茹 歌，王 柯，陳丹丹，鄭 榮

(上海市食品藥品檢驗所，上海 201203)

近年來，人們在化妝品上的消費逐步提高，化妝品的質(zhì)量及安全問題成為大眾關(guān)注的焦點。性激素是由動物性腺、胎盤以及腎上腺皮質(zhì)網(wǎng)狀帶等組織合成的具有促進性器官成熟等作用的一類甾體激素，主要包括雌激素、雄激素和孕激素。在化妝品生產(chǎn)過程中，常有不法廠商將性激素添加到各類化妝品中。使用添加了性激素的化妝品，短時間內(nèi)可以產(chǎn)生消除皺紋、增加皮膚彈性等作用，但長時間使用會導(dǎo)致皮膚萎縮，誘發(fā)乳腺癌、卵巢癌等疾病[1-2]。我國《化妝品安全技術(shù)規(guī)范》(2015版)和歐盟化妝品法規(guī)(Council Directive76/768/EEC)均明確規(guī)定雌激素、雄激素、孕激素為化妝品禁用組分。因此，開發(fā)適用于化妝品中性激素的測定方法具有重要意義。

目前，化妝品中性激素的檢測方法主要包括薄層色譜法(TLC)、紫外分光光度法、高效液相色譜法(HPLC)、氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法(GC-MS)、高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法(LC-MS)、超高效液相色譜-線性離子阱/靜電場軌道阱結(jié)合高分辨質(zhì)譜法[3-14]。其中以HPLC法的應(yīng)用最為廣泛，我國《化妝品安全技術(shù)規(guī)范》2015年版收載了雌三醇等7種組分的液相色譜測定方法[15]。但光譜法、色譜法存在選擇性差、靈敏度低等問題，無法解決化妝品中復(fù)雜基質(zhì)干擾的問題，對于陽性樣品常需進一步確證。而現(xiàn)有的超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法涵蓋性激素種類較少，且未涉及孕三烯酮、炔諾孕酮、己酸羥孕酮等化合物，不能解決油類樣品在甲醇、乙腈等溶劑中分散不均勻等問題，且前處理方法不具備專屬性，適用范圍有限，不能滿足監(jiān)管需求。因此，開發(fā)專屬性的前處理方法，提高靈敏度，排除復(fù)雜基質(zhì)干擾問題，從而準確定量不同化妝品中的性激素顯得迫在眉睫。

本文選擇較具代表性的睪酮、孕酮、甲基睪丸酮、孕三烯酮、醋酸甲地孕酮、醋酸甲羥孕酮、炔諾孕酮、醋酸氯地孕酮、己酸羥孕酮、雌三醇、雌二醇、雌酮和己烯雌酚13種性激素作為研究對象，根據(jù)化妝品不同基質(zhì)的溶解性特征，選取液態(tài)水基類、液態(tài)油基類、膏霜乳液類(含面膜)化妝品為考察基質(zhì)，建立專屬性提取方法，采用超聲萃取法對化妝品樣品進行前處理，UPLC-MS/MS測定，提高了化妝品中性激素測定的準確性，建立了化妝品中上述13種性激素的簡便、快速、靈敏的高通量檢測方法，填補了化妝品中性激素測定的空白，提高了化妝品安全監(jiān)管的實力，也為國家進一步補充相關(guān)檢驗方法提供了依據(jù)。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

Acqulity型超高效液相色譜儀(美國Waters公司)；API 4500型串聯(lián)四極桿質(zhì)譜儀(美國AB公司)；超聲波清洗機(美國Branson公司)；5810R型臺式離心機(德國Eppendorf公司)；MS 3旋渦混合器(德國IKA公司)。睪酮(Testosterone，純度100.0%)、孕酮(Progesterone，純度99.9%)、甲基睪丸酮(Methyltestosterone，純度100.0%)、雌三醇(Estriol，純度100.0%)、雌二醇(Estradiol，純度100.0%)、雌酮(Estrone，純度100.0%)、己烯雌酚(Diethylstilbestrol，純度100.0%)均購于EDQM；孕三烯酮(Trenbolone，純度99.7%)、醋酸甲地孕酮(Megestrol acetate，純度100.0%)、醋酸甲羥孕酮(Medroxyprogesterone 17-acetate，純度99.6%)、炔諾孕酮(Norgestrel，純度99.4%)、醋酸氯地孕酮(Chlormadinone acetate，純度100.0%)、己酸羥孕酮(Hydroxyprogesterone caproate，純度100.0%)均購于中檢院；乙腈(色譜純，德國默克公司)；正己烷(色譜純，美國霍尼韋爾公司)；其他試劑均為分析純；實驗用水由Milli-Q Advantage A-10型超純水機(美國密理博公司)制備。

1.2 實驗條件

1.2.1色譜條件色譜柱：十八烷基硅烷鍵合硅膠色譜柱(Poroshell 120 EC-C18，4.6 mm×100 mm，2.7 μm)；柱溫：25 ℃；流速：0.3 mL/min；進樣體積：5 μL；流動相：純水(A)和乙腈(B)，梯度洗脫程序：0～25 min，78%～20%A；25～25.5 min，20%～5%A；25.5～27 min，5%A；27～27.5 min，5%～78%A；27.5～29 min，78%A。

1.2.2質(zhì)譜條件電噴霧離子源(ESI+和ESI-)；正離子噴霧電壓5.0 kV，負離子噴霧電壓4.5 kV；霧化氣：N2；干燥氣：N2；離子源溫度：500 ℃；正、負模式以動態(tài)多反應(yīng)監(jiān)測(DMRM)掃描方式測定，目標化合物保留時間±60 s為采集窗口，詳細的質(zhì)譜參數(shù)列于表1。

表1 13種目標分析物的監(jiān)測離子對及相關(guān)電壓參數(shù)Table 1 The SIM(selected ion monitor) and voltage parameters of 13 target analytes

(續(xù)表1)

*quantitative ion

1.3 樣品前處理

1.3.1液態(tài)水基類、膏霜乳液類(含面膜) 分別稱取試樣0.2 g(精確至0.1 mg)于10 mL容量瓶中，加入2 mL乙腈，在渦旋混勻器上充分渦旋振蕩，使試樣與提取溶劑充分混勻后，加入50%乙腈至近刻度，超聲提取20 min，靜置至室溫，用50%乙腈定容至刻度，搖勻，以12 000 r/min離心10 min。取上清液適量，經(jīng)0.22 μm濾膜過濾，濾液供UPLC-MS-MS測定。

1.3.2液態(tài)油基類稱取試樣0.2 g(精確至0.1 mg)于10 mL離心管中，加入2 mL正己烷，在渦旋混勻器上分散，加入50%乙腈3 mL，振蕩提取2 min，以12 000 r/min離心5 min，吸取下層提取液至10 mL容量瓶中，上層正己烷溶液再加入50%乙腈3 mL，重復(fù)上述提取步驟1次，合并兩次提取液，用50%乙腈定容至刻度，即得待測試液。

1.4 基質(zhì)標準曲線系列溶液的配制

稱取標準物質(zhì)一定量于棕色容量瓶中，用50%乙腈溶解定容，配制成各性激素化合物質(zhì)量濃度為1 mg/L的混合標準溶液。取各類型基質(zhì)空白樣品6份于10 mL容量瓶中(0.2 g/份)，按上述樣品前處理步驟處理，得到空白基質(zhì)溶液。準確吸取適量體積混合標準溶液(1 mg/L)，用空白基質(zhì)溶液稀釋并定容，配制成質(zhì)量濃度分別為1、2、4、10、20、40、60 μg/L的系列基質(zhì)標準曲線溶液。

2 結(jié)果與討論

2.1 提取方式的選擇

考察了超聲提取、振蕩提取、渦旋提取3種常見提取方式對4種基質(zhì)化妝品樣品中性激素的提取效率。均稱取0.2 g(精確至0.1 mg)膏霜乳液類空白樣品于10 mL容量瓶中，分別加入一定量的13種性激素混合標準溶液，加入2 mL乙腈，分別超聲提取20 min、振蕩提取20 min或渦旋提取5 min，靜置至室溫后，定容至刻度，離心后取上清液，經(jīng)UPLC-MS/MS分析，測定加標回收率。研究表明，超聲提取方式優(yōu)于其余兩種提取方式，且超聲提取具有操作方便、高效等優(yōu)勢?？紤]到膏霜乳液類和面膜類化妝品配方中常有大分子化合物等粘稠類物質(zhì)，基質(zhì)較為復(fù)雜，測定常受到基質(zhì)干擾。為保證理想回收率，選擇先渦旋分散樣品，再超聲提取。而不同超聲時間的考察結(jié)果表明超聲20 min和超聲25 min無明顯差異，均顯著優(yōu)于超聲5 min和超聲15 min，故選擇超聲20 min為提取條件。

2.2 提取溶劑的選擇

根據(jù)目標化合物的極性，本實驗考察了甲醇、乙腈和50%乙腈3種提取溶劑的提取效果。結(jié)果表明，液態(tài)水基類、膏霜乳液類(含面膜)化妝品均能夠很好地分散于3種溶劑中，乙腈及50%乙腈對13種性激素類化合物的提取回收率均優(yōu)于甲醇，但由于乙腈中溶解的成分更為復(fù)雜，對目標化合物的測定有干擾，故最終選擇50%乙腈為提取溶劑，可在保證回收率的同時，排除雜質(zhì)的干擾。但由于乙腈極性較強，不能使液態(tài)油基類樣品均勻分散，提取回收率較低(見圖1)，故針對液態(tài)油基類樣品，改用正己烷為溶劑分散樣品，再用50%乙腈提取。

圖1 液態(tài)油基類化妝品用50%乙腈直接提取與正己烷分散樣品后再用50%乙腈提取的效果比較Fig.1 Extraction efficiencies of oil sample with 50% acetonitrile compared with 50% acetonitrile after dispersing in hexane

2.3 色譜條件的選擇

研究發(fā)現(xiàn)C18色譜柱對13種化合物的保留和分離情況優(yōu)于C8色譜柱。乙腈較于甲醇對目標化合物具有更好的分離效果，且提取溶劑和流動相種類一致能有效減小溶劑效應(yīng)，故選擇乙腈作為流動相的有機相。比較了0.1%甲酸水溶液、5 mmol/L乙酸銨水溶液、純水作為水相的響應(yīng)，發(fā)現(xiàn)前兩者均能夠分別提高正、負離子模式采集時的響應(yīng)，但又分別抑制負、正離子模式采集時的響應(yīng)。綜合考慮13種化合物性質(zhì)，最終選擇以純水作為水相。

2.4 質(zhì)譜條件的優(yōu)化

分別在正、負離子掃描模式下，對目標化合物母離子進行全掃描，得到各目標化合物的母離子后，選擇子離子分子量范圍，利用二級質(zhì)譜掃描確定其子離子，并優(yōu)化確定其碎裂電壓及碰撞能量。同時，進一步優(yōu)化離子源溫度、霧化氣及干燥氣的最佳質(zhì)譜參數(shù)。經(jīng)驗證，在“1.2.2”分析條件下，各目標化合物均具有較高靈敏度，且在該條件下穩(wěn)定，其MRM圖見圖2。

2.5 線性范圍與檢出限

由于化妝品樣品復(fù)雜，有較顯著基質(zhì)效應(yīng)，基質(zhì)標準曲線較溶液標準曲線能排除基質(zhì)效應(yīng)干擾(圖3)，可更準確定量，故配制性激素系列基質(zhì)標準溶液，采用外標法定量。13種性激素在0.89～64.80 μg/L范圍內(nèi)線性良好(表2～3)，以3倍信噪比(S/N=3)計算儀器檢出限為0.001～0.026 μg/g滿足檢測需求，與《化妝品安全技術(shù)規(guī)范》2015年版測定方法比較，其靈敏度顯著提高(表4)。

圖2 13種性激素的MRM圖Fig.2 MRM chromatogram of 13 sex hormonesthe number denoted was the same as that in Table 1

圖3 基質(zhì)標準曲線和溶液標準曲線分別測定膏霜乳液類樣品的加標回收率Fig.3 Comparison between matrix standard calibration curve and standard calibration curve the number denoted was the same as that in Table 1

表2 液態(tài)水基樣品和液態(tài)油基樣品中性激素的線性范圍及相關(guān)系數(shù)Table 2 Linear ranges and correlation coefficients of toner sample and oil sample

(續(xù)表2)

表3 膏霜乳液樣品和面膜中性激素的線性范圍及相關(guān)系數(shù)Table 3 Linear ranges and correlation coefficients of cream sample and mask sample

表4 本方法與《化妝品安全技術(shù)規(guī)范》2015年版性激素測定方法LODs的比較Table 4 Comparison of LODs with the method and《Safety and Technical Standards for Cosmetics》(2015)

2.6 加標回收率與精密度

取各基質(zhì)空白樣品0.2 g(精確至0.1 mg)于10 mL容量瓶中，加入混合對照品儲備液，制成高(1.0 μg/g)、低(0.1 μg/g)2個濃度水平，每個濃度水平平行制備6份，進行加標回收率實驗，測得峰面積分別代入相應(yīng)的基質(zhì)標準曲線計算濃度，除以理論加入量，即得方法回收率。測定結(jié)果表明，加標回收率為80.8%～116.8%，精密度為0.7%～14.4%(見表5)，該方法測定結(jié)果準確，能夠用于各類基質(zhì)化妝品中性激素的測定。

表5 不同基質(zhì)化妝品加入目標化合物的回收率Table 5 Spiked recoveries and relative standard deviations(RSD,n=6) of hormones of different kinds of cosmetics

2.7 實際樣品的測定

由于化妝品基質(zhì)復(fù)雜，利用《化妝品安全技術(shù)規(guī)范》2015年版中性激素的測定方法測定化妝品樣品時，樣品在標準品保留時間處常有雜質(zhì)峰干擾。而應(yīng)用本方法對市售化妝品進行測定，能夠準確進行定性、定量分析，證明該方法能有效篩查化妝品中的性激素。分別測定液態(tài)水基類、液態(tài)油基類、膏霜乳液類(含面膜)化妝品各5批，在1批膏霜乳液類樣品中檢出己烯雌酚，含量為0.2 mg/kg(見圖4)，遠低于《化妝品安全技術(shù)規(guī)范》2015版收載的雌三醇等7種組分的液相色譜法中己烯雌酚的檢出限(20 mg/kg)。

3 結(jié) 論

本文建立了UPLC-MS/MS同時測定13種性激素類化合物的方法。針對不同基質(zhì)的化妝品樣品，建立了專屬性的前處理方法。該方法操作簡便，靈敏度高，定量準確，適用于多種基質(zhì)類型化妝品中性激素的快速篩查，擴大了檢驗范圍，為有效監(jiān)管化妝品中非法添加禁用物質(zhì)提供了技術(shù)支撐。

參考文獻：

[1] Wen Y,Wang Y,Zhou B S,Xu Y,Feng Y Q.Chin.J.Anal.Chem.,2007,35(5):681-684.

[2] Gao X D,Huang X,Hao B C,Chen S E,Liang J P.HeilongjiangAnimalSci.Veter.Med.(高旭東,黃鑫,郝寶成,陳士恩,梁劍平.黑龍江畜牧獸醫(yī)),2015，(11):274-277.

[3] Wang J,Lin S B.J.Med.Res.(王君,林少彬.醫(yī)學研究雜志),2007,36(3):89-91.

[4] Zhao S,Wu D N,Wang P.Chin.J.Chromatogr.(趙珊,吳大南,王鵬.色譜),2004,22(3):267-269.

[5] Pang D B,Xu L,Ji S F,Liu Q Q.FlavourFragranceCosmetics(龐道標,徐莉,紀少凡,劉慶祺.香精香料化妝品),2017,6(3):29-32.

[6] Huang B F,Ye L,Han J L,Feng L,Tan Y,Wang X F.Chin.J.HealthLab.Technol.(黃百芬,葉蕾,韓見龍,馮靚,譚瑩,王小芳.中國衛(wèi)生檢驗雜志),2011,21(5):1048-1053.

[7] Yue L,Li X J.ChinaSurfactantDetergent&Cosmetics(岳磊,李曉靜.日用化學工業(yè)),2017,47(8):476-480.

[8] Wu W Q,Shen C Y,Yang Y L,Zhang Y.J.Environ.Occup.Med.(吳維群,沈朝燁,楊玉林,張韻.環(huán)境與職業(yè)醫(yī)學),2004,21(4):307-309.

[9] Wang X F,Zeng W F,Wang J,Ren R.Chin.J.Chromatogr.(王小芳,曾文芳,王菁,任韌.色譜),2009,27(3):328-332.

[10] Zhang X L,Ding J,Wang J L.StraitPharm.J.(張曉璐,丁建,汪嘉麗.海峽藥學),2015,27(10):36-39.

[11] Wang Y F,Liu Z B,Xiong Z Q,Luo Y,Yuan A H,Liu B.Chin.J.Rat.DrugUse(汪元符,劉志斌,熊震球,駱瑜,袁愛華,劉玢.中國合理用藥探索),2017,14(3):33-41.

[12] Lin Z H,Zhao Y,Xing Y N,Chen Q,Feng A H,Ye L Q,Chen Z Y.Chin.J.Anal.Lab.(林志惠,趙彥,幸苑娜,陳茜,馮岸紅,葉淋泉,陳澤勇.分析試驗室),2017,36(4):441-447.

[13] Li X Q,Wang L L.Chin.J.PublicHealth(李顯慶,王玲玲.中國公共衛(wèi)生),2014,30(3):359-360.

[14] Xiang W.Mod.Chem.Ind.(項瑋.現(xiàn)代化工),2017,37(9):206-210.

[15] Safety and Technical Standards for Cosmetics(2015)．Beijing:China Food and Drug Administration(化妝品安全技術(shù)規(guī)范(2015年版)．北京：國家食品藥品監(jiān)督管理總局),2015.