黃勝佳，葉霜，熊博，劉新亞，徐穎歡，董志翔，汪志輝，2*

1(四川農(nóng)業(yè)大學(xué) 園藝學(xué)院，四川 成都，611130) 2(四川農(nóng)業(yè)大學(xué) 果蔬研究所，四川 成都，611130)

柑橘(Citrus)為蕓香科(Rutaceae)柑橘亞科(Subfamilyaurantioideae)植物[1]，是全世界種植最多的水果之一。橙類是世界栽培最廣泛的柑橘種類，分為甜橙、臍橙、血橙等[2]，具有非常高的營養(yǎng)價值。雜柑是由橘和橙(或柚)雜交而成，兼有橘和橙(或柚)的優(yōu)勢[3]。

柑橘果實富含能參與人體新陳代謝、調(diào)節(jié)有關(guān)生理活動、對人體保健和疾病防治有重要作用的生物活性物質(zhì)[4-5]。果蔬中富含酚類物質(zhì)，其中類黃酮約占2/3，酚酸約占1/3[6]。近年來研究表明，酚類物質(zhì)具有抗炎[7]、抗氧化[8]、抗過敏、抗癌、抗突變、抑菌等重要作用[9]。目前，對不同柑橘品種酚酸和類黃酮的含量差異研究主要集中于柚類[10-12]、金柑[13]、寬皮柑橘以及柑橘幼果[14]，對名、特、優(yōu)、新且在水果市場具有廣闊發(fā)展前景的雜柑以及橙類進(jìn)行比較、分析的報道較少。

本研究在前人基礎(chǔ)上[15-17]，通過優(yōu)化HPLC條件，在保證檢測酚類物質(zhì)多元化的同時，樣品前期處理簡單、操作簡便，無需繁瑣的提取步驟，且檢測時間短，檢測限、精密度和回收率方面的效果優(yōu)良。本試驗對四川主栽雜柑和橙類中10種酚類物質(zhì)的含量進(jìn)行測定，探討不同柑橘品種果肉、果皮中酚類物質(zhì)含量的差異，分析其規(guī)律。

1 材料與方法

1.1 材料

選取生長健壯、樹勢樹形基本一致、株行距為3 m×4 m、中等管理水平的口之津32號、沃柑、金諾、黃果柑、春見、晚紅血橙、塔羅科血橙、奈維林娜臍橙為試材。在果實成熟期，每株樹按樹冠外圍的東、南、西、北、中5個部位采樣，每個部位隨機(jī)采取中等大小、無病蟲害無畸形的3個果，采回后將果皮、果肉分離，置于-80 ℃冰箱中冷凍保存?zhèn)溆谩?/p>

標(biāo)準(zhǔn)品：柚皮素(naringenin)、柚皮苷(naringin)、新橙皮苷(neohesperidin)、咖啡酸(caffeic acid)、芥子酸(sinapic acid)、綠原酸(chlorogenic acid)、阿魏酸(ferulic acid)、沒食子酸(gallic acid)、蘆丁(rutin)和對羥基苯甲酸(p-hydroxybenzoic acid)，均購自Sigma公司，純度均在98%以上。甲醇、甲酸和乙腈均為色譜純，購自麥克林公司；實驗用水為超純水。

1.2 方法

1.2.1 樣品前處理

從-80 ℃冰箱中取出凍成塊的果皮、果肉，將其敲碎后混勻，分別取果皮和果肉至研缽中，加入液氮研磨成粉末后，準(zhǔn)確稱取0.5 g混合樣放入2 mL離心管中，避光條件下加入1.5 mL提取液[V(甲醇)∶V(水)∶V(甲酸)=70∶28∶2]，充分混勻。將離心管放入超聲裝置中輔助提取30 min后，在4 ℃、5 000 r/min離心條件下離心15 min。取出離心管，吸取上清液。用0.45 μm微孔濾膜過濾，貯存于-20 ℃冰箱中，用于酚酸及類黃酮的分析。

1.2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

用甲醇(色譜純)將每瓶定量的20 mg標(biāo)準(zhǔn)品分別溶解，定容于10 mL棕色容量瓶中，配制成2 g/L的標(biāo)準(zhǔn)品母液。全程都進(jìn)行避光處理，將上述母液用流動相分別配制成0.25、0.5、1、2、5、10、25、50、100 mg/L的濃度梯度，再配制成混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，避光保存于-20 ℃以下的環(huán)境中[17]。

將上述混合標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行色譜分析，以標(biāo)樣的質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)，繪制出10種酚類物質(zhì)的標(biāo)準(zhǔn)曲線，并且計算出回歸方程和相關(guān)系數(shù)。

1.2.3 色譜條件

使用安捷倫1260液相色譜儀，C18色譜柱(5 μm，4.6 mm×150 mm)，柱溫30 ℃，進(jìn)樣量20 μL。流動相：A為甲酸溶液，體積分?jǐn)?shù)為10%，B為乙腈，梯度洗脫，流速為1 mL/min，洗脫程序表1所示。

表1 流動相配比與洗脫時間Table 1 Flow matching ratio and elution time

柚皮苷、新陳皮苷、柚皮素用283 nm波長檢測，咖啡酸、芥子酸、綠原酸、阿魏酸用320 nm波長檢測，沒食子酸用280 nm波長檢測，對羥基苯甲酸用260 nm波長檢測，蘆丁用367 nm波長檢測[18-21]。由于本實驗所用安捷倫1260儀器的檢測器只能在方法中設(shè)置波長，而不能自動檢測并調(diào)整到最適波長，所以在測定前需對波長進(jìn)行系統(tǒng)設(shè)置。蘆丁和芥子酸出峰時間相近，對羥基苯甲酸和綠原酸出峰時間相近，雖在樣品中能準(zhǔn)確分離，但無法準(zhǔn)確設(shè)置切換波長的時間，即檢測時1個樣測定2次，第1次共檢測280, 320，283 nm三個波長，在此條件下能檢測出咖啡酸、芥子酸、綠原酸、阿魏酸、柚皮苷、新橙皮苷、柚皮素、沒食子酸。第2次檢測260 nm和367 nm波長，在此條件下能檢驗出對羥基苯甲酸和蘆丁。

1.3 數(shù)據(jù)分析

試驗數(shù)據(jù)用IBM SPSS 19.0軟件，以p<0.05為顯著水平，對結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計分析；用IBM SPSS 19.0軟件，進(jìn)行維度的偏好性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 酚類物質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)品色譜分析

圖1為混合標(biāo)準(zhǔn)品55 min內(nèi)分別在280、320、367、283 nm波長下的色譜圖。根據(jù)保留時間的不同，峰依次為沒食子酸、綠原酸、咖啡酸、阿魏酸、芥子酸、蘆丁、柚皮苷、新橙皮苷、柚皮素。由圖1可知，9種酚類物質(zhì)出峰較好，可滿足多種酚類物質(zhì)的同時分離。圖2為對羥基苯甲酸在260 nm波長下的色譜圖。由于對羥基苯甲酸出峰時間在7 min左右，與綠原酸出峰時間相近，無法準(zhǔn)確設(shè)置切換波長的時間，故分開來測定。由圖2可知對羥基苯甲酸出峰較好。

圖1 混合標(biāo)樣在不同波長下的色譜圖
Fig.1 Chromatogram of mixed standard samples at different wave lengths

圖2 對羥基苯甲酸在260 nm波長下的色譜圖
Fig.2 Chromatogram of p-hydroxybenzoic acid at 260 nm wave length

2.2 HPLC分析方法的考察

2.2.1 線性關(guān)系及檢出限

將混合標(biāo)準(zhǔn)溶液配制成不同濃度在色譜條件下進(jìn)行測定，根據(jù)色譜圖計算回歸方程、相關(guān)系數(shù)、線性范圍和檢出限。由表2可知，各標(biāo)準(zhǔn)品的濃度與峰面積呈現(xiàn)出良好的線性相關(guān)，相關(guān)系數(shù)達(dá)到0.999 1～1，準(zhǔn)確度較高。且檢出限低于0.03 μg/g，滿足酚酸和類黃酮的檢測分析。

表2 酚類物質(zhì)的標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程、相關(guān)系數(shù)、線性范圍、檢出限Table 2 Regression equations, correlation coefficients, linearity range, detection limit of phenolic compositions

2.2.2 精密度試驗

將50 mg/L混合標(biāo)準(zhǔn)溶液按1.2.3的色譜條件重復(fù)進(jìn)樣6次，根據(jù)各標(biāo)準(zhǔn)品的峰面積計算標(biāo)準(zhǔn)溶液的標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)以確定該色譜方法的精密度?？Х人帷⒔孀铀?、綠原酸、阿魏酸、沒食子酸、蘆丁、柚皮苷、新陳皮苷、柚皮素、對羥基苯甲酸的RSD值分別為0.89%、0.92%、0.38%、0.82%、1.90%、0.96%、1.12%、1.00%、0.73%、0.61%。各物質(zhì)的RSD介于0.38%～1.90%，說明該方法具有很好的精密度。

2.2.3 重復(fù)性試驗

準(zhǔn)確稱取同一份樣品6份，按1.2.1的樣品前處理方法將樣品做相同處理后，在1.2.3的色譜條件下將進(jìn)行測定，根據(jù)峰面積計算各樣品中酚類物質(zhì)的含量，并計算得出RSD值。咖啡酸、芥子酸、綠原酸、阿魏酸、沒食子酸、蘆丁、柚皮苷、新陳皮苷、柚皮素、對羥基苯甲酸的RSD值分別為3.42%、3.45%、3.44%、2.42%、2.84%、2.85%、1.88%、3.16%、2.75%、3.52%，10種酚類物質(zhì)的RSD值均小于3.52%，表明該測定方法的重復(fù)性良好。

2.2.4 穩(wěn)定性試驗

將處理好的待測溶液分別在0、2、4、6、8、12、24、36、48 h進(jìn)樣，測定樣品中10種酚類物質(zhì)含量。樣品中咖啡酸、阿魏酸、綠原酸、蘆丁、柚皮苷、對羥基苯甲酸、柚皮素保留時間和含量的RSD值均小于4.69%，表明在48 h內(nèi)穩(wěn)定性良好；芥子酸、沒食子酸、新陳皮苷保留時間和含量的RSD值在12 h內(nèi)小于4.22%，表明其在12 h內(nèi)穩(wěn)定性良好，應(yīng)在12 h內(nèi)完成測定。

2.2.5 加樣回收率試驗

準(zhǔn)確稱取已知含量的樣品6份，根據(jù)樣品中各酚類物質(zhì)含量確定各標(biāo)樣的添加量，分別加入一定量的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，進(jìn)行回收率實驗。結(jié)果如表3所示，平均回收率為90.26%～118.85%，RSD為0.96%～3.01%，表明該試驗方法準(zhǔn)確度較高。

表3 回收率試驗結(jié)果Table 3 Results of recovery

2.3 柑橘果實中酚酸物質(zhì)含量的測定

2.3.1 柑橘果肉中酚酸含量的測定

由表4可知，不同柑橘品種果肉中酚酸含量組成差異較大，在雜柑和橙類果肉中均檢測到了咖啡酸、沒食子酸和對羥基苯甲酸；在橙類和口之津32號果肉中均未檢測到阿魏酸；只有塔羅科血橙、奈維林娜臍橙和黃果柑檢測到了芥子酸；除金諾外其他品種中均檢測到了綠原酸。

表4 不同柑橘品種果肉中酚酸含量 單位：μg/g 鮮重

注：表中所有含量均以鮮質(zhì)量計。同列數(shù)據(jù)后字母不同表示處理間差異顯著(p<0.05)。表5、表6、表7同。

不同柑橘品種果肉中同一種酚酸的差異較顯著，口之津32號果肉中咖啡酸的含量為6.027 5 μg/g，顯著高于金諾、晚紅血橙和沃柑等，其中奈維林娜臍橙最低，為2.338 4 μg/g；奈維林娜臍橙和黃果柑果肉中芥子酸的含量顯著高于其他品種，分別為1.632 8、1.535 3 μg/g；塔羅科血橙果肉中綠原酸的含量為11.345 5 μg/g，其次為黃果柑和奈維林娜臍橙，顯著高于其他幾個品種；金諾和春見果肉中阿魏酸的含量分別為1.316 2 μg/g、1.289 6 μg/g，顯著高于其他品種；果肉中沒食子酸的含量以金諾最高，為4.076 7 μg/g；在不同柑橘品種果肉中，對羥基苯甲酸的含量差異顯著，含量為2.116 1～3.033 8 μg/g。

2.3.2 柑橘果皮中酚酸含量的測定

由表5可知，口之津32號果皮中總酚酸含量最高，其次依次為沃柑、晚紅血橙、春見、金諾、奈維林娜臍橙、塔羅科血橙、黃果柑。在橙類果皮中，塔羅科血橙的芥子酸含量最高，其次依次為奈維林娜臍橙、晚紅血橙，顯著高于其他雜柑；另一方面，從不同柑橘品種果皮中主要酚酸物質(zhì)組成含量分析，口之津32號和金諾果皮中酚酸以咖啡酸為主，其次為綠原酸。塔羅科血橙、晚紅血橙、沃柑、奈維林娜臍橙果皮中酚酸以綠原酸為主，其次為咖啡酸。在春見和黃果柑果皮中，酚酸主要以綠原酸為主，其次為沒食子酸；從不同柑橘品種果皮中同一酚酸物質(zhì)的含量差異方面分析，口之津32號果皮中咖啡酸含量(98.888 8 μg/g)顯著高于其他幾個品種，奈維林娜臍橙、春見、黃果柑中含量最低。塔羅科血橙果皮中芥子酸含量為12.088 8 μg/g，顯著高于其他幾個品種，其中口之津32號和黃果柑中最低；沃柑果皮中綠原酸含量最高，達(dá)100.860 μg/g，顯著高于其他幾個品種，黃果柑中僅有22.174 9 μg/g。

表5 不同柑橘品種果皮中酚酸含量 單位：μg/g 鮮重

2.4 柑橘果實中類黃酮含量的測定

2.4.1 柑橘果肉中類黃酮含量的測定

由表6可知，在8種果肉中均檢測到了蘆丁，均未檢測到新橙皮苷和柚皮素；本試驗測定的8個品種果肉中類黃酮以蘆丁和柚皮苷為主，柚皮苷含量最高的為沃柑，達(dá)14.407 3 μg/g?？谥?2號、金諾和春見果肉中并未檢測到柚皮苷。金諾果肉中蘆丁含量最高，為18.799 1 μg/g，最低為口之津32號，僅1.295 0 μg/g。

表6 不同柑橘品種果肉中類黃酮含量 單位：μg/g 鮮重

2.4.2 柑橘果皮中類黃酮含量的測定

表7為不同柑橘品種果皮中類黃酮含量，在果皮中均檢測到了蘆丁、柚皮苷和新橙皮苷，而柚皮素僅在沃柑和黃果柑中檢測出來，沃柑果皮中柚皮素含量顯著高于黃果柑；與果肉中蘆丁含量相似，金諾果皮中蘆丁的含量顯著高于其他7個柑橘品種，達(dá)165.904 4 μg/g。橙類果皮中蘆丁含量顯著低于其他6種雜柑，塔羅科血橙、晚紅血橙、奈維林娜臍橙的含量依次為5.439 9、30.492 5、10.062 5 μg/g；沃柑果皮中柚皮苷和新橙皮苷的含量最高，分別為19.792 9、13.931 4 μg/g，顯著高于其他品種。

2.5 柑橘酚類物質(zhì)的聚類分析

對柑橘果肉和果皮中的酚類物質(zhì)進(jìn)行維度的偏好性分析，結(jié)果如圖3所示。圖3-a為果肉中酚類物質(zhì)維度的偏好性分析，由圖3-a可知在柑橘果肉中，阿魏酸、蘆丁和沒食子酸與金諾的距離較近，表明金諾與其他柑橘品種相比，果肉中阿魏酸、沒食子酸和蘆丁的含量最高；其他7個柑橘品種沒有明顯的分布規(guī)律。

圖3-b為果皮中酚類物質(zhì)維度的偏好性分析，由圖3-b可知，咖啡酸、阿魏酸、對羥基苯甲酸與口之津32號的距離最近，口之津32號果皮中3種酚酸的含量顯著高于其他柑橘品種，說明這3種酚酸與口之津32號聯(lián)系較緊密；新橙皮苷、柚皮苷、沒食子酸、綠原酸與沃柑的距離較近，表明這4種酚類物質(zhì)在沃柑果皮中含量最高；與其他5個雜柑品種相比，橙類與芥子酸的距離較近，且含量顯著高于雜柑，雜柑與蘆丁的距離較近，含量顯著高于橙類(表6)。

3 討論

圖3 果實酚類物質(zhì)維度的偏好性分析
Fig.3 Preference analysis of phenols in fruits

不同柑橘品種果實中酚酸以咖啡酸和綠原酸為主，果肉中阿魏酸只在4個品種中檢測出來，而另有研究發(fā)現(xiàn)柑橘中主要以咖啡酸和阿魏酸為主[20,22-23]，產(chǎn)生的差異可能與品種之間的差異、成熟度、產(chǎn)地等有關(guān)；類黃酮以蘆丁和柚皮苷為主，該結(jié)果與李利改等[24]的研究結(jié)果基本一致；果肉中所測10種酚類的總量由高到低依次為：沃柑、塔羅科血橙、金諾、奈維林娜臍橙、黃果柑、晚紅血橙、口之津32號、春見。果皮中以口之津32號最高，其次依次為金諾、沃柑、春見、晚紅血橙、黃果柑、奈維林娜臍橙、塔羅科血橙；不同柑橘品種果肉中的酚類物質(zhì)含量低于果皮，果皮中蘆丁含量是果肉的1.15～90.39倍，這與SCORDINO等[25]的研究結(jié)果基本一致。本研究的8個柑橘品種果皮和果肉中蘆丁含量均在金諾中最高，且在8個柑橘品種果肉中，金諾阿魏酸、沒食子酸和蘆丁的含量最高；在8個柑橘品種果皮中，口之津32號咖啡酸、阿魏酸、對羥基苯甲酸的含量最高；新橙皮苷、柚皮苷、沒食子酸和綠原酸在沃柑果皮中最多；橙類可能與芥子酸存在一定的關(guān)系，即芥子酸可能在橙類中的含量較高，同時雜柑中蘆丁含量顯著高于橙類，因此雜柑可能與蘆丁有一定的關(guān)系，即蘆丁在雜柑中的含量較高。目前，對雜柑和橙類分類研究的相關(guān)報道還較少，今后可繼續(xù)對雜柑和橙類中其他酚類物質(zhì)以及不同品種進(jìn)行研究，分析其規(guī)律，對探討不同柑橘品種果實間酚類物質(zhì)含量的差異以及提高果實的綜合利用價值具有重要意義。

本研究用高效液相色譜法對柑橘進(jìn)行測定時的優(yōu)點有：樣品提取方法簡單，無需繁瑣的提取步驟，如較多研究報道，樣品預(yù)處理需要振蕩提取[19-20]或者旋轉(zhuǎn)蒸干[20,26]，本方法能更快速簡便地對樣品進(jìn)行有效提取，但提取后還有其他酚類物質(zhì)有待進(jìn)一步確定其成分；已有研究報道，在臍橙果肉和果皮中均未檢測到柚皮苷、新橙皮苷、柚皮素3種黃烷酮類酚類物質(zhì)[19]，而本試驗檢測限低于0.03 μg/g，能在果肉和果皮中檢測到這3種黃烷酮。同時本方法重復(fù)性好，精密度高，加樣回收率高，因此能有效檢測柑橘中的酚類物質(zhì)。