鄧紫婷，周?chē)?guó)慶，李榮亨

（1.重慶醫(yī)科大學(xué)附屬康復(fù)醫(yī)院，重慶 400050；2.重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院中西醫(yī)結(jié)合科，重慶 400016）

骨關(guān)節(jié)炎（Osteoarthritis，OA）是以關(guān)節(jié)軟骨破壞為特點(diǎn)的退行性關(guān)節(jié)疾病，是在機(jī)械性和生物性因素作用下，破壞了關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞、細(xì)胞外基質(zhì)和軟骨下骨的正常合成與降解耦聯(lián)的結(jié)果，多發(fā)生在中老年人，是致殘的高發(fā)性疾病［1］。關(guān)節(jié)軟骨的生長(zhǎng)及基質(zhì)的合成與生長(zhǎng)因子密切相關(guān)，轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1（TGF-β1）是其中之一。TGF-β1是一種多功能細(xì)胞因子，廣泛參與哺乳動(dòng)物的各組病理生理過(guò)程，研究發(fā)現(xiàn)，TGF-β1具有促進(jìn)骨和軟骨細(xì)胞增殖、分化和細(xì)胞外基質(zhì)合成的作用。體外研究發(fā)現(xiàn)TGF-β1可促進(jìn)II型膠原的合成，誘導(dǎo)間充質(zhì)細(xì)胞向軟骨細(xì)胞分化并形成軟骨組織。

復(fù)元膠囊是治療骨關(guān)節(jié)炎的中藥復(fù)方制劑，治療OA療效確切，不良反應(yīng)少。前期研究顯示，復(fù)元膠囊通過(guò)調(diào)節(jié)細(xì)胞因子、基質(zhì)金屬蛋白酶（MMPS）及其抑制劑（TIMPS）和生長(zhǎng)因子之間的平衡［2-4］，減少Ⅱ型膠原和蛋白多糖的降解［5］，促進(jìn)細(xì)胞增殖，減少細(xì)胞凋亡，從而起到防治OA作用［6-7］。本研究通過(guò)建立大鼠膝關(guān)節(jié)骨性關(guān)節(jié)炎模型，觀察不同濃度的復(fù)元膠囊對(duì)關(guān)節(jié)軟骨中TGF-β1表達(dá)的影響，探討復(fù)元膠囊能否通過(guò)上調(diào)TGF-β1表達(dá)，促進(jìn)細(xì)胞外基質(zhì)的合成，從而達(dá)到防治OA的作用。

1 材 料

動(dòng)物。雄性8周齡SD大鼠60只，體質(zhì)量（200±10）g，由重慶醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)SYSK2002007。

藥品。復(fù)元膠囊為重慶希爾安藥業(yè)公司生產(chǎn)（渝衛(wèi)2002［42-33］），由黃芪、人參、川芎、丹參、淫羊藿、鹿角膠、肉蓯蓉、骨碎補(bǔ)、枸杞子等組成，每粒0.41g，每1g含生藥3g；抗骨增生膠囊為江蘇康緣股份有限公司生產(chǎn)（生產(chǎn)批號(hào)110402）。

主要試劑。TGF-β1多克隆抗體購(gòu)于北京鼎國(guó)昌盛技術(shù)有限公司，SABC試劑盒及DAB顯色劑購(gòu)于武漢博士德生物工程有限公司，軟骨總提取試劑盒、cDNA第一鏈合成試劑盒及2X Es Taq MasterMix（含染料）均來(lái)自于北京康為世紀(jì)，TGF-β1及內(nèi)參GAPDH引物由TakaRa公司合成。

儀器。BX50型光學(xué)顯微鏡來(lái)自日本OLYMPUS公司，DNA engine PT-200 PCR儀和BIO-RAD凝膠成像儀來(lái)自美國(guó)BIORAD公司。

2 方 法

分組及造模。60只大鼠隨機(jī)分為正常組，模型組，抗骨增生膠囊組，復(fù)元膠囊低、中、高劑量組各10只。Hulth法［8］建立OA模型，用10%水合氯醛按照0.3mL/100g腹腔注射麻醉大鼠，在無(wú)菌條件下切斷大鼠右膝關(guān)節(jié)內(nèi)側(cè)副韌帶，完整切除內(nèi)側(cè)半月板及剪斷前后交叉韌帶逐層縫合，無(wú)菌包扎。術(shù)后給予肌注青霉素抗感染，共7天。術(shù)后1周開(kāi)始每天驅(qū)趕大鼠跑步30min，共驅(qū)趕8周。正常組大鼠不給予任何處理。

給藥。依據(jù)Meeh-Rubner公式計(jì)算大鼠的等效給藥劑量，復(fù)元膠囊低、中、高劑量組分別給予復(fù)元膠囊371.65、743.30、2229.90mg/（kg·d），抗骨增生膠囊組給予抗骨增生膠囊557.00mg/（kg·d），均配置成3mL溶液，正常組和模型組給予生理鹽水灌胃，于術(shù)后第2周開(kāi)始，每天灌胃1次，共8周。

大體觀察及光鏡觀察關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞及細(xì)胞外基質(zhì)。于治療后第8周處死各組大鼠共60只，觀察并記錄關(guān)節(jié)囊、滑膜、關(guān)節(jié)軟骨及關(guān)節(jié)液的一般情況，并于光學(xué)顯微鏡下觀察膝關(guān)節(jié)關(guān)節(jié)軟骨的情況，按Pelletier-JP標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行評(píng)分。取脛骨平臺(tái)全層軟骨連同軟骨下骨標(biāo)本，將其中一部分放置在-80℃冰箱保存，一部分在4%多聚甲醛溶液中固定24h，10%EDTA脫鈣15天，常規(guī)石蠟包埋，切片H E染色觀察軟骨組織結(jié)構(gòu)、細(xì)胞數(shù)量和潮線(xiàn)的完整性。依據(jù)Mankin’s法［9］評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行評(píng)分，0級(jí)為正常，1級(jí)為表層破壞，2級(jí)為血管翳及表層破壞，3級(jí)為淺層裂隙形成，4級(jí)為局限性深達(dá)骨質(zhì)的裂隙，5級(jí)為大面積深達(dá)骨質(zhì)的軟骨缺如，6級(jí)為負(fù)重區(qū)軟骨全部丟失。

免疫組化法檢測(cè)關(guān)節(jié)軟骨中TGF-β1的蛋白表達(dá)。切片脫蠟至水，3%H2O2室溫15min滅活內(nèi)源性過(guò)氧化物酶。沖洗后PBS浸泡5min，胰蛋白酶消化液修復(fù)抗原活性20min，正常山羊血清封閉，滴加1∶50的稀釋兔抗大鼠TGF-β1多克隆抗體，4℃孵育過(guò)夜。PBS沖洗5min，3次。滴加生物素標(biāo)記的二抗（武漢博士德），37℃孵育30min，PBS沖洗5min，3次。滴加SABC-HRP（武漢博士德），37℃孵育30min。PBS沖洗5min，3次。二甲苯聯(lián)苯胺（DAB）室溫下顯色至滿(mǎn)意，自來(lái)水終止反應(yīng)。蘇木素復(fù)染3min，洗去多余染液，鹽酸酒精分化2s，碳酸鋰復(fù)染1min，酒精梯度脫水后封片，顯微鏡下觀察。圖像分析：每個(gè)標(biāo)本取5張切片，每張切片OLYMPUS BX50顯微鏡下放大200倍，隨機(jī)取5個(gè)視野，采用Image-Pro Plus圖像分析軟件測(cè)定陽(yáng)性染色平均累積光密度（IOD）。

關(guān)節(jié)軟骨總RNA提取和半定量RT-PCR檢測(cè)TGF-β1的mRNA表達(dá)。取損傷區(qū)軟骨30mg在液氮中研磨成粉末，然后用TRIzon提取總RNA，紫外分光光度計(jì)檢測(cè)樣品吸光度（A），A260/A280為1.8～2.0。每組取1μL總RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA（dNTP Mix，2.5mM Each 4u、Primer Mix 2μL、RNA Template 2μL、5×RT Buffer 4μL、DTT，0.1M、HiFi-MmLV，200U/μL，1μL、RNasefree Water 5μL）。取cDNA1ul進(jìn)行PCR擴(kuò)增。其中TGF-β1引物序列為F（5'ATGGTGGACCGCAACAAC3'），R（5'GAGCACTGAAGCGAAAGC3'）；反應(yīng)條件為變性94℃30s，退火58.6℃30s，延伸72℃30s，共30個(gè)循環(huán)，72℃延伸5min。GAPDH引物序列為F（5' GTGCTGAGTATGTCGTGGAGTCT3'）；R（5'GTGGAAGAATGGGAGTTGCTGT3'）；反應(yīng)條件為變性94℃30s，退火58.5℃30s，延伸72℃45s，共30個(gè)循環(huán)，72℃延伸5min。擴(kuò)增完畢后取5ul產(chǎn)物于含50ul/LGoldViewTM核酸染料的1.5%瓊脂糖凝膠中電泳，用BRORAD凝膠圖像分析軟件檢測(cè)各組目的基因及內(nèi)參的光密度值。

用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)量資料以（±s）表示、用t檢驗(yàn)。

3 結(jié) 果

各組大鼠一般情況。造膜過(guò)程中動(dòng)物無(wú)死亡，術(shù)后無(wú)感染，健康狀況良好，術(shù)后模型組及治療組，局部刺激有疼痛反應(yīng)，患肢收縮痙攣，后肢跛行明顯，蹬地力量減弱，伴有關(guān)節(jié)不穩(wěn)，有異?；顒?dòng)度，1周后消失，8周后關(guān)節(jié)畸形腫大，正常組關(guān)節(jié)外部結(jié)構(gòu)正常，無(wú)腫脹，活動(dòng)自如。

大體形態(tài)觀察見(jiàn)表1。正常組關(guān)節(jié)面平整光滑，呈淡藍(lán)色，色澤明亮，無(wú)裂紋及軟化，滑膜無(wú)增生，關(guān)節(jié)液清涼透明，模型組病理改變明顯，軟骨面糜爛，顏色灰暗，失去光澤，軟骨邊緣增生明顯，多數(shù)標(biāo)本可見(jiàn)大小不等的潰瘍，并深達(dá)骨質(zhì)，軟骨下骨暴露，滑膜不同程度增生粘連，關(guān)節(jié)液增多、混濁。復(fù)原膠囊高、中劑量組及抗骨增生組軟骨面稍粗糙，顏色淡黃，軟骨邊緣有增生，部分有裂紋及小潰瘍出現(xiàn)，滑膜可見(jiàn)少許增生，關(guān)節(jié)液略增多。

評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)：0分為關(guān)節(jié)面透明光整，色澤正常；1分為關(guān)節(jié)面粗糙，有裂隙，色澤灰暗；2分為關(guān)節(jié)面糜爛，軟骨缺損深達(dá)軟骨表層和中層；3分為關(guān)節(jié)面潰瘍形成，缺損深達(dá)軟骨深層；4分為軟骨剝脫，軟骨下骨暴露。各組膝關(guān)節(jié)軟骨退化評(píng)分見(jiàn)表1。

表1 各組膝關(guān)節(jié)軟骨退變程度評(píng)分比較 （只）

HE染色后觀察軟骨組織見(jiàn)表2。正常組軟骨組織軟骨表層光滑平整，細(xì)胞排列整齊，基質(zhì)染色均勻，潮線(xiàn)清晰；模型組軟骨組織層變薄，表層有裂隙，細(xì)胞數(shù)目變少，排列紊亂，潮線(xiàn)嚴(yán)重?cái)嗔涯：?；抗骨增生膠囊組軟骨表面欠光整，細(xì)胞層數(shù)明顯增多，排列稍紊亂，潮線(xiàn)少許斷裂；復(fù)元膠囊低劑量組表層裂隙形成，細(xì)胞數(shù)目減少，排列紊亂，隱窩出現(xiàn)空泡樣改變，潮線(xiàn)紊亂；復(fù)元中劑量組染色均勻，細(xì)胞層增生，細(xì)胞數(shù)目增多；復(fù)元高劑量組表層尚且光滑平整，細(xì)胞有明顯增生，中深層有少量細(xì)胞簇聚，可見(jiàn)雙重潮線(xiàn)。

免疫組化法檢測(cè)軟骨組織中TGF-β1表達(dá)見(jiàn)表2。正常組軟骨在表層見(jiàn)少許陽(yáng)性細(xì)胞；模型組及其余各組軟骨組織見(jiàn)不同程度著色，軟骨細(xì)胞的胞漿及胞核中可見(jiàn)黃色顆粒著色；復(fù)元膠囊中劑量組和高劑量組與模型組比較，TGF-β1的表達(dá)有明顯增加，尤其以復(fù)元膠囊高劑量組最為顯著。

表2 8周各組大鼠關(guān)節(jié)軟骨Mankin評(píng)分及軟骨組織中TGF-β1的表達(dá) （IOD，±s）

表2 8周各組大鼠關(guān)節(jié)軟骨Mankin評(píng)分及軟骨組織中TGF-β1的表達(dá) （IOD，±s）

注：與正常組比較，*P＜0.01；與模型組比較，△P＜0.01；與模型組比較，#P＜0.05；與抗骨增生組比較，□P＜0.05。

組別 只 Mankin評(píng)分 TGF-β1正常組 10 0.34±0.06 0.63±0.017模型組 10 7.3±0.45* 0.34±0.017*抗骨增生膠囊組 10 3.9±0.73△ 0.68±0.038#復(fù)元膠囊低劑量組 10 5.4±0.48△ 0.42±0.031#復(fù)元膠囊中劑量組 10 3.8±0.6△ 0.94±0.018△復(fù)元膠囊高劑量組 10 2.1±0.53△□ 1.31±0.043△□

RT-PCR法測(cè)定軟骨組織中TGF-β1的mRNA表達(dá)見(jiàn)圖2。各組軟骨組織提取的RNA經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄和擴(kuò)增后，電泳顯示強(qiáng)弱不等的熒光。經(jīng)圖像軟件分析結(jié)果顯示，模型組TGF-β1表達(dá)顯著降低，與其余各組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）；與抗骨增生膠囊組比，復(fù)元膠囊高劑量組TGF-β1的mRNA的表達(dá)量增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），而復(fù)元膠囊低劑量組和中劑量組表達(dá)無(wú)明顯改變，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

4 討 論

骨關(guān)節(jié)炎以其高發(fā)病率及高致殘率而受到醫(yī)學(xué)界的廣泛關(guān)注，且其療效不顯著也成為了國(guó)內(nèi)外研究的熱點(diǎn)。骨關(guān)節(jié)炎的主要臨床表現(xiàn)為關(guān)節(jié)疼痛、關(guān)節(jié)畸形及功能障礙，目前治療OA，主要包括基礎(chǔ)治療、藥物治療、傳統(tǒng)治療、物理治療、關(guān)節(jié)腔注藥和沖洗、外科手術(shù)，以及軟骨移植、基因治療、生物治療、軟骨膜和骨膜移植等新療法。外科手術(shù)治療痛苦大且費(fèi)用高昂，新療法尚處起步階段，有待于進(jìn)一步研究。為提高廣大骨關(guān)節(jié)炎患者的生活質(zhì)量，尋找一種經(jīng)濟(jì)、安全、易行的治療方法是非常重要的［10-11］。

骨關(guān)節(jié)炎屬中醫(yī)“骨痹”范疇。病因病機(jī)為氣血不足，肝腎虧虛，風(fēng)寒濕侵入骨髓，痹阻經(jīng)絡(luò)導(dǎo)致筋骨失養(yǎng)。證屬肝腎虧虛，氣滯血瘀。治以補(bǔ)腎壯骨，益氣活血為主。復(fù)元膠囊中人參、黃芪益氣活血，具有抗疲勞、抗缺氧、增強(qiáng)機(jī)體適應(yīng)能力的作用。川芎、丹參行氣活血，其有效成分川芎嗪和阿魏酸有改善微循環(huán)的作用，且有研究表明川芎嗪能有效防治骨關(guān)節(jié)炎。鹿茸、淫羊藿補(bǔ)腎壯陽(yáng)、強(qiáng)筋健骨，有調(diào)節(jié)免疫和促性腺激素樣作用，且性激素有促進(jìn)軟骨細(xì)胞增殖的作用［12］。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，TGF-β1在正常組有適量表達(dá)，而在模型組TGF-β1表達(dá)降低；與模型組比較，復(fù)元膠囊各組和抗骨增生膠囊組TGF-β1的表達(dá)有明顯增加，以復(fù)元高劑量組增加最為顯著，提示復(fù)元膠囊高劑量組療效優(yōu)于抗骨增生膠囊組。

通過(guò)測(cè)定軟骨組織中TGF-β1的表達(dá)水平證實(shí)，復(fù)元膠囊能夠通過(guò)上調(diào)TGF-β1的表達(dá)，促進(jìn)軟骨細(xì)胞和細(xì)胞外基質(zhì)的增生，從而減輕關(guān)節(jié)軟骨的損傷，延緩OA的發(fā)展進(jìn)程。

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