王耀煒 王惠芳 程旭東

西安醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院呼吸科（西安710038）

阻塞性睡眠呼吸暫停低通氣綜合征（obstruc?tive sleepapnea?hypopnea syndrome，OSAHS）以睡眠過(guò)程中反復(fù)發(fā)生的低通氣及呼吸暫停導(dǎo)致低氧血癥、睡眠片段化為其特征。目前越來(lái)越多的證據(jù)表明OSAHS可引起患者不同程度的認(rèn)知功能障礙，甚至與阿爾茨海默病（AD）的發(fā)生、發(fā)展相關(guān)［1］。髓樣細(xì)胞表達(dá)的觸發(fā)受體2（triggeringreceptor ex?pressed on myeloid cells，TREM2）是近年來(lái)發(fā)現(xiàn)的一個(gè)免疫球蛋白超家族受體，主要表達(dá)于巨噬細(xì)胞、中性粒細(xì)胞、小膠質(zhì)細(xì)胞等［2］，最新的研究表明TREM2 mRNA在認(rèn)知障礙、AD患者中高表達(dá)，可能為AD的診斷提供新的生物學(xué)方法［3］。目前對(duì)于TREM2是否在OSAHS合并認(rèn)知障礙患者肺泡巨噬細(xì)胞上表達(dá)，以及其表達(dá)變化是否與認(rèn)知障礙相關(guān)的研究較少。本研究通過(guò)觀察TREM2 mRNA及其蛋白在OSAHS合并認(rèn)知障礙患者AM上的表達(dá)規(guī)律，初步探討其作用機(jī)制，為將來(lái)防治OSAHS患者發(fā)生認(rèn)知障礙奠定基礎(chǔ)。

1 對(duì)象與方法

1.1 研究對(duì)象選擇2014年9月至2016年5月就診于西安醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院呼吸內(nèi)科并行多導(dǎo)睡眠圖檢測(cè)確診為OSAHS患者79例，其中男61例，女18例，年齡42～74歲，平均（58.15±5.43）歲，均符合中華醫(yī)學(xué)會(huì)呼吸病學(xué)分會(huì)睡眠呼吸疾病學(xué)組制定的睡眠呼吸暫停綜合征診斷標(biāo)準(zhǔn)［4］。所有受試者均無(wú)慢性阻塞性肺疾病、肺源性心臟病、急慢性心腦血管病、嚴(yán)重的軀體疾病或精神類疾病、慢性酒精中毒、嚴(yán)重肝病、肝性腦病、低血糖反應(yīng)、糖尿病酮癥等與認(rèn)知障礙相關(guān)的疾病。所有入選病例均由我科受培訓(xùn)醫(yī)務(wù)人員應(yīng)用MMSE量表評(píng)估，包括定向、記憶、計(jì)算、語(yǔ)言、視空間、運(yùn)用、注意等方面，總分30分。并按照評(píng)估結(jié)果將入選病例隨機(jī)分為以下4組。A組（無(wú)認(rèn)知障礙組MMSE≥27）；B組（輕度認(rèn)知障礙21≤MMSE＜27）；C組（中度認(rèn)知障礙10≤MMSE＜20）；D組（重度認(rèn)知障礙MMSE ＜9）。4組入選病例患者年齡、性別比例、受教育程度、吸煙均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，所有入選者均知情同意，并經(jīng)過(guò)我院倫理委員會(huì)通過(guò)。

1.2 AM的分離、提取、純化分別對(duì)A～D 4組患者行支氣管肺泡灌洗術(shù)，2%利多卡因經(jīng)滴鼻麻醉后，使用纖支鏡前端楔入患者右肺中葉支氣管開口處，注入37℃、0.9%生理鹽水100 mL，負(fù)壓回吸收量大于總量的40%為回收成功。使用Ficoll（GE醫(yī)療生物科學(xué)中國(guó)有限公司，中國(guó)）密度梯度離心和貼壁法原代分離BALF中肺泡巨噬細(xì)胞，經(jīng)過(guò)臺(tái)盼藍(lán)和吞噬試驗(yàn)證實(shí)活性純度＞99%后，在37℃、5%CO2的條件下培養(yǎng)12 h后備用。

1.3 RT?PCR測(cè)定肺泡巨噬細(xì)胞TREM2 mRNA表達(dá)按Trizol試劑說(shuō)明書分別提取各組AM總RNA，分別于核酸蛋白質(zhì)分析儀上測(cè)定各組各自總RNA的質(zhì)量和純度。各取3 μg總RNA經(jīng)M?MLV逆轉(zhuǎn)錄酶逆轉(zhuǎn)錄，獲得cDNA后進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR引物設(shè)計(jì)如下：TREM2上游引物：5′?TG?GTCAGAGGGCTGGACTGT?3′，下游引物5′?TCCTG?GCTGGACTTAAGCTGTAG?3′，產(chǎn)物大小 120 bp；β?actin 上游引物：5′?AGCGGTTCCGATGCCCT?3′，下游引物5′?AGAGGTCTTTACGGATGTCAACG?3′，產(chǎn)物大小123 bp。TREM2 PCR反應(yīng)條件為94℃2 min，然后94℃變性15 s，60℃退火30 s，72℃延伸30 s，共40個(gè)循環(huán)。β?actin的PCR條件為：94 ℃3 min，94℃變性15 s，60℃退火30 s，72℃延伸15 s，30個(gè)循環(huán)。RT?PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳，用Biometra全自動(dòng)凝膠成像及分析系統(tǒng)分析，結(jié)果以光密度（OD）值表示TREM2 mRNA的相對(duì)表達(dá)量。

1.4 流式細(xì)胞儀檢測(cè)肺泡巨噬細(xì)胞TREM2蛋白的表達(dá)以上分離提取的四組患者AM分別進(jìn)行流式細(xì)胞儀（BD公司）檢測(cè)，CellQuest軟件分析。

1.5 磁共振彌散張量成像測(cè)定四組患者額葉白質(zhì)FA值先行頭顱MR檢查，之后再行DTI。參數(shù)：MR為 27.3 ms的 TE，1 794 ms的TR，1 100 ms的TI，240 mm的FOV，0.5 mm的間距，1.0 mm的厚度等；DTI為704個(gè)采集層，16個(gè)序列方向，軸面掃描層與AC?PC線平行。圖像采用the Functool image analysis（AW4.4 workstation工作站）處理，通過(guò)圓形感興趣區(qū)（ROI）分析各組額葉白質(zhì)FA 值［5］。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，資料分析采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件中的單因素方差分析，各組間多重比較采用最小顯著差法。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組AM中TREM2 mRNA、TREM2蛋白表達(dá)TREM2 mRNA及蛋白表達(dá)量A組＜B組＜C組＜D組，各組兩兩比較均P＜0.05，見表1。

2.2 各組患者額葉白質(zhì)FA值比較A～D組患者額葉白質(zhì)FA值分別為（0.713±0.062）、（0.698±0.053）、（0.437 ± 0.051）、（0.238 ± 0.032），除 A、B組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義外，其余各組兩兩比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

2.3 TREM2 mRNA、TREM2蛋白表達(dá)水平與額葉白質(zhì)FA值相關(guān)性分析TREM2 mRNA及蛋白表達(dá)均與額葉白質(zhì)FA值呈負(fù)相關(guān)（r分別為-0.583、-0.472，均P＜0.05）。

3 討論

OSAHS是一種常見的睡眠呼吸障礙疾病，常伴有間歇性低氧血癥、夜間覺醒、白天嗜睡及認(rèn)知功能障礙等癥狀和體征。國(guó)內(nèi)外的研究均發(fā)現(xiàn)OSAHS可影響人心理狀況改變，并可引起認(rèn)知功能受損［6］。MORISSON等［7］利用腦電圖監(jiān)測(cè)OSAHS患者發(fā)現(xiàn)覺醒狀態(tài)下整個(gè)皮質(zhì)腦電圖頻率均減慢，且與夜間氧飽和度下降正相關(guān)，提示OSAHS認(rèn)知功能損害具有廣泛性，同時(shí)發(fā)現(xiàn)OSAHS患者存在不同類型、不同程度的認(rèn)知障礙，這與其病情程度存在一定相關(guān)性［8］。一些研究調(diào)查了OSAHS患者與認(rèn)知功能障礙的關(guān)系，提示重度患者比輕中度患者更容易出現(xiàn)認(rèn)知功能障礙［9］。TREM2在多種髓系細(xì)胞中表達(dá)，包括單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、小膠質(zhì)細(xì)胞等中［10］。既往研究中發(fā)現(xiàn)，多囊性脂膜樣骨發(fā)育不良并硬化性白質(zhì)腦病是一種TREM2基因突變的疾病，其主要臨床特點(diǎn)是癡呆和全身多發(fā)性骨囊腫［11］。此外，臨床研究中發(fā)現(xiàn)，在AD患者中存在TREM2基因的突變，TREM2基因突變會(huì)使人患晚發(fā)性AD的風(fēng)險(xiǎn)高3倍，TREM2與人類認(rèn)知障礙密切相關(guān)［12］。TREM2是否與OSAHS患者認(rèn)知障礙的發(fā)生相關(guān)是本實(shí)驗(yàn)研究重點(diǎn)。

表1 肺泡巨噬細(xì)胞TREM2 mRNA及蛋白表達(dá)比較Tab.1 Comparison of TREM2 mRNA and protein expression in alveolar macrophages ±s

表1 肺泡巨噬細(xì)胞TREM2 mRNA及蛋白表達(dá)比較Tab.1 Comparison of TREM2 mRNA and protein expression in alveolar macrophages ±s

注：與A組比較，*P＜0.05；與B組比較，#P＜0.05；與C組比較，△P＜0.05

組別A組B組C組D組例數(shù)21 23 20 15 TREM2 mRNA 5.38±0.26 7.82±0.38*9.38±0.63*＃12.57 ± 0.65*?！鱐REM2蛋白50.35±3.58 68.72±5.46*80.53±7.42*＃96.48 ± 8.35*＃△

腦白質(zhì)是大腦內(nèi)部神經(jīng)纖維聚集的地方，既往對(duì)認(rèn)知功能的研究多集中于腦灰質(zhì)，近年越來(lái)越多的研究認(rèn)為腦白質(zhì)同認(rèn)知功能也存在著密切聯(lián)系。彌散張量成像（DTI）技術(shù)是近年來(lái)發(fā)展成熟的一種無(wú)創(chuàng)、自動(dòng)、高效地評(píng)估腦白質(zhì)纖維完整性的方法。DTI可定量評(píng)估白質(zhì)纖維束受損程度，F(xiàn)A值主要反映白質(zhì)纖維束髓鞘完整性、致密性及平行性，F(xiàn)A值減低是白質(zhì)纖維變性的敏感指標(biāo)［13］。對(duì)不同年齡人群腦白質(zhì)DTI的研究發(fā)現(xiàn)：隨年齡增長(zhǎng)FA值下降，提示腦白質(zhì)構(gòu)成變化及完整性降低，且認(rèn)知功能下降［14］。本實(shí)驗(yàn)采用DTI技術(shù)檢測(cè)OSAHS合并認(rèn)知障礙患者額葉白質(zhì)FA值，并分析其與TREM2 mRNA和蛋白表達(dá)的關(guān)系，初步探討TREM2在OSAHS患者發(fā)生認(rèn)知障礙過(guò)程中的作用，為將來(lái)此類疾病的防治提供依據(jù)。

巨噬細(xì)胞是天然免疫系統(tǒng)的重要組分，分布在人體的各個(gè)組織，在肺里稱“肺泡巨噬細(xì)胞”，在神經(jīng)系統(tǒng)稱“小膠質(zhì)細(xì)胞”，在骨組織稱“破骨細(xì)胞”。既往關(guān)于TREM2與認(rèn)知障礙的研究多集中于破骨細(xì)胞與小膠質(zhì)細(xì)胞。PALONEVA等［15］的研究結(jié)果表明，TREM2具有抑制小膠質(zhì)細(xì)胞和破骨細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞因子表達(dá)的作用，從而使中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)和骨骼組織中的炎癥反應(yīng)受到抑制。SHARMA等［16］研究發(fā)現(xiàn)在OSAHS患者中AM的功能障礙變得更加嚴(yán)重，可能增加對(duì)疾病的易感性，所以本研究選擇提取、純化各組患者AM并檢測(cè)其TREM2的表達(dá)水平。

本研究結(jié)果顯示OSAHS合并認(rèn)知障礙各組患者隨著認(rèn)知障礙的加重，TREM2 mRNA及蛋白的表達(dá)量明顯增加，重度認(rèn)知障礙組的表達(dá)量達(dá)到最高，各組組間比較均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。與之相反，各組患者額葉白質(zhì)FA值隨著認(rèn)知障礙加重明顯減小，相關(guān)分析顯示TREM2 mRNA及蛋白表達(dá)與額葉白質(zhì)FA值均呈負(fù)相關(guān)（r分別為?0.583、?0.472，P＜ 0.05）。從而初步推斷TREM2的表達(dá)在OSAHS合并認(rèn)知障礙患者疾病發(fā)生、發(fā)展的過(guò)程中可能起重要作用，具體TREM2如何參與認(rèn)知障礙過(guò)程中的調(diào)節(jié)機(jī)制目前尚不清楚。近期在有關(guān)TREM2與AD的研究中發(fā)現(xiàn)，AD患者外周血和AD模型動(dòng)物腦內(nèi)TREM2水平顯著升高［17］，TREM2在腦中具有抗炎作用，其是通過(guò)調(diào)節(jié)小膠質(zhì)細(xì)胞炎癥反應(yīng)在AD發(fā)病過(guò)程中起重要作用。當(dāng)機(jī)體受到內(nèi)外因素?fù)p害時(shí)，炎癥因子會(huì)激活小膠質(zhì)細(xì)胞膜上受體TREM2，其通過(guò)TREM2/DAP12信號(hào)通路，上調(diào)IL?10、IL?4等抑炎因子的表達(dá)，從而減少炎癥反應(yīng)［18］，減輕對(duì)神經(jīng)細(xì)胞的損傷，從而減輕AD疾病的進(jìn)展。當(dāng)炎癥刺激因子表達(dá)過(guò)度時(shí)TREM2調(diào)節(jié)能力下降，促炎因子增多，增加對(duì)大腦的損害，TREM2可能是AD患者認(rèn)知障礙發(fā)展過(guò)程中的保護(hù)性受體。從而我們初步推測(cè)OSAHS患者由于長(zhǎng)期存在低氧血癥、高碳酸血癥等刺激因素可能導(dǎo)致慢性炎癥反應(yīng)，炎癥因子激活A(yù)M表達(dá)TREM2，TREM2起初通過(guò)表達(dá)增加來(lái)抑制炎癥反應(yīng)，抑制炎癥因子對(duì)神經(jīng)細(xì)胞的損害，減緩認(rèn)知障礙發(fā)生速度，當(dāng)OSAHS患者病情逐漸加重得不到及時(shí)治療時(shí)炎癥因子刺激作用增加，TREM2調(diào)節(jié)作用下降，炎癥因子對(duì)神經(jīng)細(xì)胞的損害持續(xù)加重最終導(dǎo)致認(rèn)知障礙逐漸加重。至于TREM2調(diào)節(jié)OSAHS患者發(fā)生認(rèn)知障礙過(guò)程中的具體分子生物學(xué)機(jī)制仍需進(jìn)一步研究。

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