuǎn)化酶基因(UgpA)，使UDPG得以富集。以經(jīng)改造的SG4宿主菌表達(dá)EUGT11催化RA生產(chǎn)RD，經(jīng)過條件優(yōu)化后可催化1 mmol/L RA(約1 g/L)生成約1.1 g/L RD，底物轉(zhuǎn)化率達(dá)98.5%，為工程化生產(chǎn)稀少組分RD奠定了技術(shù)基礎(chǔ)。