郭瑩，康健，柴文戍，潘殿柱，車麗燕，王榮，李靖，閻雪，安曉琴

（1.錦州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院 呼吸科，遼寧 錦州 121001；2.中國醫(yī)科大學(xué)附屬第一院 呼吸疾病研究所，遼寧 沈陽 110001）

氣道上皮細(xì)胞是抵御外界環(huán)境刺激物的第一道防線，吸入的香煙煙霧首先與之接觸，引起氣道和肺部的炎癥反應(yīng)，釋放各種炎癥介質(zhì)和細(xì)胞因子。其中白細(xì)胞介素8（Interleutin-8，IL-8）是最為重要的細(xì)胞因子，是迄今發(fā)現(xiàn)的最強(qiáng)的中性粒細(xì)胞趨化因子，是中性粒細(xì)胞活化的標(biāo)志。此外還有腫瘤壞死因子α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）、IL-6、IL-10等也與炎癥過程有密切關(guān)系[1]。其能有效地激活細(xì)胞內(nèi)途徑（即NF-κB和其他信號），導(dǎo)致疾病的演變和各種相關(guān)癥狀的產(chǎn)生[2]。

羧甲司坦除了作為一種臨床常用的黏液調(diào)節(jié)劑[3]，還具有顯著的抗炎作用。研究發(fā)現(xiàn)，含半胱氨酸的藥物，如羧甲司坦和N-乙酰半胱氨酸等能夠減少促炎細(xì)胞因子（TNF-α、IL-6、IL-8）的產(chǎn)生[4]。已有大量的基礎(chǔ)和臨床研究證實(shí)，羧甲司坦的抗炎作用比其本身的祛痰作用更為顯著。近年的臨床研究發(fā)現(xiàn)，應(yīng)用羧甲司坦可明顯減少慢性阻塞性肺疾?。╟hronic obstructive pulmoriary disease，COPD）患者的急性加重，延長發(fā)作間歇[5]。但國外同等規(guī)模流行病學(xué)調(diào)查顯示應(yīng)用祛痰類藥物效果不明顯，分析2者之間的差異，發(fā)現(xiàn)國外COPD患者基礎(chǔ)常規(guī)應(yīng)用吸入性糖皮質(zhì)激素，而我國PEACE研究中入選的COPD患者中僅有16.7%不規(guī)律應(yīng)用吸入性糖皮質(zhì)激素。由此推測合用吸入性糖皮質(zhì)激素可能是差異產(chǎn)生的重要原因。眾所周知，糖皮質(zhì)激素具有全身抗炎作用，尤其是吸入糖皮質(zhì)激素已被廣泛應(yīng)用于臨床治療哮喘及COPD患者。那么，糖皮質(zhì)激素充分抗炎的“天花板效應(yīng)”是否就是羧甲司坦未能發(fā)揮作用的原因呢？糖皮質(zhì)激素影響羧甲司坦發(fā)揮作用的機(jī)制又是什么呢？因此，本研究旨在通過體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)證明：羧甲司坦的抗炎機(jī)制可能與糖皮質(zhì)激素存在重疊，基礎(chǔ)應(yīng)用糖皮質(zhì)激素者由于占用了相同的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路使某些炎癥靶點(diǎn)受抑制，故再聯(lián)合應(yīng)用羧甲司坦時(shí)效果不佳。

1 材料與方法

1.1 主要試劑與儀器

羧甲司坦、布地奈德（杭州寶侖生物公司），標(biāo)準(zhǔn)研究用煙（1R3F，美國肯塔基大學(xué)），RPMI 1640培養(yǎng)基（美國Hyclone公司），胎牛血清、青鏈霉素混合液（北京Solarbio公司），EGF（美國Pepro Tech公司），PD98059（美國 Selleck公司），MTT、DMSO（美國Sigma公司），ELISA試劑盒（美國R&D公司），ERK、p-ERK、IκBα、p-IκBα抗體（英國Abcam公司），二抗（羊抗小鼠、羊抗兔）（北京中杉金橋公司），β-actin、ERK、NF-κB引物（上海生工公司），無水RNA酶（美國Thermo公司），RNAiso Plus（日本TaKaRa公司），實(shí)時(shí)聚合酶鏈反應(yīng)（real-time PCR）試劑盒（日本TaKaRa公司），CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱（美國Thermo Scientific HERA cell 150i），酶標(biāo)儀（美國Bioteck公司），電泳儀（美國Bio-Rad公司），PCR儀（英國Techne公司），實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)（qRT-PCR）儀（TP800，日本TaKaRa公司）。

1.2 人氣道上皮細(xì)胞培養(yǎng)、煙霧提取液制備及分組

1.2.1 人氣道上皮細(xì)胞株（16HBE細(xì)胞） 購于中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院腫瘤細(xì)胞庫。

1.2.2 煙霧提取物的制備 參照文獻(xiàn)[6]方法，點(diǎn)燃一支香煙用50 ml注射器連續(xù)抽吸，香煙燃燒速度約為5 min/支，吸入的煙霧經(jīng)三通管緩慢注入盛有10 ml RPMI 1640培養(yǎng)液的密封瓶中制成懸液，搖晃使其充分溶解，調(diào)定至pH 7.4。經(jīng)0.22μm微孔濾膜過濾除菌，存于冰中。制備的（cigarette smoke extract，CSE）濃度設(shè)定為100.00%，稀釋不同濃度的CSE 30 min內(nèi)用于實(shí)驗(yàn)。

1.2.3 分組 分別給予不同干預(yù)因素，24 h后收集細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。①對照組（N組）：正常培養(yǎng)細(xì)胞。②模型組（CN組）：細(xì)胞培養(yǎng)液中加入CSE。③羧甲司坦組（CC組）：細(xì)胞培養(yǎng)液中加入CSE和10～4 M羧甲司坦。④布地奈德組（CB組）：細(xì)胞培養(yǎng)液中加入CSE和10～8 mol/L布地奈德。⑤聯(lián)合組（CCB組）：先加布地奈德處理細(xì)胞1 d后再加羧甲司坦干預(yù)。⑥抑制劑組（CNP組）：細(xì)胞培養(yǎng)液中加入CSE和100 μmol/L ERK1/2抑制劑PD98059。⑦激動劑組（CCE組）：在羧甲司坦組基礎(chǔ)上加入10 ng/ml ERK1/2激動劑EGF。

1.3 MTT法檢測不同濃度CSE對細(xì)胞生存率的影響

收集對數(shù)期細(xì)胞，鋪板，孵育至細(xì)胞單層鋪滿孔底，加入不同濃度CSE（分別為80.00%、40.00%、20.00%、10.00%、5.00%、2.50%、1.25%、0.63% 和0.00%），分別于干預(yù)后1、3、6、12、24和48 h處理細(xì)胞。每孔加入20 μl MTT溶液，繼續(xù)培養(yǎng)4 h終止培養(yǎng)，每孔加入150 μl二甲基亞砜，搖床振蕩10 min，酶標(biāo)儀檢測吸光度。終吸光度A值=A570 nm-A630 nm，細(xì)胞生存率（%）=A加藥孔/A對照孔×100%。

1.4 ELISA檢測炎癥因子IL-8、IL-6水平的變化

準(zhǔn)備試劑、樣本，按比例稀釋標(biāo)準(zhǔn)品；加樣（標(biāo)準(zhǔn)品及樣本）各100 μl，室溫孵育2 h；吸棄，洗板4次；加酶標(biāo)檢測抗體200 μl，室溫孵育2 h；吸棄，洗板4次；加顯色底物200 μl，室溫孵育30 min；加終止液50μl，450 nm波長酶標(biāo)儀測量OD值，540 nm作為校正波長。

1.5 Western blot檢測ERK、p-ERK、IκBα、p-IκBα蛋白水平的變化

RIPA裂解液（RIPA 75%、PMSF 10%、cocktail 15%）裂解細(xì)胞，離心取上清液采用BCA法測定蛋白濃度。與上樣緩沖液混合后上樣，SDS-PAGE（10%分離膠，5%濃縮膠）電泳，電轉(zhuǎn)移至PVDF膜。與一抗多克隆抗體ERK、p-ERK、IκBα、p-IκBα孵育，4℃過夜。加入1︰2 500稀釋的二抗室溫下孵育，洗膜后顯色，于凝膠自動成像分析系統(tǒng)下成像，采用Image J圖像分析軟件對條帶進(jìn)行灰度值測定。

1.6 qRT-PCR檢測ERK、NF-κB mRNA水平的變化

Trizol法提取細(xì)胞總RNA，按cDNA合成試劑盒說明配置反應(yīng)體系，在PCR儀中37℃ 15 min，85℃ 5 s逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA。以此為模板分別加入NF-κB、ERK1/2、β-actin的引物（β-actin-F：5'-ATAGCACA GCCTGGATAGCAACGTAC-3'；β-actin-R：5'-CACC TTCTACAATGAGCTGCGTGTG-3'；ERK1/2-F：5'-CAACGTGCTCCACCGAGAT-3'；ERK1/2-R：5'-TCA TGCTCAGGATCGGCAAT-3'；NF-κB-F：5'-CAATCGT GCCCCCAACACT-3'；NF-κB-R ：5'-GTCCTCTTTC TGCACCTTGTCAC-3'）和熒光染料在qRT-PCR儀上進(jìn)行擴(kuò)增，95℃預(yù)變性30 s，95℃變性5 s，60℃退火/延伸30 s，40個(gè)循環(huán)?；蛳鄬Ρ磉_(dá)量以2-ΔΔCt法分析。即ΔΔCt=（Ct目的基因-Ct內(nèi)參基因）實(shí)驗(yàn)組-（Ct目的基因-Ct內(nèi)參基因）對照組。各組之間的表達(dá)差異用 2-ΔΔCt表示。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

數(shù)據(jù)分析采用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)軟件，計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，多組樣本間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 不同時(shí)間不同濃度CSE對HBE細(xì)胞生存率的影響

CSE濃度在0.63%～5.00%時(shí)，對HBE細(xì)胞的抑制作用輕微，不同時(shí)間點(diǎn)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。隨著CSE濃度的升高，HBE細(xì)胞的生存率呈下降趨勢。CSE濃度在10.00%～80.00%，隨著作用時(shí)間的延長，細(xì)胞生存率降低，細(xì)胞大量死亡，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。故本實(shí)驗(yàn)選擇5.00% CSE進(jìn)行以下實(shí)驗(yàn)。見圖1和表1。

圖1 不同濃度CSE對HBE細(xì)胞生存率的影響

表1 不同濃度CSE作用下不同時(shí)間HBE細(xì)胞的生存率 （%，±s）

表1 不同濃度CSE作用下不同時(shí)間HBE細(xì)胞的生存率 （%，±s）

濃度 1 h 3 h 6 h 12 h 24 h 48 h F值 P值0.63% 99.54±0.44 99.27±1.08 99.22±0.95 99.30±0.36 98.90±1.23 99.30±0.78 0.128 0.968 1.25% 92.21±1.75 92.94±2.02 94.88±2.91 94.97±1.55 95.57±1.87 92.97±1.50 1.443 0.278 2.50% 93.52±14.93 91.39±47.32 100.00±37.29 95.44±2.82 95.02±3.06 95.73±2.49 0.053 0.998 5.00% 88.41±14.46 90.14±15.42 95.23±24.60 90.32±4.46 85.61±3.72 87.80±2.53 0.198 0.960 10.00% 89.00±13.56 94.62±13.94 90.14±15.42 95.23±24.60 28.68±10.81 9.18±3.00 24.822 0.000 20.00% 77.73±19.47 91.24±26.46 78.81±18.00 4.25±8.30 6.29±3.79 8.67±5.41 15.826 0.000 40.00% 66.21±4.84 80.33±27.84 51.76±12.60 40.38±14.47 5.50±1.74 7.83±3.00 14.993 0.000 80.00% 53.21±8.44 54.46±7.16 25.49±5.91 18.40±4.13 5.95±1.77 8.47±2.61 50.898 0.000

2.2 細(xì)胞上清中IL-8、IL-6水平

通過ELISA法檢測細(xì)胞上清中炎癥因子水平結(jié)果顯示，CN組IL-8、IL-6水平均較N組升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），CC組、CB組及CCB組上述指標(biāo)均較模型組有所降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），但3組IL-8、IL-6水平作兩兩比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見表2和圖2、3。

表 2 細(xì)胞上清中 IL-8、IL-6 水平 （pg/ml，±s）

表 2 細(xì)胞上清中 IL-8、IL-6 水平 （pg/ml，±s）

組別 IL-8 IL-6 N組 254.67±29.32 241.73±30.88 CN組 608.76±71.55 602.12±11.57 CC 組 361.60±42.70 466.21±39.60 CB 組 373.05± 30.13 481.73±7.80 CCB 組 400.40±14.66 464.72±49.18 F值 28.110 49.650 P值 0.000 0.000

圖2 細(xì)胞上清中IL-8水平

圖3 細(xì)胞上清中IL-6水平

2.3 不同藥物干預(yù)對HBE細(xì)胞ERK、IκBα磷酸化的影響

與N組比較，CN組HBE細(xì)胞p-ERK、p-IκBα蛋白表達(dá)均增高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=5.041，P=0.000）；CC組、CB組及CCB組上述指標(biāo)較CN組均降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（p-ERK：3組t=3.355、2.306和 2.896，P=0.004、0.023和 0.012；p-IκBα：3組t=2.896、2.764和2.228；P=0.012、0.015和0.020）；CC組與CB組P-ERK比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=3.013，P=0.034），CCB組與CB組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；p-IκBα蛋白表達(dá)給藥的3組間比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見圖 4、5。

2.4 PD98059、EGF對HBE細(xì)胞ERK磷酸化的影響

與N組比較，CN組HBE細(xì)胞p-ERK表達(dá)增強(qiáng)（t=2.718，P=0.016），分別給予羧甲司坦、PD98059干預(yù)后p-ERK均降低（t=1.999和2.201，P=0.038和0.022），而給予EGF干預(yù)后，p-ERK的表達(dá)CN組與CC組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=1.812，P=0.041），CN組有所回升。見圖6。

圖4 p-ERK蛋白表達(dá)

與N組比較，CN組細(xì)胞ERK、NF-κB mRNA表達(dá)均增高（t=2.262和1.940，P=0.025和0.031）；分

2.5 各組細(xì)胞ERK、NF-κB mRNA水平的變化

別給予羧甲司坦、布地奈德、兩藥聯(lián)合及PD98059干預(yù)后 ERK mRNA（t=1.999、1.940、1.895和 2.896，P=0.038、0.030、0.045和0.011）及NF-κB mRNA（t=1.812、2.005、1.857 和 2.998，P=0.042、0.036、0.043和0.009）表達(dá)水平降低，而給予EGF干預(yù)后ERK和NF-κB mRNA CN組與CC組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=2.764和2.228，P=0.015和0.021），CN組有所回升。見圖7、8。

圖5 p-IκBα蛋白表達(dá)

圖6 PD98059、EGF對ERK磷酸化的影響

圖7 ERK mRNA水平

圖8 NF-κB mRNA水平

3 討論

CSE是從香煙煙霧中提取的溶于細(xì)胞培養(yǎng)基的物質(zhì)，其中含有丙烯醛、尼古丁、煙堿、焦油和活性氧（ROS）等成分，目前廣泛用于體外實(shí)驗(yàn)中以研究香煙在細(xì)胞水平的作用[7-9]。本研究采用MTT法檢測不同濃度CSE對HBE細(xì)胞生存率的影響，發(fā)現(xiàn)隨著CSE濃度的升高，HBE細(xì)胞的生存率呈下降趨勢。CSE濃度在0.63%～5.00%時(shí)，對HBE細(xì)胞的抑制作用輕微，不同時(shí)間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。而CSE濃度在10.00%～80.00%時(shí)，隨著作用時(shí)間的延長，細(xì)胞生存率降低，細(xì)胞大量死亡。

香煙煙霧中含有的大量有害物質(zhì)，能夠?qū)獾篮头谓M織造成直接損傷，促進(jìn)氣道炎癥，活化氣道上皮細(xì)胞，產(chǎn)生并釋放炎癥介質(zhì)。TNF-α、IL-8及IL-6是COPD重要的炎癥介質(zhì)，其來源廣泛，以支氣管上皮細(xì)胞和肺泡巨噬細(xì)胞產(chǎn)生為主，在COPD的發(fā)病機(jī)制中起重要作用。本研究結(jié)果表明，HBE細(xì)胞給予CSE干預(yù)后，其炎癥因子IL-8、IL-6水平升高，而羧甲司坦、布地奈德及聯(lián)合組均能不同程度降低上述炎癥因子的水平，3個(gè)藥物干預(yù)組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，證明CSE能夠誘導(dǎo)炎癥因子水平的升高，羧甲司坦抑制氣道炎癥的作用與布地奈德相近，兩藥聯(lián)合應(yīng)用未能進(jìn)一步提高控制炎癥的作用。

已有體外實(shí)驗(yàn)證明，香煙煙霧提取物（CSE）引起IL-8等炎癥因子的釋放與ERK和NF-κB信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的激活有關(guān)[10-12]。細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶（ERK）作為MAPK通路的一部分，是將信號從表面受體傳導(dǎo)至細(xì)胞核的關(guān)鍵。其包括ERK1和ERK2 2個(gè)亞型，統(tǒng)稱為ERK1/2。磷酸化激活的ERKl/2由胞質(zhì)轉(zhuǎn)位到核內(nèi)，進(jìn)而介導(dǎo)ELK-1、NF-κB、AP-1等轉(zhuǎn)錄因子的轉(zhuǎn)錄活化，參與細(xì)胞增殖與分化、細(xì)胞凋亡和惡變過程，并參與應(yīng)激刺激、細(xì)菌產(chǎn)物和炎癥介質(zhì)等引起的生物學(xué)反應(yīng)，這表明ERK通路的激活與炎癥反應(yīng)有著密切關(guān)系[13-15]。作為ERK通路的特異性抑制劑，PD98059通過特異性地抑制其上游激酶MEK1/2，進(jìn)而抑制ERK1/2的激活與磷酸化。而EGF是研究常用的ERK通路的激動劑。本研究應(yīng)用ERK通路的激動劑和抑制劑研究羧甲司坦的作用機(jī)制，結(jié)果顯示CSE刺激下的HBE細(xì)胞p-ERK蛋白及ERK mRNA表達(dá)增高，分別給予羧甲司坦、布地奈德、兩藥聯(lián)合及PD98059干預(yù)后上述指標(biāo)均降低，而給予EGF干預(yù)后p-ERK及ERK mRNA較羧甲司坦組有所回升，證明羧甲司坦能夠通過調(diào)控ERK的磷酸化發(fā)揮其抗炎作用。同時(shí)，本實(shí)驗(yàn)也觀察到，糖皮質(zhì)激素同樣參與調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)ERK-MAPK信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路而抑制炎癥介質(zhì)，這與CLARK等[15]報(bào)道一致。

NF-κB信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路是炎癥反應(yīng)的另1個(gè)關(guān)鍵環(huán)節(jié)，也是體內(nèi)多條信號途徑的共同交匯點(diǎn)。它在肺組織炎癥反應(yīng)進(jìn)展中起著核心地位，其活化及過度表達(dá)可造成機(jī)體細(xì)胞因子失衡，產(chǎn)生炎癥反應(yīng)的級聯(lián)放大效應(yīng)[16-17]。NF-κB是由2個(gè)亞基組成的同源二聚體或異源二聚體，其最常見的活性形式是由P65和P50組成的異源二聚體[18]。通常狀態(tài)下，NF-κB與其抑制因子IkBα螯合在細(xì)胞漿內(nèi)。當(dāng)機(jī)體受到內(nèi)毒素、TNF-α、細(xì)菌、病毒等刺激時(shí)，IkBα迅速發(fā)生磷酸化，NF-κB被激活進(jìn)入細(xì)胞核，與目標(biāo)基因啟動子結(jié)合并調(diào)節(jié)其轉(zhuǎn)錄[19]。研究發(fā)現(xiàn)，NF-κB的最初激活發(fā)生在肺泡巨噬細(xì)胞中，隨后有活化的炎癥因子進(jìn)一步激化氣道上皮細(xì)胞等周圍細(xì)胞[21]。目前研究普遍認(rèn)為NF-κB與COPD病情嚴(yán)重程度相關(guān)[20-23]。已有研究證實(shí)，糖皮質(zhì)激素在調(diào)節(jié)NF-κB的活性中發(fā)揮了重要作用[24-25]。本研究中發(fā)現(xiàn)，羧甲司坦亦能降低CSE誘導(dǎo)的p-IκBα蛋白及NF-κB mRNA表達(dá)水平，且與布地奈德及聯(lián)合組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，說明羧甲司坦的調(diào)控作用至少部分是通過NF-κB信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路進(jìn)行的，這可能與糖皮質(zhì)激素的作用機(jī)制存在重疊。

綜上所述，羧甲司坦能夠抑制香煙煙霧提取物誘導(dǎo)的氣道炎癥。羧甲司坦和布地奈德均能通過抑制ERK和NF-κB信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路減輕香煙所致的氣道炎癥，這說明2者的作用機(jī)制存在重疊部分，因此基礎(chǔ)應(yīng)用糖皮質(zhì)激素后，由于其抑制相同的炎癥靶點(diǎn)，再聯(lián)合羧甲司坦時(shí)未能體現(xiàn)其應(yīng)有的作用，或者由于2者之間對于作用位點(diǎn)的競爭拮抗甚至削弱了其原本的療效。這些尚有待于進(jìn)一步的深入研究。

參 考 文 獻(xiàn)：

[1] HENTSCHEL J, MüLLER U, DOHT F, et al. Influences of nasal lavage collection-, processing- and storage methods on inflammatory markers - evaluation of a method for non-invasive sampling of epithelial lining fluid in cystic fibrosis and other respiratory diseases[J]. J Immunol Methods, 2014, 404(2): 41-51.

[2] RAJENDRASOZHAN S, YANG S R, EDIRISINGHE I, et al.Deacetylases and NF-kappaB in redox regulation of cigarette smoke-induced lung inflammation: epigenetics in pathogenesis of COPD[J]. Antioxid Redox Signal, 2008, 10(4): 799-811.

[3] ISHIBASHI Y, TAKAYAMA G, INOUYE Y, et al. Carbocisteine normalizes the viscous property of mucus through regulation of fucosylated and sialylated sugar chain on airway mucins[J]. Eur J Pharmacol, 2010, 641(2-3): 226-228.

[4] MESSIER E M, DAY B J, KLEEBERGER S R, et al.N-Acetylcysteine protects murine alveolar type II cells from cigarette smoke injury in a nuclear erythroid 2-related factor-2-independent manner[J]. Am J Respir Cell Mol Biol, 2013, 48(5):559-567.

[5] ZHENG J P, KANG J, HUANG S G, et al. Effect of carbocisteine on acute exacerbation of chronic obstructive pulmonary disease(PEACE Study): a randomised placebo-controlled study[J]. Lancet,2008, 371(9629): 2013-2018.

[6] SU Y, HAN W, GIRALDO C, et al. Effect of cigarette smoke extract on nitric oxide synthase in pulmonary artery endothelial cells[J]. Am J Respir Cell Mol Biol, 1998, 19(5): 819-825.

[7] VAYSSIER-TAUSSAT M, CAMILLI T, ARON Y, et a1. Effects of tobacco smoke and benzo[a]pyrene on human endothelial cell and monocyte stress responses[J]. Am J Physiol Heart Cim Physiol,2001, 280(3): H1293-1300.

[8] CARNEVALI S, PETRUZZELLI S, LONGONI B, et a1. Cigarette smoke extract induces oxidative stress and apoptosis in human lung fibroblasts[J]. Am J Physiol Lung cell Mol Physiol, 2003,284(6): L955-963.

[9] VAN D T M, SMITDE VRIES M P, SLEBOS D J, et al. Cigarette smoke irreversibly modifies glutathione in airway epithelial cells[J]. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol, 2007, 293(5):L1156-1162.

[10] YANG S R, CHIDA A S, BAUTER M R, et al. Cigarette smoke induces proinflammatory cytokine release by activation of NF-kappaB and posttranslational modifications of histone deacetylase in macrophages[J]. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol, 2006,291(1): L46-57.

[11] OENEMA T A, KOLAHIAN S, NANNINGA J E, et al. Proinflammatory mechanisms of muscarinic receptor stimulation in airway smooth muscle[J]. Respir Res, 2010, 11(9): 130.

[12] BIOLLY B, VERCOUTER-EDOUART A S, HONDERMARK H, et al. FGF singnals for cell proliferation and migration through different pathways[J]. Cytokine Growth Factor Rev, 2000, 11(4):295-302.

[13] WIDMANN C, GIBOSN S, JARPE M B, et al. Mitogen-activated protein kinase: conservation of a three-kinase module from yeast to human[J]. Physiol Rev, 1999, 79(1): 143-180.

[14] DZIAREKE R, JIN Y P, GUPTA D. Differential activation of extracellular signal_regulated kinase (ERK) 1, ERK2, P38 and c-Jun NH2 terminal kinase mitogen- activated protein kinases by bacterial peptidoglycan[J]. J Infect Dis, 1996, 174(4): 777-785.

[15] CLARK A R, LASA M. Crosstalk between glucocorticoids and mitogen-activated protein kinase signaling pathways[J]. Curr Opin pharmacol, 2003, 3(4): 404-411.

[16] CUZZOCREA S, CRISAFULLI C, MAZZON E, et al. Inhibition of glycogen synthase kinase-3beta attenuates the development of carrageenan-induced lung injury in mice[J]. BJ Pharmacol, 2006,149(6): 687-702.

[17] EVERHART M B, HAN W, SHERRILL T P, et al. Duration and intensity of NF-kappaB activity determine the severity of endotoxin-induced acute lung injury J Immunol[J]. 2006, 176(8):4995-5005.

[18] KARIN M, BEN-NERIAH Y. Phosphorylation meets ubiquitination: the control of NF-κB activity[J]. Annu Rev Immunol, 2000, 18(4): 621-663.

[19] MEDURI G U, CARRATU P, FREIRE A X. Evidence of biological efficacy for prolonged glucocorticoid treatment in patients with unresolving ARDS[J]. European Respiratory Journal,2003, 42(Suppl I): I57-I64.

[20] BARNES P J, KARIN M. Nuclear factor-kappa B: a pivotal transcription factor in chronic inflammatory diseases[J]. N Engl J Med, 1997, 336(15): 1066-1071.

[21] CHAROKOPOS N, APOSTOLOPOULOS N, KALAPODI M, et al. Bronchial asthma, Chronic obstructive pulmonary disease and NF-Kb[J]. Current Medicinal Chemistry, 2009, 16(7): 867-883.

[22] CHMITZ M L, BAEUERLE P A. The p65 unit is responsible for the strong transcription activating potential of NF-Kb[J]. EMBO J.1991, 10(12): 3805-3817.

[23] CHEN L, SUN B B, WANG T, et al. Cigarette smoke enhances{beta} -defensin 2 expression in rat airways via nuclear factor-{kappa}B activation[J]. Eur Respir J, 2010, 36(3): 638-645.

[24] FEMANDES A B, ZIN W A, ROCCO P R. Corticosteroids in acute respiratory distress syndrome[J]. Braz J Med Biol Res,2005, 38(2): 147-159.

[25] LU N Z, CIDLOWSKI J A. The origin and functions of multiple human glucocorticoid receptor isoforms[J]. Ann N Y Acad Sci,2004, 1024(6): 102-123.