寇曉晶，高 峰，郭慧琳，劉劍鋒

（1.甘肅省動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心，甘肅蘭州 730000；2. 鹽城出入境檢驗(yàn)檢疫局，江蘇鹽城 224002；3. 南京農(nóng)業(yè)大學(xué)，江蘇南京 210014）

偽狂犬病毒（Pseudorabies virus，PRV）是一種皰疹病毒，能夠感染豬、牛、羊等家畜及野生動(dòng)物，主要侵害神經(jīng)系統(tǒng)及生殖系統(tǒng)，降低家畜的生產(chǎn)性能，甚至導(dǎo)致動(dòng)物死亡。據(jù)不完全統(tǒng)計(jì)，全世界范圍內(nèi)己有44個(gè)國(guó)家和地區(qū)報(bào)道過偽狂犬病的發(fā)生。

豬是PRV的天然宿主，各個(gè)階段豬均可感染。新生仔豬感染后呈現(xiàn)神經(jīng)癥狀，且死亡率極高；妊娠母豬、種公豬以繁殖障礙為主；生長(zhǎng)育肥豬則表現(xiàn)為呼吸道癥狀[1-2]。一旦豬群發(fā)生PRV感染，病毒很難被清除。豬偽狂犬病因傳播速度快、范圍廣、途徑多，以及病原頑固等特點(diǎn)，被定義為極難防疫的自然疫源性疾病，國(guó)際動(dòng)物衛(wèi)生組織（OIE）將其列為須報(bào)告動(dòng)物疫病。目前，一些歐洲和北美國(guó)家通過積極有效的疾病防控手段和撲殺程序，已將PRV徹底凈化。但PRV在我國(guó)仍廣泛流行，引起的經(jīng)濟(jì)損失巨大。

目前PRV的診斷方法主要有病毒分離培養(yǎng)、PCR、血清抗體檢測(cè)等[3-7]。但病毒分離培養(yǎng)耗時(shí)較長(zhǎng)，一般需要耗時(shí)2～3 d，并且敏感性較差；PCR是一種快速、精確、敏感的檢測(cè)方法，但對(duì)專業(yè)技能要求較高，且設(shè)備昂貴，不適用于臨床推廣[8-9]。相比上述兩種檢測(cè)方法，血清抗體檢測(cè)具有操作簡(jiǎn)單、敏感性好、能大批量檢測(cè)樣品的優(yōu)點(diǎn)，更能符合臨床檢測(cè)需要。

根據(jù)瘡疹病毒糖蛋白命名法，PRV的糖蛋白統(tǒng)一命名為gB、gC、gD、gE、gH、gJ、gK、gL、gM、gN，其中g(shù)E是主要的毒力因子。病毒在體外培養(yǎng)時(shí)，gE的缺失并不影響其增殖性能和免疫原性，但病毒毒力則會(huì)降低，從而為該病疫苗制備提供了思路[10]。目前，幾乎所有分離到的野毒株中都含有g(shù)E蛋白[11]。當(dāng)動(dòng)物自然感染PRV時(shí)，血清中的gE抗體則會(huì)升高，而gE蛋白缺失疫苗免疫后則不會(huì)產(chǎn)生gE抗體。因此，選擇gE蛋白作為包被抗原，可用于豬群野毒感染的臨床檢測(cè)。

本研究以gE蛋白為包被抗原，建立了PRV野毒株ELISA檢測(cè)方法，并通過與國(guó)際知名產(chǎn)品進(jìn)行對(duì)比試驗(yàn)和穩(wěn)定性試驗(yàn)，確定該方法可用于豬偽狂犬病檢測(cè)。

1 材料與方法

1.1 材料

PRV原核表達(dá)重組gE純化蛋白：由本公司合成、表達(dá)及純化；辣根過氧化物酶（HRP）羊抗豬：購(gòu)自億米諾公司；TMB底物顯色液：本公司自備；胎牛血清：購(gòu)自美國(guó)Gibco公司；96孔可拆式酶標(biāo)板、酶標(biāo)儀：購(gòu)自美國(guó)Thermo公司；豬偽狂犬病毒gE蛋白抗體ELISA檢測(cè)試劑盒：購(gòu)自于美國(guó)IDEXX。其他試劑為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2 方法

1.2.1 gE蛋白間接ELISA的建立及優(yōu)化 對(duì)抗原包被量、抗原包被條件、封閉液成分、孵育溫度、樣品稀釋液，以及二抗稀釋液成分和稀釋度等進(jìn)行優(yōu)化，根據(jù)P/N值建立最佳條件。

1.2.2 gE蛋白間接ELISA反應(yīng)體系的確立 取酶標(biāo)板，將待檢血清作1∶50稀釋，取100 μL加至酶標(biāo)板中。同時(shí)設(shè)陰、陽性對(duì)照各2孔，各取陰陽性對(duì)照100 μL 加入孔中（不用稀釋）。輕輕振勻孔中樣品，蓋上蓋板膜，置室溫下溫育30 min。棄去孔中溶液，每孔加入稀釋好的洗滌液260 μL，靜置30 s后，棄去洗滌液；洗滌4次后在吸水紙上拍干。配制酶結(jié)合物工作液：按1∶100比例，混勻。每孔加酶結(jié)合物工作液100 μL，蓋上蓋板膜，室溫（25±2）℃下溫育30 min。棄去孔中溶液，洗滌4次后在吸水紙上拍干。將底物A液與底物B液按1∶1混合均勻，加入孔中（100 μL/孔），蓋上蓋板膜，室溫下反應(yīng)10 min。每孔加入終止液50 μL，5 min內(nèi)于OD450/630nm處測(cè)定結(jié)果。

1.2.3 gE蛋白間接ELISA陰陽性判定標(biāo)準(zhǔn)的建立 利用建立的方法，檢測(cè)陰陽性對(duì)照血清OD450/630nm差值，并各檢測(cè)20份陰陽性血清OD450/630nm差值，分別計(jì)算出陰陽性對(duì)照血清的平均OD值，以S/P值作為判定陰陽性標(biāo)準(zhǔn)。

1.2.4 與國(guó)外標(biāo)桿產(chǎn)品的比對(duì) 用本自制產(chǎn)品與美國(guó)IDEXX公司產(chǎn)品，對(duì)246份豬血清分別進(jìn)行檢測(cè)，然后分析本自制產(chǎn)品的敏感性、特異性和符合率。

1.2.5 gE蛋白抗體檢測(cè)試劑盒穩(wěn)定性試驗(yàn) 4 ℃條件下，用同一份血清檢測(cè)OD450/630nm差值以及陰陽性對(duì)照血清OD450/630nm差值。檢測(cè)時(shí)間分別為0 d、15 d、1個(gè)月、3個(gè)月、6個(gè)月及12個(gè)月。計(jì)算3批次的S/P值，探究試劑盒的有效期。

2 結(jié)果

2.1 gE蛋白間接ELISA陰陽性判定標(biāo)準(zhǔn)的建立

利用建立的PRV gE蛋白間接ELISA方法，檢測(cè)陰性對(duì)照血清、陽性對(duì)照血清、20份陰性血清和20份陽性血清的OD450/630nm差值。具體結(jié)果見表1。統(tǒng)計(jì)發(fā)現(xiàn)，陰性對(duì)照OD450/630nm平均差值為0.068，陽性對(duì)照為2.782。根據(jù)公式S/P=（樣本OD值-陰性對(duì)照平均值）/（陽性對(duì)照平均OD值-陰性對(duì)照平均值），以及陰陽性血清的檢測(cè)結(jié)果，初步確定S/P≥0.15為陽性，S/P＜0.15為陰性。

2.2 與美國(guó)IDEXX公司產(chǎn)品的比對(duì)

與美國(guó)IDEXX公司產(chǎn)品完成了246份臨床樣本的比對(duì)試驗(yàn)，證明本自制的ELISA產(chǎn)品與該國(guó)外標(biāo)桿產(chǎn)品的陽性符合率為88.03%，陰性符合率為91.47%，總體符合率為89.84%（表2）。

表1 ELISA檢測(cè)豬血清結(jié)果（OD 450/630 nm差值）

表2 與國(guó)外進(jìn)口標(biāo)桿品牌符合度對(duì)比結(jié)果 單位：份

2.3 gE蛋白抗體檢測(cè)試劑盒的批間、批內(nèi)重復(fù)性

分別用3個(gè)批次組裝的試劑盒檢測(cè)5份血清的OD450/630nm差值，發(fā)現(xiàn)批間變異系數(shù)（CV）在3.44%～6.05%之間，均小于10%，表明PRV gE蛋白抗體檢測(cè)試劑盒不同批次間的重復(fù)性較好（表3）。

表3 批間重復(fù)性試驗(yàn)結(jié)果

使用同批次組裝的試劑盒檢測(cè)與上相同的5份血清，根據(jù)OD450/630nm差值標(biāo)準(zhǔn)差和變異系數(shù)，分析批內(nèi)重復(fù)性，發(fā)現(xiàn)批內(nèi)變異系數(shù)在2.14%～8.67%之間，均小于10%，表明PRV gE蛋白抗體檢測(cè)試劑盒同批次內(nèi)的重復(fù)性較好（表4）。

表4 批內(nèi)重復(fù)性試驗(yàn)結(jié)果

2.4 gE蛋白抗體檢測(cè)試劑盒4℃保存試驗(yàn)

4 ℃條件下，0 d、15 d、1個(gè)月、3個(gè)月、6個(gè)月和12個(gè)月的保存試驗(yàn)結(jié)果見表5。保存試驗(yàn)顯示，4 ℃條件下，12個(gè)月的S/P值基本恒定，故可以保存12個(gè)月。

表5 4 ℃條件下保存試驗(yàn)（S/P值）

3 討論

PRV目前在國(guó)內(nèi)豬場(chǎng)廣泛流行，仔豬感染后呈急性發(fā)病并大量死亡，成年豬感染后臨床癥狀各異，包括腦炎、肺炎、流產(chǎn)，同時(shí)造成豬機(jī)體免疫力下降，對(duì)畜牧業(yè)威脅極大。目前偽狂犬病的防控主要靠gE基因缺失疫苗免疫。采用gE-ELISA對(duì)豬群進(jìn)行血清抗體檢測(cè)，可以有效區(qū)分疫苗抗體及感染抗體，對(duì)豬場(chǎng)偽狂犬病的防控具有重要意義。目前市面上很多gE-ELISA檢測(cè)試劑盒是基于5個(gè)抗原表位中1個(gè)或者2個(gè)建立的阻斷ELISA。但是gE抗原顯示出一定的抗原漂移性，并且豬個(gè)體之間對(duì)gE不同表位的抗體應(yīng)答也顯示出多樣性，因此阻斷ELISA可能會(huì)出現(xiàn)一些誤判[12-13]。鑒于這種情況，檢測(cè)全蛋白抗體的結(jié)合性ELISA，如間接ELISA或夾心ELISA則較有優(yōu)勢(shì)。這種方法不會(huì)受到gE表位特異性變化的影響。雖然gE蛋白在異體表達(dá)系統(tǒng)里面很難完全表達(dá)[14]，但是隨著對(duì)PRV gE蛋白的研究，其表位已被分析清楚[15]。

本研究通過原核表達(dá)gE蛋白中具有免疫原性抗原決定簇的基因片段，使包被抗原具有較好的敏感性及特異性。產(chǎn)品比對(duì)試驗(yàn)中，將自制的間接ELISA方法對(duì)比國(guó)外的標(biāo)桿產(chǎn)品，顯示陽性符合率為88.03%，陰性符合率為91.47%，說明建立的間接ELISA方法敏感性和特異性良好；生物統(tǒng)計(jì)學(xué)顯示，不存在顯著性差異。同時(shí)，該檢測(cè)方法在時(shí)間上比國(guó)外標(biāo)桿產(chǎn)品縮短了近半個(gè)小時(shí)，更有利于在我國(guó)動(dòng)物疫病防控一線市場(chǎng)推廣應(yīng)用。

4 結(jié)論

本研究以原核表達(dá)的PRV gE蛋白為包被抗原，通過建立并優(yōu)化間接ELISA方法，研制出了PRV間接ELISA抗體檢測(cè)試劑盒。與美國(guó)IDEXX生產(chǎn)的標(biāo)桿產(chǎn)品對(duì)比發(fā)現(xiàn)，該試劑盒的陽性符合率為88.03%，陰性符合率為91.47%，總體符合率為89.84%。批間和批內(nèi)重復(fù)性試驗(yàn)表明，該試劑盒變異系數(shù)均小于10%，具有較好的重復(fù)性。該檢測(cè)試劑盒為豬場(chǎng)PRV野毒感染檢測(cè)提供了技術(shù)支撐，可用于豬場(chǎng)PRV野毒感染的臨床檢測(cè)。

參考文獻(xiàn)：

[1] THOMSEN D R，MAROTTI K R，PALERMO D P，et al.Pseudorabies virus as a live virus vector for expression of foreign genes[J]. Gene，1987，57（2/3）：261-265.

[2] WU Q X，ZHANG H，DONG H.L，et al.Seroprevalence and risk factors associated with Pseudorabies virus infection in Tibetan pigs in Tibet[J]. BMC veterinary research，2018，14（1）：25.

[3] BALASCH M，PUJOLS J，SEGALES J，et al.Aujeszky's disease（pseudorabies）virus detection in cerebrospinal fluid in experimentally infected pigs[J].Veterinary microbiology，1998，60（2/3/4）：99-106.

[4] PENSAERT M，LABARQUE G.，F(xiàn)AVOREEL H，et al. Aujeszky's disease vaccination and differentiation of vaccinated from infected pigs[J]. Developmental biology，2014，119：243-254.

[5] POL F，DEBLANC C，OGER A，et al. Validation of a commercial real-time PCR kit for specific and sensitive detection of pseudorabies[J]. Virological methods，2013，187（2）：421-423.

[6] ZHANG M，XIE Z，XIE L，et al. Simultaneous detection of eight swine reproductive and respiratory pathogens using a novel GeXP analyser-based multiplex PCR assay[J]. Virological methods，2015，224：9-15.

[7] LEE C S，MOON H J，YANG J S，et al. Multiplex PCR for the simultaneous detection of pseudorabies virus，porcine cytomegalovirus，and porcine circovirus in pigs[J]. Virological methods，2007，139（1）：39-43.

[8] EN F X，WEI X，JIAN L，et al. Loop-mediated isothermal amplification establishment for detection of pseudorabies virus[J]. Virological methods，2008，151（1）：35-39.

[9] ZHANG C F，CUI S J，ZHU C. Loop-mediated isothermal amplification for rapid detection and differentiation of wild-type pseudorabies and gene-deleted virus vaccines[J]. Virological methods，2010，169（1）：239-243.

[10] JACOBS L，MULDER W A，VAN OIRSCHOT J T，et al. Deleting two amino acids in glycoprotein gI of pseudorabies virus decreases virulence and neurotropism for pigs，but does not affect immunogenicity[J]. Journal of general virology，1993，74（10）：2201-2206.

[11] HU D F，Lü L，ZHANG Z D，et al. Seroprevalence and associated risk factors of pseudorabies in Shandong province of China[J]. Journal of veterinary science，2016，17（3）：361-368.

[12] MORENKOVS O S，SOBKO Y A，PANCHENKO O A.Glycoprotein gE blocking ELISAs to differentiate between Aujeszky's disease-vaccinated and infected animals[J].Virological methods，1997，65：83-94.

[13] GUTWINIARSKA M，JACOBS L，KERSTENS H，et al. A highly specific and sensitive sandwich blocking ELISA based on baculovirus expressed pseudorabies virus glycoprotein B[J]. Journal of virological methods，2000，88（1）：63-71.

[14] KIMMAN T G，LEEUW Q，KOCHAN G. An indirect double-antibody sandwich enzyme-linked immunoassay（ELISA）using baculovirus-expressed antigen for the detection of antibodies to glycoprotein E of pseudorabies virus and comparison of the method with blocking ELISAs[J]. Clinical and diagnostic laboratory immunology，1996，3：167-174.

[15] FUCHS W，RZIHA H J，LUKàCS N，et al.Pseudorabies virus glycoprotein gI：in vitro and in vivo analysis of immunorelevant epitopes[J]. Journal of general virology，1990，71：1140-1151.