王楷宬，莊青葉，邱 源，劉 朔，王素春，彭 程

（中國動物衛(wèi)生與流行病學(xué)中心，山東青島 266032）

鴿子是我國較受歡迎的食用動物之一，常與雞、鴨、鵝一起在活禽交易市場銷售，因而可以導(dǎo)致各種病原的相互傳播。有些病原能在鴿子體內(nèi)重組變異而產(chǎn)生新的病原。尤其是賽鴿，在訓(xùn)練和比賽中可與野鳥接觸，具有將野鳥攜帶的病原傳入家養(yǎng)賽鴿或者其他家禽的風(fēng)險。已有研究者對鴿子感染病毒的種類進(jìn)行過報道，包括副粘病毒1型、腺病毒、輪狀病毒、皰疹病毒1型和圓環(huán)病毒等多種病原[1]。鴿子是禽類和人類病原的儲存庫，其攜帶的病毒可感染人類而發(fā)生新發(fā)傳染病[2]。目前，我國對鴿子攜帶病原的種類和特性研究甚少。

動物病原的檢測通常采用病原分離鑒定、PCR/RT-PCR、熒光定量PCR/RT-PCR、克隆測序分析等方法，往往針對已知的單種病原進(jìn)行。而檢測同一宿主或群體的多種病原時，需要使用不同的檢測方法，甚至不同的實(shí)驗(yàn)室和實(shí)驗(yàn)人員，且不能檢測未列入檢測計(jì)劃的動物疫病病原以及新型或未知病原。在對我國鴿子攜帶的病原種類尚不清楚的情況下，不適合采用傳統(tǒng)方法，逐個進(jìn)行病原篩查。隨著高通量測序（NGS）技術(shù)和生物信息學(xué)的發(fā)展，這一難題得到解決?；贜GS的病原檢測方法敏感性高，且可以不針對某些目標(biāo)病原進(jìn)行檢測，而是對樣品中攜帶的病原進(jìn)行全景式掃描搜索。為了解我國鴿子的病毒攜帶情況，尤其是變異快、危害大的RNA病毒感染情況，采用高通量測序方法，對我國華東地區(qū)的肉鴿進(jìn)行了病毒檢測。

1 材料和方法

1.1 材料和儀器

Ion PGM Template OT2 200 Kit、Ion PGM Sequencing 200 Kit V2、E-Gel SizeSelect 2%Agarose、Ion 316 Chip Kit V2、Dynabeads MyOne Streptavidin C1 Beads、Qubit核酸濃度測定儀及配套試劑：均購自Life technologies公司。其他儀器包括：超凈工作臺（美國Forma Scientific）；移液器（Eppendorf）；孵化器（德州誠信孵化設(shè)備有限公司）；高速臺式離心機(jī)（德國Heraeus Biofuge primoR）；PCR擴(kuò)增儀（Perkin Elmeter Gen Amp PCR System 9600）；QIAamp Viral RNA Mini Kit（Qiagen，德國）。高性能計(jì)算平臺：Dell T630塔式服務(wù)器，具有2顆Intel（R）Xeon（R）CPU E5-2620 v3 @ 2.40GHz，內(nèi)存264 G，存儲23 T，操作系統(tǒng)版本CentOS Linux release 7.1.1503（Core）。

1.2 樣品采集

在我國華東地區(qū)某省活禽交易市場，按照簡單隨機(jī)抽樣方法，采集禽泄殖腔/咽喉雙拭子60份，置于含有10%甘油和抗生素的PBS（pH 7.2）緩沖液中，-80 ℃保存。

1.3 核酸提取

將采集的60份樣品充分混勻后，各取20 μL進(jìn)行混合；將混合樣品高速離心和0.22 μm濾膜過濾，去除大分子物質(zhì)和細(xì)菌，再經(jīng)DNase I 和 RNase A除去細(xì)胞外的游離核酸；使用QIAamp Viral RNA Mini Kit（Qiagen，德國）提取病毒核酸[3]，-80 ℃保存。

1.4 NGS文庫構(gòu)建

按照稍加修改的已報道方法[3]，將提取的病毒核酸構(gòu)建為PGM測序儀可識別的文庫：10 μL病毒 RNA，加入1 μL 100 μmol/L引物 A15N6（表1），72 ℃反應(yīng)5 min，并置于冰上至少3 min；在上述反應(yīng)混合物中加入4 μL 5× first-strand buffer、1 μL dNTP（100 μmol/L）、2 μL DTT（0.1 mol/L）、1 μL RNaseOUT ? Recombinant Ribonuclease Inhibitor（40 U/μL） 和 1 μL SuperScript?III Reverse Transcriptase（200 U/μL）（Invitrogen，USA），25 ℃ 反應(yīng) 15 min，并 42 ℃反轉(zhuǎn)錄30 min，70 ℃ 15 min，終止反應(yīng)；反應(yīng)產(chǎn)物中再加入 1 μL RNase H（TaKaRa，Japan），37 ℃ 反應(yīng)20 min。將反轉(zhuǎn)錄合成的單鏈cDNA經(jīng) Agencourt?AMPure?XP Reagent（Beckman Coulter，USA）純化，加入引物B15N6（表1），70 ℃反應(yīng) 5 min；再加入 1 μL Klenow fragment（5 U）（NEB，USA），5 μL 10× NEBuffer 2，2 μL dNTP（100 μmol/L）和 1 μL DTT（0.1 mol/L），37 ℃ 反應(yīng)30 min。采用引物A30和B30進(jìn)行文庫擴(kuò)增。反應(yīng)體系包括：1× Phusion High-Fidelity Buffer，10 μmol/L 引物 A30 和 B30（表 1），0.5 U Phusion High-Fidelity DNA Polymerase（NEB，USA）。文庫經(jīng) E-Gel? SizeSelectTMAgarose Gel回收，將350 bp 的DNA進(jìn)行PGM測序。

表1 引物及其序列

1.5 NGS感染病原種類分析

將經(jīng)E-Gel? SizeSelectTM Agarose Gel回收的文庫均稀釋為26 pmol/L；應(yīng)用Ion PGM Template OT2 200 Kit，對DNA文庫進(jìn)行測序前的樣品處理。將處理后的樣品加樣至Ion 316 芯片，置于PGM測序儀進(jìn)行測序；采用standalone NCBI BLASTn tool[4]將測序得到的reads與 GenBank 核酸數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比對（E值為10-5）。對BLASTn 分析結(jié)果，由MetaGenome Analyzer（MEGAN）[5]進(jìn)行展示。將其中與病毒序列比對上的結(jié)果進(jìn)行整理，識別鴿子感染的主要病原。

2 結(jié)果與分析

2.1 測序質(zhì)量

芯片上樣率為73%，測序得到質(zhì)量較高的序列數(shù)據(jù)，Reads數(shù)量為4.58 M，平均測序長度為107 bp，≥Q20 堿基數(shù)為492.3 Mbp。測序數(shù)據(jù)已登錄GenBank，登錄號為SRR2157429。

2.2 病原分析

將測序數(shù)據(jù)與GenBank 核酸數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比對發(fā)現(xiàn)，在我國華東地區(qū)的肉鴿群中檢出5種病毒（圖1），包括禽輪狀病毒、鴿圓環(huán)病毒、鴿星狀病毒、鴿冠狀病毒和鴿微RNA病毒B。將歸為同一類病毒的reads提取后，應(yīng)用CLC genomics workbench 8.5.1（Qiagen，Germany）進(jìn)行拼接，發(fā)現(xiàn)拼接后的序列經(jīng)在線BLAST核對均正確?；蛐蛄蠦LAST分類和reads數(shù)量見表2。

圖1 MEGAN分析鴿子攜帶的病毒種類及其reads數(shù)量占病毒總reads數(shù)的比例

表2 基因序列BLAST分類和reads數(shù)量

3 討論

我國對鴿子感染的病毒種類研究極少，至今僅報道過鴿群感染禽流感病毒[6-7]、新城疫病毒[8-9]、鴿圓環(huán)病毒[10-11]、鴨肝炎病毒[12]、網(wǎng)狀內(nèi)皮組織增生病毒[13]、鴿細(xì)環(huán)病毒[14]等。本次檢測首次在我國鴿群中發(fā)現(xiàn)了禽輪狀病毒、鴿星狀病毒、鴿冠狀病毒和鴿微RNA病毒B，為下一步開展鴿群中病毒感染情況監(jiān)測提供了數(shù)據(jù)支持。這些病原在我國鴿群中的感染率和特性，今后將會被進(jìn)一步研究和分析。

動物病原檢測通常采用PCR等分子生物學(xué)方法或ELISA等血清學(xué)方法進(jìn)行。由于PCR方法具有高敏感性和特異性，以及檢測通量高、效率高等優(yōu)點(diǎn)，已廣泛被各病原監(jiān)測實(shí)驗(yàn)室所接受。但是基于PCR的檢測方法必須針對目標(biāo)性病原開展，對檢測的每種病原都要知曉基因序列信息，并分別建立特異性PCR檢測方法。如，Roussan等[15]對雞場的星狀病毒、輪狀病毒、呼腸孤病毒和腺病毒I型的感染情況進(jìn)行檢測，需要分別設(shè)計(jì)6個PCR，對所有樣品進(jìn)行檢測，才能得到檢測結(jié)果。這種檢測方法只能涵蓋列入監(jiān)測計(jì)劃的目標(biāo)病原，而不能檢測新發(fā)或新型病原[16]。對于研究數(shù)據(jù)較少的鴿群病毒感染狀況，有目的地進(jìn)行PCR檢測并不能發(fā)現(xiàn)鴿群中主要感染病原。如本檢測新發(fā)現(xiàn)的4種鴿群感染病原，往往由于之前未曾發(fā)現(xiàn)而被忽視。本檢測采用NGS技術(shù)解決了這個問題，對鴿子樣品中攜帶的RNA病毒進(jìn)行全景式掃描搜索，并首次發(fā)現(xiàn)了我國鴿群中存在禽輪狀病毒、鴿星狀病毒、鴿冠狀病毒和鴿微RNA病毒B的感染。

由于病毒性疫病，尤其是RNA病毒病[17-19]，對動物健康影響較大，且其病原變異速度快，更需要密切監(jiān)測其分子進(jìn)化趨勢，因而本文選擇病毒性病原進(jìn)行檢測。因檢測出的病原種類與采集的樣品種類有關(guān)，本檢測采集泄殖腔/咽喉雙拭子，能夠檢測主要的呼吸道和消化道病原，更換樣品類型也可以檢測其他病原。

4 結(jié)論

綜上所述，本檢測采用NGS方法，發(fā)現(xiàn)我國華東地區(qū)肉鴿主要攜帶禽輪狀病毒、鴿圓環(huán)病毒、鴿星狀病毒、鴿冠狀病毒和鴿微RNA病毒B等5種病原，其中禽輪狀病毒、鴿星狀病毒、鴿冠狀病毒和鴿微RNA病毒B等4種為國內(nèi)首次報道。結(jié)果證實(shí)，NGS技術(shù)能夠檢測出動物群體的主要感染病原，是動物疫病檢測的新思路。隨著NGS費(fèi)用的逐漸降低，該方法可用于規(guī)?；B(yǎng)殖場的疫病檢測、凈化等工作，可以減少實(shí)驗(yàn)室檢測工作量，有利于全面地掌握動物病原感染狀況，及時預(yù)警、處置和防控動物疫病的發(fā)生。

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