高 峰，王建峰，于伯華，張 丹，劉向陽(yáng)，張 琳，秦志軍，唐泰山

（1. 鹽城出入境檢驗(yàn)檢疫局，江蘇鹽城 224002；2. 寧波檢驗(yàn)檢疫科學(xué)技術(shù)研究院，浙江寧波 315100；3. 江蘇出入境檢驗(yàn)檢疫局，江蘇南京 210001）

牛傳染性鼻氣管炎（IBR）是由牛傳染性鼻氣管炎病毒（IBRV）引起牛的一種急性、熱性、接觸性傳染病，以鼻氣管炎、眼結(jié)膜炎、高熱、流產(chǎn)、傳染性膿皰性外陰道炎為主要特征[1]，為世界動(dòng)物衛(wèi)生組織（OIE）法定報(bào)告動(dòng)物疫病。IBRV可通過(guò)空氣、媒介物，以及與病牛直接接觸傳播，20～60日齡犢牛對(duì)其最易感，對(duì)6周齡以下?tīng)倥５牟∷缆士蛇_(dá)85%～100%[2]。目前針對(duì)IBR的病原學(xué)檢測(cè)有包涵體檢查、病毒分離、PCR、qPCR和熒光定量PCR等[3]；血清學(xué)診斷方法有中和試驗(yàn)、瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)、間接血凝試驗(yàn)、ELISA試驗(yàn)和變態(tài)試驗(yàn)等[4]。但這些方法不是操作繁瑣，就是需要高昂的設(shè)備和試劑。環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增（Loop-mediated isothermal ampli fi cation，LAMP）是一種新型的核酸等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)，最早由日本 Notomi 等[5]報(bào)道，具有條件簡(jiǎn)單、操作方便等突出優(yōu)點(diǎn)，是近年來(lái)發(fā)展起來(lái)的一種快速臨床疾病診斷方法[6]。與其它分子生物學(xué)方法相比，LAMP 具有方便、簡(jiǎn)捷、靈敏等優(yōu)點(diǎn)。本研究以IBRV為研究對(duì)象，基于LAMP技術(shù)，建立了可視化LAMP檢測(cè)方法，有效縮短了檢測(cè)時(shí)間，加快了通關(guān)速度，便于口岸、基層等特殊場(chǎng)所動(dòng)物疫病檢測(cè)的開(kāi)展。

1 材料與方法

1.1 病毒株

牛傳染性鼻氣管炎病毒（IBRV）、藍(lán)舌病病毒、赤羽病病毒、牛病毒性腹瀉病毒、牛白血病病毒、小反芻獸疫病毒和偽狂犬病病毒，由江蘇出入境檢驗(yàn)檢疫局動(dòng)檢實(shí)驗(yàn)室提供。

1.2 主要試劑、儀器及耗材

病毒株病毒基因組DNA/RNA提取試劑盒（貨號(hào)DP315）、 DNA純化回收試劑盒（貨號(hào)DP214-02）：購(gòu)自天根生化科技（北京）有限公司；反轉(zhuǎn)錄試劑盒（D2680A）：購(gòu)自TaKaRa公司。其他：甜菜堿（Sigma 公司）、Bst DNA大片段擴(kuò)增酶（NEB公司）、SYBR Green I（Invitrigen 公司）

1.3 LAMP引物設(shè)計(jì)及合成

根據(jù)GenBank中發(fā)表的IBRV全基因序列，利用MEGA 3.1進(jìn)行同源性比對(duì)；選擇基因中的高保守區(qū)域，采用Primer explorer V4網(wǎng)上在線軟件（http∶//primerexplorer.jp/elamp4.0.0/index.html） 設(shè)計(jì)3對(duì)針對(duì)靶基因的引物，包括2條外引物F3和B3、2條內(nèi)引物FIP和BIP，以及引物L(fēng)F和LB。引物序列如表1所示。

表1 RT-LAMP引物序列

1.4 病毒核酸提取及反轉(zhuǎn)錄

RNA和DNA病毒核酸的提取，參照病毒基因組DNA/RNA提取試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。其中對(duì)RNA，再利用反轉(zhuǎn)錄試劑盒，將RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA，-20 ℃ 保存。

1.5 LAMP檢測(cè)體系優(yōu)化

在LAMP基本反應(yīng)體系基礎(chǔ)上設(shè)置不同內(nèi)引物濃度（0.2、0.4、0.8、1.6、2.0、2.4 μmol/L），dNTP 濃度（0、0.2、0.4、0.8、1.0、1.2、1.4、2.0和2.4 mmol/L），Mg2+濃度（2、4、6、8、10和12 mmol/L）和反應(yīng)溫度（45、50、55、57、60、63、65、67和70 ℃），然后分別進(jìn)行單因素實(shí)驗(yàn)，探索各因素對(duì)LAMP的影響，獲得最佳反應(yīng)參數(shù)。

1.6 LAMP 靈敏性試驗(yàn)

提取IBRV核酸，按照107～100copies/μL進(jìn)行10倍比梯度稀釋；以此為模板分別進(jìn)行LAMP擴(kuò)增，分析檢測(cè)體系的靈敏度。

1.7 LAMP 特異性試驗(yàn)

提取IBRV、藍(lán)舌病病毒、赤羽病病毒、牛病毒性腹瀉病毒、牛白血病病毒、小反芻獸疫病毒和偽狂犬病病毒核酸，并以此為模板進(jìn)行LAMP擴(kuò)增，分析檢測(cè)體系的特異性。

1.8 LAMP 反應(yīng)時(shí)間

分別反應(yīng) 5、10、15、20、25、30、40、50和60 min，評(píng)估反應(yīng)時(shí)間。

2 結(jié)果與分析

2.1 內(nèi)引物濃度梯度試驗(yàn)

分別用 0.2、0.4、0.8、1.6、2.0、2.4 μmol/L 引物進(jìn)行內(nèi)引物濃度優(yōu)化，發(fā)現(xiàn)最佳引物濃度為2.4μmol/L。其中，黃綠色為陽(yáng)性結(jié)果，淺橙色為陰性結(jié)果（圖1）。

圖1 內(nèi)引物優(yōu)化結(jié)果

2.2 dNTP濃度梯度試驗(yàn)

分 別 用 0、0.2、0.4、0.8、1.0、1.2和 1.4 mmol/L dNTP濃度進(jìn)行試驗(yàn)摸索，發(fā)現(xiàn)最佳dNTPs濃度為1.0 mmol/L。其中，黃綠色為陽(yáng)性結(jié)果，淺橙色為陰性結(jié)果（圖2）。

圖2 dNTP優(yōu)化結(jié)果

2.3 Mg2+ 濃度梯度試驗(yàn)

分別用 2、4、6、8、10、12 μmol/L 濃度進(jìn)行試驗(yàn)摸索，發(fā)現(xiàn)Mg2+最佳濃度濃度為8 μmol/L。其中，黃綠色為陽(yáng)性結(jié)果，淺橙色為陰性結(jié)果（圖3）。

圖3 Mg2+優(yōu)化結(jié)果

2.4 溫度梯度試驗(yàn)

分別采用 67、65、63 、60、57、55、50、45 ℃進(jìn)行試驗(yàn)摸索，發(fā)現(xiàn)佳反應(yīng)溫度為65 ℃。其中，黃綠色為陽(yáng)性結(jié)果，淺橙色為陰性結(jié)果（圖4）。

圖4 溫度優(yōu)化結(jié)果

2.5 LAMP特異性試驗(yàn)

特異性試驗(yàn)結(jié)果顯示，藍(lán)舌病病毒、赤羽病病毒、牛病毒性腹瀉病毒等6種其他病原全為陰性，僅IBRV為陽(yáng)性，說(shuō)明所建立的LAMP技術(shù)特異性較好（圖5）。

圖5 特異性實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.6 LAMP靈敏度試驗(yàn)

分別采用不同核酸濃度106、105、104、103、102、101copies/μL進(jìn)行試驗(yàn)摸索，最終確定IBRV靈敏度為103copies/μL。其中，黃綠色為陽(yáng)性結(jié)果，淺橙色為陰性結(jié)果（圖6）。

圖6 靈敏度結(jié)果

3 討論

IBR是由牛皰疹病毒I型引起的一種急性、熱性、接觸性傳染病。此病在全球范圍內(nèi)廣泛分布，主要損害牛的呼吸系統(tǒng)及生殖系統(tǒng)，給養(yǎng)牛業(yè)帶來(lái)巨大經(jīng)濟(jì)損失[8]。目前，我國(guó)口岸動(dòng)物檢疫部門(mén)已明確規(guī)定凡是進(jìn)境的牛及其制品必須檢測(cè)IBRV。近年來(lái)，我國(guó)進(jìn)境種（奶）用牛數(shù)量和種類不斷增加，待檢疫病種類較多，在實(shí)際檢驗(yàn)檢疫工作中，每進(jìn)口一批活動(dòng)物，往往要做上萬(wàn)次檢測(cè)，因而需要花費(fèi)大量時(shí)間和試劑，以及復(fù)雜的人工操作。因此，必須尋找一種高通量、高靈敏度、省時(shí)省力、經(jīng)濟(jì)且操作簡(jiǎn)單的檢測(cè)方法，以加速口岸通關(guān)速度，提高口岸檢測(cè)水平，并能有效防控外來(lái)動(dòng)物疫病入侵。

可視化的逆轉(zhuǎn)錄環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增（LAMP）方法相比其他方法，具有快速、高效、高敏感及高特異的特點(diǎn)[9]。馮蒙等[10]也建立了IBRV LAMP 方法。該法可在50 min內(nèi)檢出標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性質(zhì)粒，且不發(fā)生交叉反應(yīng)，通過(guò)肉眼直接觀察即可判斷結(jié)果。本研究以IBRV核酸作為研究對(duì)象，尋找該病毒的特異性保守基因序列，利用LAMP在線軟件，設(shè)計(jì)篩選出特異性引物，利用具有鏈置換作用的Bst DNA聚合酶進(jìn)行靶序列的識(shí)別和延伸，對(duì)待測(cè)靶序列進(jìn)行超指數(shù)擴(kuò)增，以驗(yàn)證引物的特異性和敏感性。在LAMP基本反應(yīng)體系基礎(chǔ)上，設(shè)置不同內(nèi)引物濃度（0.2、0.4、0.8、1.6、2.0、2.4 μmol/L），dNTP 濃 度（0、0.2、0.4、0.8、1.0、1.2、1.4、2.0、2.4 mmol/L），Mg2+濃度（2、4、6、8、10、12 mmol/L）和反應(yīng)溫度（45、50、55、57、60、63、65、67 ℃）分別進(jìn)行試驗(yàn)，探索各因素對(duì)LAMP的影響，以獲得最佳反應(yīng)參數(shù)，最終建立了靈敏度高的IBRV LAMP檢測(cè)方法，靈敏度可達(dá)到103拷貝/μL。本研究對(duì)牛白血病病毒等6種牛主要疫病病原進(jìn)行特異性分析，結(jié)果僅IBRV為陽(yáng)性，特異性良好。本研究在反應(yīng)體系中添加了堿土金屬離子指示劑羥基萘酚藍(lán)（HNB）。由于反應(yīng)副產(chǎn)物焦磷酸根離子和反應(yīng)體系中的Mg2+生成焦磷酸鎂沉淀，不斷消耗游離Mg2+，導(dǎo)致反應(yīng)前后顏色顯著改變，從而使IBRV檢測(cè)可視化。

4 結(jié)論

本研究建立的可視化IBRV LAMP檢測(cè)方法具有特異性和敏感性高、操作簡(jiǎn)便、耗時(shí)短等特點(diǎn)，適用于口岸進(jìn)出口動(dòng)物的IBR快速檢疫。

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