孫 健，胡 青，張 甦，馮 睿，于 泓，張靜嫻，諸艷蓉，毛秀紅，季 申

(上海市食品藥品檢驗(yàn)所，上海 201203)

隨著生活水平的提高，我國(guó)抗疲勞類保健食品市場(chǎng)銷量與日俱增。但少數(shù)違法分子為了突出功效、吸引消費(fèi)者，牟取暴利，在產(chǎn)品中非法添加短期內(nèi)見(jiàn)效快、成本相對(duì)低廉的壯陽(yáng)類化學(xué)藥物。非法添加的壯陽(yáng)類藥物主要是以西地那非等為代表的磷酸二酯酶5(PDE-5)抑制劑類化合物。目前上市的PDE-5抑制劑主要有西地那非、伐地那非、他達(dá)拉非、阿伐那非、烏地那非、米羅那非、歐迪那非[1]。

非法添加該類化合物將給消費(fèi)者帶來(lái)嚴(yán)重的健康威脅，其不良反應(yīng)主要表現(xiàn)在中樞神經(jīng)、循環(huán)和視覺(jué)系統(tǒng)，較為嚴(yán)重不良反應(yīng)為心律失常、心肌梗死、心臟猝死、腦血管出血、高血壓等[2]。

該類化合物的檢測(cè)多采用高效液相色譜法[3-5]、液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法等，質(zhì)譜可采用三重四極桿[6-7]、飛行時(shí)間[8-10]、靜電場(chǎng)軌道阱[11]、原位電離[12-14]等技術(shù)。其中，飛行時(shí)間質(zhì)譜和靜電場(chǎng)軌道阱質(zhì)譜為高分辨質(zhì)譜，可進(jìn)行定性篩查和未知物結(jié)構(gòu)確證；原位電離技術(shù)主要用于快速篩查；三重四極桿質(zhì)譜定量相對(duì)準(zhǔn)確，操作簡(jiǎn)便，適合基層檢測(cè)機(jī)構(gòu)使用。另外，采用近紅外光譜[15]、拉曼光譜[16]、核磁共振法[17]、離子遷移譜法[18]檢測(cè)西地那非等1～7種常見(jiàn)壯陽(yáng)類化合物的研究亦有報(bào)道。

目前，我國(guó)有4項(xiàng)相關(guān)檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)。國(guó)家藥品補(bǔ)充檢驗(yàn)方法和檢驗(yàn)項(xiàng)目批準(zhǔn)件2009030、食藥監(jiān)食監(jiān)三[2016]28號(hào)文附件7和國(guó)家食品補(bǔ)充檢驗(yàn)方法BJS201601[19]均采用液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)測(cè)定了11個(gè)化合物(西地那非、他達(dá)拉非、伐地那非、紅地那非、那紅地那非、羥基豪莫西地那非、豪莫西地那非、氨基他達(dá)拉非、硫代艾地那非、偽伐地那非、那莫西地那非)。由本研究團(tuán)隊(duì)牽頭起草的國(guó)家食品補(bǔ)充檢驗(yàn)方法BJS 201704補(bǔ)充檢測(cè)了去甲基他達(dá)拉非、硫代西地那非[20-21]。但隨著新型衍生物的不斷出現(xiàn)，如近年來(lái)國(guó)內(nèi)報(bào)道的化合物丙氧基苯基西地那非(Propoxyphenyl sildenafil)[22]、丙氧基苯基艾地那非(Propoxyphenyl aildenafil)[23]、丙氧基苯基硫代艾地那非(Propoxyphenyl thioaildenafil)、艾地那非、羥基硫代豪莫西地那非[24]、甲羥基豪莫西地那非[25]、2-羥乙基去甲他達(dá)拉菲(2-Hydroxyethylnortadalafil)[26]等。因此，上述標(biāo)準(zhǔn)已不能有效打擊此類新型衍生物的違法添加行為，且衍生物多缺乏系統(tǒng)全面的藥理毒理學(xué)以及臨床研究，其濫用可能會(huì)帶來(lái)更嚴(yán)重的后果。

多數(shù)文獻(xiàn)方法檢測(cè)的化合物較少，一般測(cè)定10種以下。僅文獻(xiàn)[7]同時(shí)測(cè)定了17種壯陽(yáng)類化合物，但化合物種類仍不夠全面，且回收率等方法學(xué)驗(yàn)證未嚴(yán)格按照GB/T27404-2008[27]進(jìn)行。其他檢測(cè)20種以上化合物的方法[8,10]均采用高分辨質(zhì)譜，側(cè)重于定性篩查。本文選擇日常監(jiān)測(cè)中發(fā)現(xiàn)的易被添加的30種化合物作為檢測(cè)指標(biāo)，建立了超高效液相色譜-三重四極桿質(zhì)譜法進(jìn)行測(cè)定，該方法定性定量準(zhǔn)確，操作簡(jiǎn)便，適用于基層檢測(cè)機(jī)構(gòu)，可為國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)的建立提供參考。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

Agilent 1290/6495超高效液相色譜-串聯(lián)三重四極桿質(zhì)譜儀；Waters CORTECS T3色譜柱(100 mm×2.1 mm，2.7 μm)。30種對(duì)照品的來(lái)源及相關(guān)信息見(jiàn)表1；乙腈、甲酸(色譜純，Merck公司)；甲醇(分析純，上海凌峰化學(xué)試劑有限公司)。

表1 30種化合物的對(duì)照品信息Table 1 Information of the 30 reference compounds

(續(xù)表1)

1.2 分析條件

色譜柱：Waters CORTECS T3色譜柱(100 mm×2.1 mm，2.7 μm)；柱溫：30 ℃；流動(dòng)相：A為0.1%甲酸溶液，B為含0.1%甲酸的乙腈溶液；梯度洗脫程序：0～15 min，95%～2%A；15～18 min，2%A；流速：0.3 mL/min，進(jìn)樣量：1 μL。

離子源：電噴霧離子(ESI)源，正離子模式；離子源溫度：200 ℃；毛細(xì)管電壓：4 000 V；干燥氣流量：12 L/min；霧化氣壓力：25 psi；鞘氣溫度：250 ℃；鞘氣流量：10 L/min；噴嘴電壓：500 V；采用多反應(yīng)監(jiān)測(cè)(MRM)方式檢測(cè)。30種化合物的母離子、子離子和碰撞能量(CE)見(jiàn)表2。

表2 30種化合物的母離子、子離子、碰撞能量和線性關(guān)系Table 2 Precursor ions,product ions，collision energies(CEs) and linearationship of 30 compounds

*quantitative ion

1.3 對(duì)照品溶液的制備

分別取30種對(duì)照品適量，精密稱定，用甲醇或空白基質(zhì)提取液溶解并配制成質(zhì)量濃度分別為10、20、50、100、200 μg/L的系列混合對(duì)照品溶液。

1.4 供試品溶液的制備

1.4.1固體樣品取適量固體樣品，混勻，研細(xì)，準(zhǔn)確稱取1.0 g粉末，置于具塞試管中，加入10 mL甲醇，密塞，稱重，超聲提取10 min，放冷至室溫后，再次稱重，用甲醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻，離心，取上清液，根據(jù)實(shí)際濃度適當(dāng)稀釋至線性范圍內(nèi)，作為供試品溶液。

1.4.2液體樣品取適量液體樣品，混勻，準(zhǔn)確量取1.0 mL，置于具塞試管中，加入9 mL甲醇，密塞，稱重，超聲提取10 min，放冷至室溫后，再次稱重，用甲醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻，離心，取上清液，根據(jù)實(shí)際濃度適當(dāng)稀釋至線性范圍內(nèi)，作為供試品溶液。

2 結(jié)果與討論

2.1 色譜條件的優(yōu)化

因本方法中待測(cè)化合物均為正離子模式采集，故在流動(dòng)相中添加0.1%甲酸，以增加正離子的響應(yīng)信號(hào)。采用梯度洗脫，流動(dòng)相條件優(yōu)化后可將豪莫西地那非、艾地那非、丙氧基苯基西地那非和硫代豪莫西地那非、硫代艾地那非兩組同分異構(gòu)體有效分離。

比較了Waters CORTECS T3(2.1 mm×100 mm,2.7 μm)、Waters ACQUITY UPLC HSS T3(2.1 mm×100 mm,1.8 μm)色譜柱對(duì)待測(cè)化合物的分離效果及回收率，結(jié)果均可滿足分析儀器的要求。考慮到保健食品的基質(zhì)均較復(fù)雜，對(duì)色譜柱的使用壽命有一定要求，而后者進(jìn)行復(fù)雜基質(zhì)檢測(cè)時(shí)，色譜柱壽命不如前者，故最終選擇Waters CORTECS T3(2.1 mm×100 mm,2.7 μm)色譜柱對(duì)待測(cè)化合物進(jìn)行分離。另外，考慮到保健品基質(zhì)復(fù)雜，強(qiáng)保留成分多，因此待所有組分全部出峰后，采用高比例有機(jī)相充分清洗色譜柱，以避免殘留基質(zhì)對(duì)后續(xù)樣品的影響。

2.2 質(zhì)譜條件的優(yōu)化

30種化合物的電噴霧離子化效果均較好，故采用電噴霧離子化源進(jìn)行分析。分別用甲醇溶解30種化合物，配制質(zhì)量濃度為0.5 mg/L的對(duì)照品溶液，采用Agilent MassHunter Optimizer軟件自動(dòng)優(yōu)化質(zhì)譜條件，使用單針自動(dòng)進(jìn)樣分析目標(biāo)化合物,在正離子模式下進(jìn)行全掃描,確定30種化合物的分子離子,將分子離子作為母離子,施加一定的碰撞能量,全掃描二級(jí)離子,選取豐度較高的2個(gè)子離子分別作為定量和定性離子,以MRM模式優(yōu)化碰撞能量(V)、碎裂電壓(V)等質(zhì)譜參數(shù)。優(yōu)化條件下，30種化合物的MRM色譜圖見(jiàn)圖1。

圖1 30種化合物的MRM色譜圖Fig.1 MRM chromatogram of 30 compouds

2.3 供試品溶液的制備考察

對(duì)比了甲醇和乙腈作為提取溶劑時(shí)對(duì)30種化合物的提取效果，結(jié)果表明乙腈與甲醇的提取結(jié)果基本一致，但30種化合物在甲醇中的溶解性較好，綜合考慮成本、試劑毒性等因素，最終確定甲醇為提取試劑。

以保健酒為例對(duì)前處理進(jìn)行研究，比較了Waters Prime HLB固相萃取柱凈化方法(圖2中Method 1)和甲醇直接超聲提取(圖2中Method 2)的實(shí)驗(yàn)效果。結(jié)果顯示，HLB固相萃取柱凈化方法的回收率與甲醇直接超聲提取相差不大。因甲醇超聲提取操作簡(jiǎn)便，最終確定其為前處理方法。

2.4 基質(zhì)效應(yīng)的考察

以保健酒為例考察基質(zhì)效應(yīng)，研究顯示，采用溶劑甲醇配制標(biāo)準(zhǔn)曲線時(shí)，8種化合物的回收率低于80%，偏差較大，基質(zhì)效應(yīng)嚴(yán)重。故采用空白基質(zhì)提取液，配制基質(zhì)對(duì)照品溶液(圖2中Method 3)。結(jié)果表明，以空白基質(zhì)配制標(biāo)準(zhǔn)曲線可使多數(shù)化合物的回收率得到明顯改善，僅那紅地那非和紅地那非的回收率低于80%。

圖2 樣品前處理和基質(zhì)效應(yīng)的考察Fig.2 Study of sample preparation and matrix effectthe numbers denoted were the same as those in Table 1

2.5 方法學(xué)驗(yàn)證

2.5.1線性關(guān)系在上述優(yōu)化條件下，對(duì)系列混合對(duì)照品溶液進(jìn)樣分析，以化合物的峰面積(y)為縱坐標(biāo)，對(duì)應(yīng)的質(zhì)量濃度(x，μg/L)為橫坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸，結(jié)果見(jiàn)表2。結(jié)果表明，30種化合物在10～200 μg/L范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)(r)均大于0.99。

2.5.2專屬性選擇牡蠣片和保健酒2種基質(zhì)作為固態(tài)和液態(tài)保健食品的代表基質(zhì)。取牡蠣片和保健酒2種空白基質(zhì)，按供試品溶液制備方法配制空白溶液，進(jìn)樣分析，結(jié)果均未檢出該30種化合物。

2.5.3加標(biāo)回收率及精密度取上述2種基質(zhì)，分別添加低(0.1 mg/kg)、中(0.2 mg/kg)、高(1.0 mg/kg) 3個(gè)水平的對(duì)照品溶液，每個(gè)水平做6個(gè)平行樣，按上述供試品溶液制備方法和色譜-質(zhì)譜條件進(jìn)行分析，計(jì)算加標(biāo)回收率和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(見(jiàn)表3)。30種化合物的平均加標(biāo)回收率為62.8%～135.2%，RSD均不大于14%。液體基質(zhì)中僅那紅地那非和紅地那非的回收率低于80%；固體基質(zhì)中僅氨基他達(dá)拉非的回收率低于80%，硫代艾地那非的回收率大于120%；其余26種化合物的回收率及精密度均符合GB/T 27404-2008(實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量控制規(guī)范 食品理化檢測(cè))要求。

表3 30種化合物的加標(biāo)回收率及相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(n=6)Table 3 Recoveries and RSDs of 30 compounds(n=6)

(續(xù)表3)

(續(xù)表3)

2.5.4檢出限與定量下限向基質(zhì)中添加0.05 mg/kg的30種化合物，以能實(shí)際檢出的最低含量作為檢出限(LOD)，以回收率符合要求的最低含量作為定量下限(LOQ)。結(jié)果表明，30種化合物的LOD為0.05 mg/kg(固體)或0.05 mg/L(液體)，LOQ為0.1 mg/kg(固體)或0.1 mg/L(液體)。

他達(dá)拉非、西地那非的臨床用量分別為10 mg/次和50 mg/次。以每次服用保健食品1 g計(jì)，起效非法添加的含量分別為10 mg/g和50 mg/g，本方法的檢出限和定量下限可滿足日常非法添加劑量檢測(cè)的監(jiān)管需求。

2.6 定性判斷方法

保健食品中添加的化學(xué)藥品為禁用物質(zhì)，測(cè)定方法應(yīng)首先確保定性準(zhǔn)確。本課題組已建立了31種壯陽(yáng)類化合物的Q-TOF高分辨質(zhì)譜篩查方法[8]，但受限于基層實(shí)驗(yàn)室儀器、人員等因素，方法推廣不易，且監(jiān)管方時(shí)常需要定量結(jié)果。故本研究采用易于標(biāo)準(zhǔn)化操作的三重四極桿質(zhì)譜建立測(cè)定方法，同時(shí)兼顧定性定量的準(zhǔn)確性。

根據(jù)歐盟SANCO/12571/2013的規(guī)定，三重四極桿方法確證化合物至少需要兩個(gè)子離子，且濃度相當(dāng)?shù)墓┰嚻啡芤汉蜆?biāo)準(zhǔn)溶液相對(duì)離子豐度一致(相對(duì)比例>50%，允許±20%偏差；相對(duì)比例>20%～50%，允許±25%偏差；相對(duì)比例>10%～20%，允許±30%偏差；相對(duì)比例≤10%，允許±50%偏差)。

2.7 實(shí)際樣品的測(cè)定

表4 實(shí)際樣品的檢測(cè)結(jié)果Table 4 Detection results of real samples

表4列出了保健食品中非法添加化學(xué)藥品實(shí)際檢測(cè)工作中兩百余批涉案專項(xiàng)陽(yáng)性樣品的檢測(cè)結(jié)果。結(jié)果表明，添加化合物主要為西地那非和他達(dá)拉非，亦存在同時(shí)添加多種化合物的現(xiàn)象，且含量差異較大，安全風(fēng)險(xiǎn)高。

3 結(jié) 論

本研究建立了超高效液相色譜-三重四極桿質(zhì)譜測(cè)定30種壯陽(yáng)類化合物的分析方法，增加了現(xiàn)有國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)中檢測(cè)化合物的種類，定性定量準(zhǔn)確，操作簡(jiǎn)便，已應(yīng)用于實(shí)際樣品檢測(cè)，可為國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)的建立提供參考。

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