陳 明 王 恒 趙鴻賓 余躍生 段 萍

(1.黔南民族醫(yī)學(xué)高等?？茖W(xué)校，貴州 都勻 558000； 2. 黔南州食品藥品檢驗所，貴州 都勻 558000)

烏蕨(Stenoloma chusanum (L)Ching)系鱗始蕨科烏蕨屬植物,廣泛分布于我國長江以南許多省份[1]，為貴州省苗族習(xí)用藥材，苗語稱其為空麻昌、豆麻昌[2][3]。該藥主要以野生為主，資源十分豐富，也可進(jìn)行人工種植。民間長期用其治療外傷感染。據(jù)文獻(xiàn)報道,該藥的化學(xué)成分包括黃酮類、酚類、揮發(fā)油、甾體和多糖等[4][5]，有明顯的抗菌活性,能用于多種炎癥的治療[6]，但目前還沒有關(guān)于該藥抗炎作用機(jī)制方面的研究報導(dǎo)，對其藥理作用的研究也不夠全面、深入。本研究旨在驗證烏蕨提取物的抗炎作用，并探究其作用機(jī)制，在比較常用抗炎藥物阿司匹林與烏蕨提取物的抗炎作用后，我們可以初步肯定苗藥烏蕨在抗炎方面的臨床應(yīng)用價值。

1 材料

1.1 動物 選用昆明種小鼠100只，標(biāo)準(zhǔn)為：健康，體質(zhì)量在18～22g范圍內(nèi)，雌雄各半。由貴州醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心提供，合格證號：SCXK(黔)2012-0001。

1.2 藥材與試劑 烏蕨原植物采自貴州省都勻市馬鞍山林區(qū)，經(jīng)黔南民族醫(yī)學(xué)高等?？茖W(xué)校中藥教研室魏學(xué)軍教授鑒定為鱗始蕨科烏蕨屬植物(Stenoloma chusanum (L)Ching)。二甲苯、阿司匹林購自國藥集團(tuán)化學(xué)試劑公司；伊文斯藍(lán)，批號：DJ1405WL；環(huán)氧化酶(COX-2)，批號：201508；前列腺素(PGE2)，批號：201508；腫瘤壞死因子α(TNF-α)，批號：201508；一氧化氮(NO)，批號：201508；試劑盒購自北京鼎國昌盛生物科技有限責(zé)任公司(From Sigma)。其余試劑均為市售分析純。

1.3 儀器和設(shè)備 酶標(biāo)儀，芬蘭Lab-systems公司；TDL-4ZB型臺式低速離心機(jī)，湖南星科科學(xué)儀器廠；BS223型電子天平，北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司；Agilent Cary 100型分光光度計,美國安捷倫公司。

2 方法

2.1 烏蕨提取物的制備 取干燥的烏蕨藥材(地上部分)粉碎過篩，稱取1000g，用15倍量65%乙醇，80℃水浴回流提取3次，1h/次，合并提取液，減壓濃縮至無醇味，轉(zhuǎn)移至分液漏斗中，加石油醚萃取5次，將母液減壓蒸發(fā)除去石油醚，然后加入等體積乙酸乙酯，萃取4～6次，合并乙酸乙酯萃取液，將其減壓濃縮，回收乙酸乙酯，得到乙酸乙酯萃取物，減壓干燥；稱取干燥的乙酸乙酯萃取物適量，加少量水溶解，加適量吐溫80，配制成以浸膏計濃度為4.42mg.mL-1溶液,供實驗使用。

2.2 阿司匹林對照液的制備 取阿司匹林0.5011g，置100mL量瓶中，加純化水適量溶解并稀釋至刻度，搖勻，即得。

2.3 烏厥提取物對小鼠耳廓腫脹的影響[7]取健康昆明種小鼠50只，按體重隨機(jī)分為5組，每組10只，雌雄各半。具體分組情況如下：阿司匹林對照組(100mg·kg-1)、烏蕨提取物低劑量組(22.1mg·kg-1)、烏蕨提取物中劑量組(44.2mg·kg-1)、烏蕨提取物高劑量組(88.4mg·kg-1)、正常對照組(生理鹽水20mL·kg-1)。連續(xù)給藥7d，每天ig給藥1次。在最后一次給藥后1h，將小鼠右耳耳廓均勻涂抹二甲苯(0.05mL/只，正、反面均需涂抹)致炎，左耳不涂作為對照，30min后摘除眼球，取血保存?zhèn)溆?。隨即采用頸椎脫臼法將小鼠處死，使用打孔器在小鼠左、右耳廓相同部位打下直徑9mm圓耳片，立即準(zhǔn)確稱取耳片質(zhì)量。右耳與左耳重量之差即為腫脹度。腫脹抑制率計算方法如下：

腫脹抑制率(%)=

2.4 烏厥提取物對小鼠腹腔毛細(xì)血管通透性的影響[8]：冰乙酸的主要作用是增加小鼠腹腔毛細(xì)血管通透性，使靜脈內(nèi)的伊文思藍(lán)滲出，測定腹腔洗液的OD值可反映毛細(xì)血管通透情況。

按前文2.3方法進(jìn)行分組及給藥。最后一次給藥1h后，采用尾靜脈注射法注射1%伊文斯藍(lán)(20mL·kg-1)，隨后腹腔注射0.7%冰乙酸(20mL·kg-1)，間隔30min后摘除小鼠眼球，取血，保存?zhèn)溆?。完成上述操作后，立即采用頸椎脫臼法處死小鼠，剪開腹腔將6mL生理鹽水注入腹腔內(nèi)，進(jìn)行腹腔充分清洗，吸出腹腔洗液，離心10min(1500rpm)。取離心后的上清液在590nm處測定吸光度(OD值)。

2.5 血清制備及指標(biāo)分析 各小鼠血液靜置30min后，3000rpm，離心半徑為5cm，離心15min，取血清。按檢測要求分裝，置冰箱保存(-20℃)備用。根據(jù)COX-2、PGE2、TNF-α、NO說明書測定并計算。

3 結(jié)果

3.1 烏蕨提取物對二甲苯所致小鼠耳廓腫脹的影響 小鼠右耳涂抹二甲苯后，耳腫脹明顯。阿司匹林對照組和烏蕨提取物中劑量組對二甲苯致小鼠耳腫脹有明顯的抑制作用，與正常對照組比較差異顯著(P<0.05)。實驗結(jié)果見表1。

表1 烏蕨提取物對二甲苯所致小鼠耳廓腫脹度的影響

注：與對照組比較1)P<0.05,2)P<0.01

本研究結(jié)果顯示，阿司匹林組及烏蕨提取物中劑量組能夠極顯著的降低COX-2、PGE2、TNF-α、NO水平(P<0.01)；烏蕨提取物高劑量組能夠顯著降低COX-2和TNF-α水平(P<0.05或P<0.01)。實驗結(jié)果見表2。

表2 烏蕨提取物對二甲苯致耳腫脹小鼠血清COX-2、PGE2、 TNF-α、NO的影響

注：與對照組比較1)P<0.05,2)P<0.01

表3 烏蕨提取物對小鼠腹腔毛細(xì)血管通透性的影響

注：與對照組比較1)P<0.05,2)P<0.01

3.2 烏蕨提取物對小鼠腹腔毛細(xì)血管通透性的影響：實驗結(jié)果表明，阿司匹林組及烏蕨提取物各劑量組OD值與對照組比較均有顯著性差異(P<0.01)。阿司匹林及烏蕨提取物均可顯著抑制小鼠腹腔毛細(xì)血管通透性。見表3。

同時研究結(jié)果提示，阿司匹林組及烏蕨提取物中劑量組能夠顯著地降低COX-2、PGE2、TNF-α、NO水平 (P<0.05或P<0.01)；烏蕨提取物高劑量組能夠顯著降低COX-2和TNF-α水平(P<0.01)；烏蕨提取物低劑量組能夠顯著降低COX-2水平(P<0.01)。烏蕨提取物中劑量組在降低血清COX-2、PGE2、TNF-α、NO水平方面與阿司匹林相似。實驗結(jié)果見表4。

4 討論

炎癥是機(jī)體對損傷因子所發(fā)生的復(fù)雜的防御反應(yīng)，炎癥反應(yīng)時血管系統(tǒng)的一系列改變是其防御作用的關(guān)鍵，也是炎癥過程的中心環(huán)節(jié)。在此過程中炎癥部位的充血和滲出，有利于稀釋毒素、殺傷和包圍損傷因子，達(dá)到消滅致病因子的目的。與炎癥反應(yīng)相關(guān)的細(xì)胞因子眾多,主要包括白細(xì)胞介素、趨化因子、生長因子、干擾素、腫瘤壞死因子超家族、集落刺激因子等。細(xì)胞因子具有多效性、重疊性、拮抗性、協(xié)同性等多種生理特性,參與多種生理功能調(diào)節(jié)[9-10]，其發(fā)揮作用的途徑主要包括旁分泌、自分泌或內(nèi)分泌等方式 。炎癥反應(yīng)及其相關(guān)的細(xì)胞因子對機(jī)體在產(chǎn)生保護(hù)作用的同時也有可能產(chǎn)生傷害，比如可直接或間接損傷機(jī)體的細(xì)胞和組織，嚴(yán)重的炎癥反應(yīng)還可危及生命。

表4 烏蕨提取物對腹腔毛細(xì)血管通透性實驗小鼠血清COX-2、PGE2、 TNF-α、NO的影響

注：與對照組比較1)P<0.05,2)P<0.01

本實驗通過二甲苯致小鼠耳腫脹模型，發(fā)現(xiàn)烏蕨提取物(中劑量組)對二甲苯致小鼠耳腫脹有明顯的抑制作用，與正常對照組比較差異顯著(P<0.05)。同時發(fā)現(xiàn)烏蕨提取物(中劑量組)能夠極顯著地降低耳腫脹模型小鼠血清COX-2、PGE2、TNF-α、NO水平(P<0.01)；烏蕨提取物(高劑量組)能夠顯著降低耳腫脹模型小鼠血清COX-2和TNF-α水平(P<0.05或P<0.01)。

通過冰乙酸致小鼠腹腔毛細(xì)血管通透性增高模型，發(fā)現(xiàn)烏蕨提取物各劑量組OD值與對照組比較均有顯著性差異(P<0.01)。同時發(fā)現(xiàn)烏蕨提取物(中劑量組)能夠顯著地降低腹腔毛細(xì)血管通透性增高模型小鼠血清COX-2、PGE2、TNF-α、NO水平 (P<0.05或P<0.01)；烏蕨提取物(高劑量組)能夠顯著降低小鼠血清COX-2和TNF-α水平(P<0.01)；烏蕨提取物(低劑量組)能夠顯著降低小鼠血清COX-2水平(P<0.01)。

綜上所述，烏蕨提取物對二甲苯所致小鼠耳廓腫脹有明顯抑制作用，能夠顯著降低小鼠腹腔毛細(xì)血管通透性。烏蕨提取物在一定劑量下能顯著抑制小鼠血清中COX-2、PGE2、TNF-α、NO等炎癥因子濃度，烏蕨提取物(中劑量組)在降低血清COX-2、PGE2、TNF-α、NO水平方面與阿司匹林相似。推測烏蕨提取物的作用機(jī)制可能與減少炎癥因子的合成與釋放有關(guān)。對于實驗中發(fā)現(xiàn)的烏蕨提取物中劑量組抗炎作用強(qiáng)于高劑量組這一現(xiàn)象，在中草藥作用機(jī)制的研究中經(jīng)常出現(xiàn)，其原因有待進(jìn)一步研究。

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