李天雪，胡玉濤*，陳如洋，褚朝森

(1.江蘇聯(lián)合職業(yè)技術(shù)學(xué)院 連云港中醫(yī)藥分院，江蘇 連云港 222007；2.連云港市藥物研發(fā)共性技術(shù)中心，江蘇 連云港 222007)

小分子酪氨酸激酶抑制劑阿帕替尼，靶向地作用于血管內(nèi)皮生長因子受體2(VEGFR-2)，可抑制腫瘤血管生成，從而抑制多種腫瘤細(xì)胞的生長，對非小細(xì)胞性肺癌、肝癌、胃癌、結(jié)直腸癌和乳腺癌等多種腫瘤有很好的臨床藥理作用[1-4]。紫杉醇是一種四環(huán)二萜類細(xì)胞毒性抗腫瘤藥，其在腫瘤細(xì)胞分裂時能夠與細(xì)胞微管蛋白結(jié)合，使細(xì)胞有絲分裂受到阻礙，進(jìn)而阻止腫瘤細(xì)胞的生長[5- 6]。紫杉醇在臨床上常用于治療卵巢癌、前列腺癌、乳腺癌、非小細(xì)胞肺癌以及結(jié)腸癌等。相關(guān)研究表明，對于惡性腫瘤的治療，單藥治療遠(yuǎn)不如聯(lián)合用藥的療效顯著，關(guān)于阿帕替尼和紫杉醇聯(lián)合用藥的臨床研究已有相關(guān)報道[7]，因此同時對血漿中這兩種藥物濃度的測定顯得尤為重要。

目前國內(nèi)外文獻(xiàn)多采用高效液相色譜法(HPLC)、高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法(HPLC-MS/MS)檢測阿帕替尼或紫杉醇的單一血藥濃度[8-12]，鮮有同時測定兩者血藥濃度的研究，且HPLC法檢測的靈敏度并不理想，而HPLC-MS/MS法的檢測時間長。近年來，因快速、精確性高、選擇性強(qiáng)，超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜(UPLC-MS/MS)法在醫(yī)藥領(lǐng)域已成為多成分微量分析的首選方法[13-15]，因此，本文采用固相萃取法處理血漿樣品，建立了同時定量測定大鼠血漿中阿帕替尼和紫杉醇的UPLC-MS/MS法，并運(yùn)用此法對大鼠體內(nèi)阿帕替尼和紫杉醇的血藥濃度進(jìn)行了監(jiān)測。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與材料

安捷倫1290 LC-6460Q三重四極桿串聯(lián)質(zhì)譜儀(美國安捷倫科技公司)，配四元低壓梯度泵和MassHunter B03.01工作站，Eppendorf 5427 R低溫高速離心機(jī)(德國Eppendorf有限公司)，Mettler ME155DU 型十萬分之一電子分析天平(梅特勒-托利多儀器有限公司)。

對照品阿帕替尼、紫杉醇和內(nèi)標(biāo)物(IS)替諾福韋，均由南通經(jīng)緯生物科技有限公司提供；甲磺酸阿帕替尼片由江蘇恒瑞醫(yī)藥股份有限公司提供，紫杉醇注射液由深圳萬樂藥業(yè)股份有限公司生產(chǎn)；Supelco Discovery DSC-18 固相萃取柱(編號SP10620B，規(guī)格1 mL，美國Supelco有限公司)；甲醇(Sigma公司)、乙腈(Merck公司)為色譜純；超純水經(jīng)過Milli-Q系統(tǒng)純化制備；其余試劑均為分析純，購自國藥集團(tuán)。

1.2 實(shí)驗(yàn)動物

雄性SD大鼠8只，SPF級，體質(zhì)量(230±20) g，由南京青龍山動物繁殖場提供，合格證號SCXK(蘇)2017-0001。

1.3 儀器條件

色譜柱為Agilent Zorbax Eclipse Plus C18柱(100 mm×2.1 mm，1.8 μm)；流動相為0.1%甲酸溶液(A)-乙腈(B)，梯度洗脫：0～0.8 min，10%B；0.8～2.5 min，10%～55%B；2.5～5 min，55%～75%B；系統(tǒng)平衡3 min；體積流量0.4 mL/min；柱溫40 ℃；進(jìn)樣量3 μL。

質(zhì)譜采用ESI+源，MRM模式；駐留時間為50 ms；檢測電壓：3.5 kV；離子源溫度：120 ℃；錐孔電壓：220 V；脫溶劑溫度：300 ℃；脫溶劑氣體(N2)體積流量：7 L/min；鞘氣流速：11 L/min；Delta EMV：+200 V。阿帕替尼、紫杉醇和替諾福韋檢測離子的質(zhì)核比(碰撞電壓)分別為m/z487->372(29 eV)；m/z854.5->286(17 eV)和m/z288->176(25 eV)。

1.4 標(biāo)準(zhǔn)溶液的制備

分別精密稱取阿帕替尼和紫杉醇，以甲醇溶解并定容，配成質(zhì)量濃度均為0.2 g/L的對照品儲備液；分別取適量對照品儲備液于同一容量瓶中，以甲醇稀釋，配制得系列混合對照品標(biāo)準(zhǔn)工作液。同法用10%甲醇配制內(nèi)標(biāo)替諾福韋儲備液(0.2 g/L)，臨用前以10%甲醇稀釋成質(zhì)量濃度為8 mg/L的IS工作液。上述各對照品溶液于4 ℃下冷藏保存，備用。

1.5 血漿樣品處理

平衡Discovery DSC-18固相萃取柱：先加入2 mL甲醇沖洗，后加入2 mL 0.1%甲酸水淋洗。取血漿樣品100 μL，加入5 μL IS(8 mg/L)，渦旋30 s混勻，取混合溶液裝載進(jìn)活化后的固相萃取柱，加入1 mL 0.1%甲酸水淋洗小柱，后加入1 mL甲醇-水-甲酸(5∶95∶0.1)淋洗，再加2 mL甲醇-乙腈(90∶10)洗脫，取洗脫液用40 ℃氮?dú)獯蹈?，加?00 μL 80%甲醇水溶液復(fù)溶，渦旋振蕩30 s，4 ℃下12 000 r/min離心5 min，進(jìn)樣3 μL分析。

2 結(jié)果與討論

2.1 實(shí)驗(yàn)條件考察

2.1.1樣品處理優(yōu)化實(shí)驗(yàn)考察了液液萃取、固相萃取、蛋白沉淀3種樣品處理方法。結(jié)果表明，液液萃取法的選擇性好，但提取回收率的重復(fù)性差(RSD為 6.2%～18.4%，n=5)；蛋白沉淀法處理血漿樣品簡單快速，但基質(zhì)效應(yīng)明顯；固相萃取法的提取回收率好且基質(zhì)效應(yīng)不明顯，因此本文選擇固相萃取法對血漿樣品進(jìn)行處理。在萃取小柱上，采用0.1%甲酸水溶液淋洗樣品，可促進(jìn)兩種待測物和蛋白質(zhì)解離；由于紫杉醇的極性小，預(yù)實(shí)驗(yàn)中僅以甲醇洗脫，紫杉醇的提取回收率(R)為78.3%～84.2%，在洗脫液中加入10%乙腈，以增強(qiáng)洗脫力，提高提取回收率，此時紫杉醇的R≥86.2%。

2.1.2流動相優(yōu)化考察了甲醇、乙腈和水、0.1%甲酸-水、5 mmol/L乙酸銨-水、5 mmol/L乙酸銨(含0.1%甲酸)-水構(gòu)成的流動相系統(tǒng)的分離效果。以甲醇-水/酸水為流動相時兩成分的出峰時間延后，峰形較寬，分離度較差；而乙腈洗脫能力強(qiáng)、粘度小，故選擇乙腈為有機(jī)相。在流動相中加入純水會使信號峰出現(xiàn)拖尾和前展的現(xiàn)象；加入乙酸銨提高了質(zhì)譜離子化效率，但出峰時間較其他體系明顯延后，靈敏度顯著降低；為避免峰拖尾，并增加檢測靈敏度，最終選擇流動相為0.1%甲酸溶液-乙腈。另外，通過調(diào)整梯度洗脫條件，可改變被分析物的保留時間，從而使待測物與共流出物分離以減小基質(zhì)效應(yīng)，血漿中含大量內(nèi)源性雜質(zhì)，設(shè)置55%～75%乙腈的梯度，可沖洗色譜柱，抑制連續(xù)進(jìn)樣產(chǎn)生的交叉污染。

圖1 阿帕替尼和紫杉醇的LLOQ(A)和血液樣品(B)的MRM譜圖Fig.1 Typical chromatograms of blank samples spiked with afatinib and paclitaxel at LLOQ(A) and a real sample(B)

2.1.3其他條件優(yōu)化樣品固相萃取后，使用80%甲醇水溶液復(fù)溶，此時進(jìn)樣體積過大會有較強(qiáng)的基質(zhì)效應(yīng)，對進(jìn)樣體積(2～10 μL)進(jìn)行優(yōu)化，當(dāng)進(jìn)樣 ≥4 μL時，基質(zhì)效應(yīng)誤差超過±15%，進(jìn)樣2 μL時峰形欠佳且質(zhì)譜信號響應(yīng)低于進(jìn)樣3 μL，故選用3 μL進(jìn)樣。實(shí)驗(yàn)又考察了Zorbax SB C18(50 mm×2.1 mm，1.8 μm)、Zorbax Eclipse Plus C18(50 mm×2.1 mm，1.8 μm)和Zorbax Eclipse Plus C18(100 mm×2.1 mm，1.8 μm) 3種色譜柱的分離效果，結(jié)果表明，柱長對于分析效果至關(guān)重要，兩種長度為50 mm柱的駐留時間短(≤1.22 min)、柱壓低，但峰形較寬，靈敏度較低，長度為100 mm柱的峰形對稱且分離度較好?？紤]到分離效果比分析速度更重要，選用Agilent Zorbax Eclipse Plus C18柱(100 mm×2.1 mm，1.8 μm)進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)?？疾炝酥鶞?25、30、35、40、45 ℃)的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，待測物的駐留時間隨柱溫上升而減少，當(dāng)柱溫高于40 ℃，駐留時間變化不大且高溫會降低色譜柱的使用壽命，故選擇柱溫40 ℃。殘留效應(yīng)實(shí)驗(yàn)考察了最佳線性范圍的上限，高濃度進(jìn)樣后立即進(jìn)樣空白血漿樣品，以空白樣品中測定的峰面積 ≤20%LLOQ的峰面積為殘留合格，同時結(jié)合定量方法的推廣實(shí)用性，選擇線性關(guān)系中最高濃度為1 500 μg/L，殘留效應(yīng) ≤15.7%。

2.2 方法學(xué)考察

2.2.1專屬性取6份不同來源的空白大鼠血漿，配制加入含對照品的標(biāo)準(zhǔn)血漿樣品后，取大鼠用藥1 h后的血漿，分別進(jìn)行UPLC-MS/MS分析，記錄質(zhì)譜圖?？瞻准訕?biāo)樣品和用藥血漿樣品的典型譜圖見圖1。阿帕替尼和紫杉醇的分離度≥7，血漿中的內(nèi)源性物質(zhì)不干擾檢測且峰形良好。

2.2.2線性關(guān)系與最低定量下限(LLOQ)分別精密量取系列混合對照品工作液適量，加入100 μL 空白血漿中，制成7個濃度梯度的混合標(biāo)準(zhǔn)血漿樣品，含阿帕替尼和紫杉醇質(zhì)量濃度均為0.5、1、5、20、100、500、1 500 μg/L。血漿處理后，在優(yōu)化條件下進(jìn)行測定，以血漿中化合物的質(zhì)量濃度(x，μg/L)為橫坐標(biāo)，被分析物與內(nèi)標(biāo)的峰面積比(y)為縱坐標(biāo)，進(jìn)行線性回歸(權(quán)重因子為1/X2)。以信噪比S/N≥10，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)≤ 20%，準(zhǔn)確度的誤差值在±20%內(nèi)的最低濃度為LLOQ。結(jié)果表明，阿帕替尼和紫杉醇在相應(yīng)濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好(r2≥0.998，n=5)，線性方程分別為y=0.054x+0.032 2和y=0.078x+0.006 2，LLOQ均為0.5 μg/L，該UPLC-MS/MS法適用于血漿中阿帕替尼和紫杉醇的微量分析。

2.2.3精密度與準(zhǔn)確度按照樣品處理方法配制，用空白大鼠血漿和標(biāo)準(zhǔn)溶液配制低、中、高3個質(zhì)量濃度QC樣品各5份，連續(xù)測定3 d，用線性關(guān)系計算相應(yīng)的濃度，分別考察日內(nèi)和日間精密度與準(zhǔn)確度。阿帕替尼和紫杉醇的3個濃度QC樣品的日內(nèi)和日間精密度RSD≤8.4%，準(zhǔn)確度為92.5%～107.1%，結(jié)果均在合格范圍內(nèi)，表明精密度和準(zhǔn)確度良好(表1)。

表1 精密度、準(zhǔn)確度、提取回收率及基質(zhì)效應(yīng)結(jié)果Table 1 The results of the precision,accuracy,extraction recovery and matrix effect

2.2.4稀釋效應(yīng)配制2 000、5 000 μg/L質(zhì)量濃度的混合標(biāo)準(zhǔn)血漿樣品各10份，均分為4組，分別用空白血漿稀釋5倍(400、1 000 μg/L)和10倍(200、500 μg/L)，對血漿處理后的稀釋樣品進(jìn)行分析，計算精密度與準(zhǔn)確度以評估稀釋效應(yīng)。阿帕替尼和紫杉醇血漿樣品經(jīng)5倍稀釋后，各稀釋樣品的RSD值為0.6%～1.4%，準(zhǔn)確度為96.8%～97.8%；10倍稀釋時，RSD值均小于1.5%，準(zhǔn)確度為96.5%～98.0%。結(jié)果表明，血漿樣品濃度超過標(biāo)準(zhǔn)曲線范圍時，可用空白血漿稀釋后測定相應(yīng)的濃度。

2.2.5提取回收率與基質(zhì)效應(yīng)3個濃度的QC樣品各平行制備5份，記錄峰面積為A?？瞻籽獫{處理后添加對照品工作液，制備QC同濃度的溶液，記錄峰面積為B。同質(zhì)量濃度的對照品工作液，直接分析記錄峰面積為C。則內(nèi)源性物質(zhì)引起的基質(zhì)效應(yīng)表示為B/C×100%，提取回收率為A/B×100%，結(jié)果見表1。由表1可見，其提取回收率為86.2%～95.1%，基質(zhì)效應(yīng)在100%±15%范圍內(nèi)，分析結(jié)果滿足阿帕替尼和紫杉醇血漿樣品測定的要求。

2.2.6穩(wěn)定性取3個濃度的QC血漿樣品各5份，分別于室溫下儲存24 h，4 ℃進(jìn)樣器中放置12 h，-20 ℃下放置7 d，反復(fù)凍融3次(-20 ℃到20 ℃)，采用凍融樣品與新鮮制備的樣品對照獲得準(zhǔn)確度，準(zhǔn)確度誤差均符合要求(±15%)，結(jié)果表明該方法的穩(wěn)定性良好。

2.3 實(shí)際樣品的測定

大鼠適應(yīng)環(huán)境飼養(yǎng)5 d，維持溫度22～25 ℃，濕度55%±10%，實(shí)驗(yàn)前禁食12 h。靜脈注射紫杉醇1.0 mg/kg(5%葡萄糖注射液配液)和灌胃阿帕替尼2.0 mg/kg聯(lián)合用藥，分別在給藥前和給藥后0.167、0.33、0.5、0.75、1、1.5、3、8、12、24 h時間點(diǎn)進(jìn)行大鼠眼眶取血約0.3 mL，血液樣品收集在肝素鈉離心管中，室溫下6 000 r/min離心10 min，制得血漿樣品。按上述UPLC-MS/MS法進(jìn)樣分析，得阿帕替尼和紫杉醇的血藥濃度～時間曲線(見圖2)。阿帕替尼在(3.00±0.56) h達(dá)到ρmax(112.52±24.13) μg/L，AUC0-t值為(1 240.61±240.24) μg·h/L，24 h時濃度仍高于LLOQ，表明在體內(nèi)的消除率較??；紫杉醇的AUC0-t值為(3 236.77±723.35) μg·h/L。實(shí)際樣品測定結(jié)果表明，該法可用于大鼠血漿中阿帕替尼和紫杉醇的同時分析。受實(shí)驗(yàn)條件約束，阿帕替尼和紫杉醇在人體的血藥濃度監(jiān)測實(shí)驗(yàn)仍需進(jìn)一步研究。

3 結(jié) 論

本文首次建立了同時測定大鼠血漿中阿帕替尼和紫杉醇血藥濃度的UPLC-MS/MS方法，該法精確靈敏、選擇性強(qiáng)、專屬性好，對阿帕替尼和紫杉醇的臨床血藥濃度監(jiān)測及藥動學(xué)研究提供了參考，具有分析方法借鑒意義。

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