郭思言，丁 濤，吳 斌，張 峰，馮 峰，劉 蕓，柳 菡，張曉燕，陳 磊，鄧曉軍，伊雄海，楊功俊*，王雪婷

(1.中國(guó)藥科大學(xué) 藥學(xué)院，江蘇 南京 211198；2.江蘇出入境檢驗(yàn)檢疫局 動(dòng)植物與食品檢測(cè)中心，江蘇 南京 210001；3.中國(guó)檢驗(yàn)檢疫科學(xué)研究院，北京 102600；4.上海出入境檢驗(yàn)檢疫局，上海 200135)

麥盧卡蜂蜜享有新西蘭“國(guó)寶”級(jí)美譽(yù)，是蜜蜂采集當(dāng)?shù)刂参稃湵R卡(Leptospermunscoparium)釀成。與一般蜂蜜的抗菌活性不同，其獨(dú)特的非過氧化抗菌活性(Non-peroxide antibacterial activity，NPA)[1-2]，可促進(jìn)傷口愈合[3]、治療足部潰瘍[4-5]等，具有特有的藥用價(jià)值[6]。我國(guó)的進(jìn)口蜂蜜中麥盧卡蜂蜜占比越來越大[7]，但目前國(guó)內(nèi)對(duì)于麥盧卡蜂蜜的研究較少，這對(duì)于進(jìn)口麥盧卡蜂蜜的監(jiān)督監(jiān)管造成了很大影響。麥盧卡蜂蜜根據(jù)其抗菌活性高低進(jìn)行質(zhì)量評(píng)價(jià)和分級(jí)[8]，不同級(jí)別的麥盧卡蜂蜜價(jià)格差異巨大。常用丙醛酮(MGO)或二羥基丙酮(DHA)含量評(píng)價(jià)麥盧卡蜜的級(jí)別，但兩者均可人為摻假，非麥盧卡蜂蜜的特征物質(zhì)受溫度影響較大[9-11]。Kato等[12-13]發(fā)現(xiàn)Leoptosperin和丁香酸甲酯是麥盧卡蜂蜜的特征化合物，且其含量與抗菌活性相關(guān)。但麥盧卡蜂蜜判定標(biāo)準(zhǔn)缺乏統(tǒng)一，導(dǎo)致蜂蜜市場(chǎng)魚龍混雜。為了建立一種基于科學(xué)、準(zhǔn)確可靠的麥盧卡蜂蜜鑒定標(biāo)準(zhǔn)，新西蘭初級(jí)產(chǎn)業(yè)部(Ministry for Primary Industries，MPI)在2017年4月公布了能同時(shí)區(qū)分出單花種麥盧卡蜜、多花種麥盧卡蜜和非麥盧卡蜂蜜的鑒定標(biāo)準(zhǔn)[14]，最終確定2′-甲氧基苯乙酮(2′-MAP)、2-甲氧基苯甲酸(2-MBA)、3-苯基乳酸(3-PA)和4-羥基苯基乳酸(4-HPA)作為判定麥盧卡蜂蜜的指標(biāo)。

MPI規(guī)定單花種麥盧卡蜜的判定標(biāo)準(zhǔn)為蜂蜜中2′-MAP、2-MBA和4-HPA的含量大于或等于1 mg/kg，3-PA的含量大于或等于400 mg/kg；多花種麥盧卡蜜為2′-MAP、2-MBA和4-HPA的含量大于或等于1 mg/kg，3-PA的含量大于或等于20 mg/kg并且小于400 mg/kg。因特征化合物具有熒光吸收，Jessie等[15]運(yùn)用高效液相色譜/熒光檢測(cè)器對(duì)特征化合物進(jìn)行了檢測(cè)，但未能確證。新西蘭官方提供的特征化合物測(cè)定方法標(biāo)準(zhǔn)操作程序?yàn)椤癉etermination of Four Chemical Characterisation Compounds in Honey by Liquid Chromatography Tandem Mass Spectrometry(LC-MS/MS),Chemistry Laboratory Method,MPI Technical - Paper No:2017/30”,該SOP于2017年10月4日生效[16]。MPI提供的方法中采用氯吡脲為內(nèi)標(biāo)物質(zhì)，氯吡脲的掃描模式為負(fù)離子模式，以其同時(shí)作為在正離子掃描模式下待測(cè)化合物的內(nèi)標(biāo)物缺乏一定科學(xué)性。鑒于蜂蜜基質(zhì)中富含的糖類及一些極性成分會(huì)對(duì)化合物測(cè)定造成干擾，本文對(duì)MPI方法進(jìn)行改良，以便捷安全的SPE結(jié)合高靈敏度和準(zhǔn)確性的質(zhì)譜檢測(cè)器為分析手段，分別對(duì)采集于新西蘭不同產(chǎn)地的麥盧卡蜂蜜、卡奴卡蜂蜜、瑞瓦瑞瓦蜂蜜、卡瑪希蜂蜜、圣誕花蜂蜜、瑞塔蜂蜜、塔瓦瑞蜂蜜等12個(gè)品種共114個(gè)巢蜜樣本和來自新西蘭、中國(guó)、澳大利亞、馬來西亞4個(gè)國(guó)家的50個(gè)商品化蜂蜜進(jìn)行了驗(yàn)證。根據(jù)蜂蜜品種信息結(jié)合鑒定指標(biāo)要求，對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)結(jié)果進(jìn)行了綜合分析，為麥盧卡蜂蜜判定及單花種和多花種麥盧卡蜂蜜的區(qū)分提供了參考。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器、試劑與材料

液相色譜-Q trap 4500三重四極桿質(zhì)譜儀，配ESI源(美國(guó)AB SCIEX公司)；Smart-N15VF 超純水系統(tǒng)(中國(guó)力康公司)；XW-80A旋渦混合器(上海青浦瀘西儀器廠)；固相萃取裝置(美國(guó)Supelco公司)；Oasis HLB固相萃取柱(3 mL，60 mg，美國(guó)Waters公司)；0.45 μm尼龍微孔濾膜(天津市津騰實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司)。

2′-甲氧基苯乙酮(純度>97%)、2-甲氧基苯甲酸(純度>98%)、4-羥基苯基乳酸(純度>98%)均購(gòu)自東京化成工業(yè)株式會(huì)社；3-苯基乳酸(純度>98%，英國(guó)Alfa Aesar公司)；乙腈(色譜純，德國(guó)Merck公司)；甲酸(色譜純，美國(guó)Tedia公司)；巢蜜來源于新西蘭各地區(qū)，商品蜜購(gòu)自各大超市。

分別稱取適量2′-MAP、2-MBA和4-HPA標(biāo)準(zhǔn)品用1%甲酸乙腈溶液定容配成1.0 g/L的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液。稱取適量3-PA標(biāo)準(zhǔn)品配成10.0 g/L的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，于冰箱中4 ℃避光貯存；移取各標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液根據(jù)需要用乙腈-甲酸-水(體積比10∶1∶90)逐級(jí)稀釋成標(biāo)準(zhǔn)工作液，現(xiàn)用現(xiàn)配。

1.2 樣品前處理

稱取1 g(精確至0.01 g)均質(zhì)蜂蜜樣品至50 mL帶蓋聚四氟乙烯離心管中，用適量1%甲酸水溶液渦旋溶解，轉(zhuǎn)移溶液至50 mL容量瓶并定容(實(shí)際分析時(shí)根據(jù)蜂蜜中特征化合物含量稀釋至標(biāo)曲線性范圍內(nèi))。準(zhǔn)確移取10 mL蜂蜜溶液加入經(jīng)3 mL甲醇活化以及6 mL水平衡后的Oasis HLB 固相萃取柱，用3 mL水淋洗，2 mL乙腈洗脫，收集洗脫液并用乙腈-甲酸-水(10∶1∶90)定容至10 mL，取1 mL過0.45 μm尼龍微孔濾膜至進(jìn)樣瓶，上機(jī)檢測(cè)。

1.3 液質(zhì)聯(lián)用測(cè)定條件

1.3.1色譜條件色譜柱：Thermo Hypersil Gold C18(50 mm×2.1 mm，1.9 μm)色譜柱；流動(dòng)相：A為0.1%(體積分?jǐn)?shù))甲酸水溶液，B為0.1%(體積分?jǐn)?shù))甲酸乙腈溶液；流速：0.2 mL/min。梯度洗脫程序：0～0.75 min，5%B；0.75～2 min，5%～15%B；2～4 min， 15%～70% B；4～6 min，70%～98% B；6～6.5 min，98%B；6.5～7 min， 98%～5%B；7～10 min，5%B。柱溫：(40±2) ℃；進(jìn)樣體積：2 μL。

1.3.2質(zhì)譜條件掃描方式：3-PA和4-HPA采用電噴霧負(fù)離子掃描模式(ESI-)；2′-MAP和2-MBA采用電噴霧正離子掃描模式(ESI+)；檢測(cè)方式：多重反應(yīng)監(jiān)測(cè)模式(MRM)；正離子：毛細(xì)管溫度500 ℃，氣簾氣30 psi，霧化氣50 psi，輔助加熱氣50 psi，離子化電壓5 500 V，入口電壓10 V；負(fù)離子：毛細(xì)管溫度500 ℃，氣簾氣30 psi，霧化氣50 psi，輔助加熱氣50 psi，離子化電壓-4 500 V，入口電壓-10 V；4種化合物的質(zhì)譜檢測(cè)參數(shù)見表 1。

表1 4種特征化合物的質(zhì)譜檢測(cè)參數(shù)Table 1 MS/MS parameters of four chemical characteristic compounds

*quantitative ion

2 結(jié)果與討論

2.1 前處理?xiàng)l件的優(yōu)化

圖1 4種特征化合物的化學(xué)結(jié)構(gòu)式Fig.1 Chemical structures of four characteristic compounds

圖2 不同稀釋溶劑對(duì)特征化合物回收率的影響Fig.2 Effect of different diluted solvents on recoveries of characteristic compounds

圖3 4種化合物混合標(biāo)準(zhǔn)溶液的全離子掃描色譜圖Fig.3 Chromatogram of four analytes standard mixtures

蜂蜜基質(zhì)含有大量糖類及部分強(qiáng)極性組分。糖類在洗脫時(shí)易對(duì)色譜柱造成損害，其余雜質(zhì)的存在可對(duì)特征化合物的離子化產(chǎn)生不同程度的抑制效應(yīng)。4種特征化合物均為中等極性(化學(xué)結(jié)構(gòu)式如圖1所示)，因此采用親脂的二乙烯基苯和親水的N-乙烯基吡咯烷酮聚合的HLB固相萃取柱對(duì)蜂蜜溶液進(jìn)行凈化，能很好地去除蜂蜜中的大量糖類化合物。

同時(shí)分析比較了水、1%甲酸水溶液、10%乙腈-1%甲酸水溶液分別作為稀釋溶劑時(shí)，在麥盧卡蜂蜜中加入5 mg/kg的2′-MAP、2-MBA和4-HPA及200 mg/kg的3-PA過柱后的回收率。由圖 2可知，稀釋溶劑為10%乙腈-1%甲酸水溶液時(shí)，4-HPA的回收率低于50%，其余3種特征化合物的回收率為50%～70%，稀釋溶劑為1%甲酸水溶液時(shí)，特征化合物的平均回收率均較高,因此，選擇1%甲酸水溶液作為稀釋溶劑。

2.2 色譜與質(zhì)譜條件的優(yōu)化

比較了乙腈-水、乙腈-0.1%甲酸水溶液、甲醇-0.1%甲酸水溶液、0.1%甲酸乙腈-0.1%甲酸水溶液作為流動(dòng)相對(duì)4種化合物峰形和保留時(shí)間的影響。結(jié)果表明，水相中加入適量甲酸有助于化合物峰形對(duì)稱，加快出峰時(shí)間。有機(jī)相使用乙腈可使峰形尖銳，加入適量甲酸則可使兩相混合時(shí)，流動(dòng)相體系的pH值不受梯度洗脫波動(dòng)，保證出峰時(shí)間的穩(wěn)定。因此，選擇用0.1%甲酸乙腈-0.1%甲酸水溶液作為流動(dòng)相。

質(zhì)譜分析采用最為常用的電噴霧電離源(ESI)，分別取1 mg/L的2′-MAP、2-MBA、4-HPA和10 mg/L的 3-PA標(biāo)準(zhǔn)溶液各1 mL采用流動(dòng)注射泵進(jìn)樣，分別在正、負(fù)兩種掃描模式下對(duì)目標(biāo)化合物進(jìn)行一級(jí)質(zhì)譜全掃描。優(yōu)化入口電壓、去簇電壓、碰撞能量等質(zhì)譜條件參數(shù)后，對(duì)4種特征化合物分別選取信號(hào)強(qiáng)度最強(qiáng)、次強(qiáng)且干擾較少的兩個(gè)離子碎片作為定量和定性離子。在優(yōu)化條件下1 mg/L的2′-MAP、2-MBA、4-HPA和10 mg/L 的3-PA混合標(biāo)準(zhǔn)溶液的總離子流色譜圖見圖3。

2.3 基質(zhì)效應(yīng)的評(píng)價(jià)

考察了空白蜂蜜樣本和含4種特征化合物本底的麥盧卡蜂蜜的加標(biāo)回收率，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，蜂蜜樣本均存在不同程度的離子化抑制效應(yīng)，且改變色譜條件也很難降低。MPI方法采用電離方式為ESI-的氯吡脲為內(nèi)標(biāo)物質(zhì)，該化合物并不能對(duì)在正離子掃描模式下的化合物進(jìn)行有效校正。前處理過程中進(jìn)行固相萃取后發(fā)現(xiàn)，特征化合物的回收率明顯提高，為79.4%～98.3%，能滿足分析要求。因此，本實(shí)驗(yàn)采用固相萃取的前處理方法，有效降低了基質(zhì)效應(yīng)的影響，提高了方法的準(zhǔn)確性。實(shí)驗(yàn)中將未進(jìn)行固相萃取和固相萃取后的麥盧卡蜂蜜樣品通過高分辨質(zhì)譜采集m/z100～1 000范圍內(nèi)的離子，結(jié)果顯示，固相萃取能去除強(qiáng)極性糖類化合物，使基質(zhì)效應(yīng)明顯下降。

2.4 方法的線性范圍、檢出限與定量下限

配制質(zhì)量濃度為0.01～1.0 mg/L的2′-MAP、2-MBA、4-HPA 和0.1～10.0 mg/L的3-PA的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，按優(yōu)化后的方法進(jìn)樣，以各化合物峰面積(y)為縱坐標(biāo)，對(duì)應(yīng)的質(zhì)量濃度(x，mg/L)為橫坐標(biāo)作線性回歸。結(jié)果表明，2′-甲氧基苯乙酮、2-甲氧基苯甲酸和4-羥基苯基乳酸在0.01～1.0 mg/L、3-苯基乳酸在0.1～10.0 mg/L范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)(r2)均大于0.99。采用逐級(jí)稀釋方式確定方法的檢出限(LODs，S/N≥3)為0.1～1.0 mg/kg，定量下限(LOQs，S/N≥10)為0.5～5.0 mg/kg。

2.5 加標(biāo)回收率與精密度

在麥盧卡蜂蜜樣品中分別添加2.0、5.0、10 mg/kg 3個(gè)水平的2′-MAP、2-MBA、4-HPA和100、200、400 mg/kg的3-PA標(biāo)準(zhǔn)品，每個(gè)水平平行測(cè)定6次，外標(biāo)法定量。結(jié)果表明，方法的平均回收率為79.4%～98.3%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)為3.2%～8.7%(見表2)。麥盧卡蜂蜜中添加10 mg/kg的2′-MAP、2-MBA、4-HPA及200 mg/kg的3-PA標(biāo)準(zhǔn)品的各化合物定量提取離子色譜圖見圖4。

表2 麥盧卡蜂蜜中4種特征化合物的平均加標(biāo)回收率及相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(n=6)Table 2 Average spiked recoveries and RSDs of four characteristic compounds from manuka honey at three different levels(n=6)

表3 不同方法在麥盧卡蜂蜜中4種特征化合物的加標(biāo)回收率Table 3 Spiked recoveries of four characteristic compounds in manuka honey by different methods

2.6 不同方法測(cè)定值的比較

比較了MPI提供的內(nèi)標(biāo)方法和采用SPE前處理的外標(biāo)法在麥盧卡蜂蜜中添加5 mg/kg 2′-MAP、2-MBA、4-HPA及200 mg/kg 3-PA標(biāo)準(zhǔn)品的回收率，結(jié)果見表 3。從表3可知，由于MPI選擇的內(nèi)標(biāo)物是非同位素內(nèi)標(biāo)，結(jié)果缺乏一定合理性，內(nèi)標(biāo)不能對(duì)結(jié)果進(jìn)行有效校正。

2.7 實(shí)際樣品的檢測(cè)

對(duì)來自新西蘭不同產(chǎn)地的麥盧卡蜂蜜、卡奴卡蜂蜜、瑞瓦瑞瓦蜂蜜、卡馬希蜂蜜、圣誕花蜂蜜、瑞塔蜂蜜、塔瓦瑞蜂蜜等共114個(gè)蜂蜜樣本和來自新西蘭、澳大利亞、馬來西亞、中國(guó)的50個(gè)不同商品蜂蜜進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果表明，運(yùn)用該鑒定指標(biāo)，在新西蘭114個(gè)巢蜜樣本中，提供蜜種信息為單花種麥盧卡的55個(gè)蜂蜜中只有37個(gè)(67.3%)被判定為單花種麥盧卡蜂蜜，8個(gè)(14.5%)被判為多花種麥盧卡蜜，10個(gè)(18.2%)被判為非麥盧卡蜂蜜；10個(gè)蜜種信息為多花種麥盧卡蜂蜜中有8個(gè)(80%)被判定為單花種麥盧卡，1個(gè)(10%)被判為非麥盧卡蜜；17個(gè)卡奴卡蜂蜜中有4個(gè)(23.5%)被判為單花種麥盧卡蜜，13個(gè)(76.5%)被判為非麥盧卡蜜；而32個(gè)非麥盧卡蜜中有1個(gè)(3.1%)被判為單花種麥盧卡蜜，5個(gè)(15.6%)被判為多花種麥盧卡蜜。在商品化蜂蜜樣本中，標(biāo)識(shí)為單花種麥盧卡蜂蜜的20個(gè)樣本中有15個(gè)(75%)被判為單花種麥盧卡蜜，3個(gè)(15%)被判為多花種麥盧卡蜜，2個(gè)(10%)被判為非麥盧卡蜜；2個(gè)標(biāo)識(shí)為多花種麥盧卡蜂蜜的有1個(gè)(50%)判為單花種麥盧卡蜂蜜，1個(gè)(50%)判為多花種麥盧卡蜜；28個(gè)標(biāo)識(shí)為非麥盧卡蜜有1個(gè)(3.6%)被判為單花種麥盧卡蜂蜜，2個(gè)(7.1%)判為多花種麥盧卡蜜。說明判定依據(jù)存在誤判性，但能提供一定參考。

3 結(jié) 論

建立了固相萃取/液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜(SPE/LC-MS/MS)測(cè)定4種麥盧卡蜂蜜特征化合物的分析方法。采用改進(jìn)的樣品前處理方法及優(yōu)化的色譜-質(zhì)譜條件后，可對(duì)蜂蜜中4種麥盧卡特征化合物2′-甲氧基苯乙酮、2-甲氧基苯甲酸、3-苯基乳酸和4-羥基苯基乳酸進(jìn)行準(zhǔn)確定性和定量分析。通過對(duì)114個(gè)巢蜜樣本及50個(gè)商品蜜結(jié)果進(jìn)行綜合分析，為判定麥盧卡蜂蜜、區(qū)分單花種和多花種麥盧卡蜂蜜提供了一定的參考依據(jù)。

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