李 超， 劉 敏， 劉志華

(中山大學(xué)附屬第六醫(yī)院結(jié)直腸外科， 廣東省胃腸病學(xué)研究所， 廣東 廣州 510655)

目前腸屏障功能調(diào)節(jié)的研究主要集中在益生菌及其活性成分、致病菌及相關(guān)成分和炎癥介質(zhì)等方面[1-2]，對于其機制的研究仍有一定的局限[3]。微小RNA(microRNA，miRNA，miR)近幾年的研究主要集中在腫瘤[4-6]、心血管疾病[7]以及神經(jīng)系統(tǒng)疾病[8]等，而其對腸屏障功能的影響研究較少[9]。研究表明，miR-21可激活腸上皮細胞內(nèi)的絲裂原激活蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase，MAPK)/細胞外信號調(diào)節(jié)激酶(extracellular signal-regulated kinase，ERK)信號通路，抑制第10號染色體缺失的磷酸酶-張力蛋白同源物(phosphatase and tensin homolog deleted on chromosome 10，PTEN)/磷脂酰肌醇3-激酶(phosphatidylinositol 3-kinase，PI3K)信號通路，且PTEN/PI3K信號通路活化被認為參與了腸上皮機械屏障的調(diào)節(jié)[10]。miR-21是否通過其它途徑影響腸上皮機械屏障仍不明確。生物信息學(xué)分析表明，miR-21的預(yù)測靶基因包括Rho蛋白家族中的一些成員，如ROCK1。有研究表明，Rho蛋白家族中ROCK1參與調(diào)節(jié)緊密連接(tight junction，TJ)相關(guān)蛋白——閉合蛋白(occludin)的表達與沉積[11]。腸上皮機械屏障主要包括腸上皮細胞及細胞間緊密連接蛋白，occludin是重要的細胞間緊密連接蛋白。據(jù)此，我們假設(shè)miR-21可能通過靶向調(diào)控ROCK1而調(diào)節(jié)腸屏障功能相關(guān)蛋白occludin。在此基礎(chǔ)上，我們擬通過細胞水平上調(diào)或下調(diào)miR-21觀察腸上皮細胞的功能表型改變，進而采用生物信息學(xué)方法預(yù)測miR-21的靶基因，并通過螢光素酶報告基因進行驗證。從而明確miR-21對腸屏障功能的影響，推測可能的機制。

材 料 和 方 法

1 細胞

人正常結(jié)腸上皮細胞系NCM460購于INCELL；人胚腎細胞株293T由中山大學(xué)附屬第六醫(yī)院胃腸病研究所提供。

2 主要儀器及試劑

NanoDrop 2000超微量分光光度計、CO2培養(yǎng)箱和生物安全柜(Thermo)；ABI 7500熒光定量PCR儀和普通PCR儀(Applied Biosystems)；Model 680酶標儀和蛋白轉(zhuǎn)印系統(tǒng)(BIO-RAD)；DMI4000B自動智能數(shù)字相差熒光倒置顯微鏡(Leica)；G:BOX/HR-E-M自動凝膠成像系統(tǒng)(Syngene)；倒置相差生物顯微鏡(Nikon)；螢光素酶分析儀(BMG Labtech)。

胎牛血清(fetal bovine serum，F(xiàn)BS)和DMEM高糖培養(yǎng)基(Gibco)；Lipofectamine 2000 Reagent、Opti-MEM培養(yǎng)基、TRIzol、RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit、miRNA qPCR Kit、Platinum PCR SuperMix-UDG、TaqMan MicroRNA Reverse Transcription Kit、PowerUpTMSYBR? Green Master Mix、高保真DNA聚合酶和T4 DNA鏈接酶(Invitrogen)；兔抗ROCK1、 occludin和β-actin 多克隆抗體(CST)； II抗和Wizard?基因組DNA純化試劑盒(弗德生物)；Dual-Luciferase Reporter Assay System、EcoR V、NheI、HindIII、EcoR I和DpnI(Promega)；DNA凝膠回收試劑盒(Tiangen)；質(zhì)粒提取試劑盒(MN)；KOD -Plus- Neo DNA Polymerase(TOYOBO)；miR-21 mimics和inhibitors(廣州銳博生物)。所用引物及測序由Invitrogen公司根據(jù)設(shè)計合成。

3 主要方法

3.1hsa-miR-21慢病毒載體的構(gòu)建 表達載體pGIPZ的酶切采用BamH I和XhoI完成。對酶切產(chǎn)物電泳，隨后回收產(chǎn)物片段，長度約11 kb。擴增目的基因所用引物設(shè)計如下，hsa-miR-21-BamH I-R: 5’-ATTCTGATCAGGATCCCTAAGTGCCACCAGACAGAAG-3’；hsa-miR-21-XhoI-F: 5’-CAACAGAAGGCTCGAGGATCTTAACAGGCCAGAAATG-3’；miR30-F: 5’-ATGAGGCTTCAGTACTTTACAG-3’；WPRE-R: 5’-CATAGCGTAAAAGGAGCAACA-3’。隨后PCR擴增目的基因片段，將擴增的目的基因與線性載體進行同源重組，再將連接產(chǎn)物與DH5α細胞進行轉(zhuǎn)化，最終獲得陽性克隆送測序。最終將包裝好的慢病毒感染NCM460細胞，構(gòu)建穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細胞株，熒光顯微鏡下觀察可見到細胞發(fā)出綠色熒光，表示感染成功。

3.2miR-213’UTR載體構(gòu)建 在NCBI上選取并分析目的基因序列，擴增引物序列如下，ROCK1XhoI： 5’-ccgctcgagGCCTGCTTTCGCCTGCTGTC-3’； ROCK1NotI-R：5’-ataagaatgcggccgcTCTATGGGAGTAGTATTT-

TTATTATTCCAATTG-3’。隨后在人基因組上通過PCR 釣取目的基因，再將PCR產(chǎn)物切膠回收并純化，將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化，平板選取單克隆提取質(zhì)粒酶切后送測序，BLAST比對測序結(jié)果。采用同樣方法構(gòu)建ROCK1 3’UTR突變載體。

3.3miRNA與目的質(zhì)粒共同轉(zhuǎn)染NCM460細胞 陽離子脂質(zhì)體法行細胞轉(zhuǎn)染：轉(zhuǎn)染的前 1 d，將NCM460細胞按照每孔2×104在24孔板上鋪板；轉(zhuǎn)染當(dāng)天，NCM460細胞生長融合度應(yīng)為50%～60%。轉(zhuǎn)染前1 h棄去舊培養(yǎng)基，PBS洗2次，每孔加入300 μL Opti-MEM培養(yǎng)基，放回CO2培養(yǎng)箱；每孔加入1 μL Lipofectamine 2000，加入Opti-MEM培養(yǎng)基至終體積50 μL，在室溫下靜置約5 min；每個孔用加入20 μmol/L的miR-21 mimic 1 μL、miR-21 inhibitor 2 μL和0.5 μg質(zhì)粒，再加入Opti-MEM至總體積50 μL，室溫下靜置5 min；混勻，室溫靜置20 min；將轉(zhuǎn)染混合液按每孔100 μL加入24孔板，輕輕混勻孔板；放回細胞培養(yǎng)箱中孵育約5 h后，丟棄原培養(yǎng)基，替換為新鮮的完全培養(yǎng)基。

3.4雙螢光素酶報告基因檢測 轉(zhuǎn)染48 h后，棄去培養(yǎng)基，PBS洗2次，按每孔100 μL加入PLB(passive lysis buffer)，搖床中輕微振搖，室溫15 min后收集細胞裂解液。隨后使用螢光素酶分析儀檢測熒光強度：設(shè)置程序：首先預(yù)讀2 s，然后讀值10 s，LAR II和Stop & Glo? Reagent進樣量設(shè)定為每次100 μL。分別將已加入細胞裂解液的發(fā)光板(每樣品20 μL)、Stop & Glo? Reagent和 LAR II放入螢光素酶分析儀中。按照螢光素酶分析儀操作說明書運行程序，讀取數(shù)值并保存數(shù)據(jù)。

3.5細胞RNA提取及qPCR TRIzol提取細胞RNA，NanoDrop 2000檢測A260、A280及其比值，確定RNA的濃度及純度。PCR 引物設(shè)計通過軟件Primer 5并參考相關(guān)文獻，并在NCBI Primer BLAST進行比對。β-actin 上游引物：5’-TCAAGATCATTGCTCCTCCTGAG-3’；β-actin 下游引物：5’-ACATCTGCTGGAAGGTGGACA-3’； ROCK1 上游引物：5’-GGTGGTCGGTTGGGGTATTTT-3’；ROCK1 下游引物：5’-CGCCCTAACCTCACTTCCC-3’；occludin 上游引物：5’-TTGAAAGTCCACCTCCTTACAGA-3’；occludin 下游引物：5’-CCGGATAAAAAGAGTACGCTGG-3’。將提取RNA進行反轉(zhuǎn)錄合成cDNA后，按照20 μL反應(yīng)體系步驟加樣，依說明程序進行qPCR反應(yīng)(嚴格按照說明書進行)。以β-actin為內(nèi)參照，每個樣本設(shè)3個復(fù)孔檢測。結(jié)果用公式2-ΔΔCt計算差異值，以對空白對照組細胞為校正樣本，將內(nèi)參照表達值設(shè)為1，其余樣本與之相比得出的數(shù)值即為差異值。

3.6Western blot 檢測蛋白表達水平 收集細胞，采用細胞裂解液提取蛋白，BCA法測定蛋白濃度，根據(jù)樣品蛋白濃度計算上樣量，Marker上樣3 μL。經(jīng)SDS-PAGE后，用電轉(zhuǎn)儀轉(zhuǎn)膜至硝酸纖維素膜上。室溫5% BSA封閉2 h，I 抗孵育過夜，TBST漂洗3次，加入標記 II 抗稀釋液室溫孵育1 h，TBST漂洗4次，化學(xué)發(fā)光顯像后分析結(jié)果。

4 統(tǒng)計學(xué)處理

用SPSS 22.0統(tǒng)計軟件進行分析。數(shù)據(jù)均采用均數(shù)±標準差(mean±SD)表示，兩組間比較采用t檢驗。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

1 在NCM460細胞中過表達miR-21后occludin蛋白表達上調(diào)

采用miR-21過表達慢病毒轉(zhuǎn)染NCM460細胞，使用嘌呤霉素篩選得到miR-21過表達細胞株，穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的NCM460細胞表達綠色熒光蛋白，可發(fā)出綠色熒光。采用qPCR檢測各組細胞的miR-21相對表達量，結(jié)果顯示，miR-21過表達的NCM460細胞株中miR-21的表達量顯著高于對照組(P<0.05)，表明miR-21在miR-21過表達NCM460細胞株中的表達顯著上調(diào)，見圖1A。同時采用Western blot檢測2組細胞中occludin的蛋白表達水平發(fā)現(xiàn)，miR-21過表達細胞株中occludin蛋白的表達顯著高于對照組(P<0.01)，提示在NCM460細胞中過表達miR-21可上調(diào)occludin蛋白表達，見圖1B。

Figure 1. The expression levels of miR-21 and occludin in miR-21-overexpressing NCM460 cells. A: the expression of miR-21 determined by qPCR; B: the result of Western blot for determining the protein level of occludin. Mean±SD.n=3 .*P<0.05vscontrol group.

圖1miR-21過表達的NCM460細胞miR-21表達水平及occludin蛋白表達水平

2 miR-21的靶基因預(yù)測

根據(jù)TargetScan(http://www.targetscan.org/)、 PicTar(http://pictar.mdc-berlin.de/)、miRmap(http://mirmap.ezlab.org/)、miRanda(http://www.microrna.org/microrna/)和miRbase(http://www.mirbase.org/)5個數(shù)據(jù)庫預(yù)測hsa-miR-21作用的靶基因。通過生物信息學(xué)分析，根據(jù)不同軟件預(yù)測的靶基因的差異與miR-21和對應(yīng)基因3’非編碼區(qū)配對種子序列的保守性，對靶基因進行打分排序，結(jié)果發(fā)現(xiàn)Reck、Tgfbi、Ntf3、Arhgap24、Arhgap27、ROCK1、Cdc42和PTEN等靶基因得分較高。同時文獻分析表明，Rho激酶相關(guān)蛋白家族Rho-ROCK在腸屏障損傷中作用較為明確，而ROCK蛋白為同時作為Rho蛋白的重要底物且ROCK1分布于神經(jīng)以外組織。因此，擬選取ROCK1作為miR-21的潛在靶基因。

3 在NCM460細胞中過表達miR-21可下調(diào)ROCK1的mRNA和蛋白水平

采用miR-21 mimic轉(zhuǎn)染NCM460細胞24 h后用qPCR分別檢測miR-21及ROCK1的相對表達水平，結(jié)果顯示，與對照組相比，miR-21 mimic轉(zhuǎn)染NCM460細胞24 h后miR-21相對表達水平顯著升高(P<0.05), 而此時miR-21 mimics轉(zhuǎn)染組ROCK1的mRNA相對水平顯著降低(P<0.01), 表明miR-21過表達可在細胞水平顯著下調(diào)ROCK1的mRNA水平，見圖2A、B。48 h后，miR-21 mimics轉(zhuǎn)染組NCM460細胞的ROCK1蛋白表達水平亦顯著下調(diào)(P<0.01)，見圖2C。

Figure 2. The expression levels of miR-21 (A), ROCK1 mRNA (B) and ROCK1 protein (C) in NCM460 cells transfected with miR-21 mimic. Mean±SD.n=3.*P<0.05,**P<0.01vscontrol group.

圖2轉(zhuǎn)染miR-21mimic的NCM460細胞中miR-21和ROCK1mRNA及蛋白的表達水平

4 在NCM460細胞中抑制miR-21可上調(diào)ROCK1的mRNA和蛋白水平

采用miR-21 inhibitor轉(zhuǎn)染NCM460細胞24 h后，用qPCR分別檢測miR-21及ROCK1的mRNA的相對表達水平，結(jié)果顯示miR-21 inhibitor轉(zhuǎn)染NCM460細胞24 h后miR-21相對表達水平明顯降低(P<0.05), 而此時miR-21 inhibitor轉(zhuǎn)染組ROCK1的mRNA相對水平上升(P<0.05), 表明在NCM460細胞中抑制miR-21表達可在細胞水平顯著上調(diào)ROCK1的mRNA水平，見圖3A。48 h后，miR-21 inhibitor轉(zhuǎn)染組NCM460細胞的ROCK1蛋白表達水平亦顯著上調(diào)(P<0.01)，見圖3B。

Figure 3. The expression levels of miR-21, ROCK1 mRNA (A) and ROCK1 protein (B) in NCM460 cells transfected with miR-21 inhibitor. Mean±SD.n=3.*P<0.05，**P<0.01vscontrol group.

圖3轉(zhuǎn)染miR-21inhibitor的NCM460細胞miR-21和ROCK1mRNA及蛋白的表達水平

5 螢光素酶報告基因?qū)嶒烌炞CROCK1為miR-21的靶基因

利用miRBase查找miR-21(miR-21-5p)的序列，在NCBI上查詢ROCK1的mRNA序列(NM_005406.2)并選取其3’UTR序列部分，將兩者采用NCBI的BLAST進行比對，預(yù)測miR-21在ROCK1 mRNA的3’UTR上的可能結(jié)合序列，結(jié)果可見ROCK1 mRNA的3’UTR中42～48 nt含有miR-21的調(diào)控位點，見圖4A。通過RT-PCR方法將含有該調(diào)控位點的片段以及調(diào)控位點突變的片段克隆至psiCHECK-2表達載體，在NCM460細胞中過表達miR-21，利用雙螢光素酶報告基因?qū)嶒灧治鰉iR-21對調(diào)控位點的作用，結(jié)果發(fā)現(xiàn)miR-21通過調(diào)控該位點進而顯著影響了報告基因的表達，同時對ROCK1突變3’UTR片段無明顯調(diào)控作用，證明內(nèi)源性miR-21可以有效抑制報告基因表達，即ROCK1為miR-21的靶基因，見圖4B。

Figure 4.ROCK1 was verified as the target gene of miR-21. A: the predicted binding site of miR-21 on ROCK1 3’UTR; B: dual-luciferase reporter assay. Mean±SD.n=3.*P<0.05vscontrol group.

圖4驗證ROCK1為miR-21靶基因

討 論

本課題組既往研究發(fā)現(xiàn)，某些miRNA參與了腸道屏障功能的調(diào)節(jié)[12]。在本研究中，我們提出假說miR-21通過靶向調(diào)控ROCK1進而調(diào)節(jié)TJ相關(guān)蛋白occludin，是腸屏障功能的保護因素。為驗證假說，我們首先通過體外實驗檢測miR-21對細胞腸屏障相關(guān)表型是否影響加以驗證，為此選擇了NCM460細胞系作為我們的實驗對象。NCM460和FHC細胞等是較為常見的人正常結(jié)腸上皮細胞系，可排除腸道腫瘤細胞、未成熟或分化不夠的原代上皮或永生化細胞系帶來的干擾。通過構(gòu)建hsa-miR-21過表達慢病毒載體轉(zhuǎn)染NCM460細胞系得到miR-21過表達NCM460細胞，通過qPCR檢測發(fā)現(xiàn)其miR-21表達情況較對照組顯著升高約為對照組的4倍以上，證明miR-21過表達NCM460細胞系構(gòu)建成功，進而通過Western blot檢測其TJ相關(guān)蛋白occludin表達情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)miR-21過表達NCM460細胞其occludin表達上調(diào)，與假設(shè)一致，說明miR-21能夠上調(diào)TJ蛋白表達進而維持腸屏障正常功能。該實驗存在一定的局限性，一是未構(gòu)建miR-21抑制表達細胞系，二是只檢測了主要的TJ蛋白，其它TJ蛋白以及腸上皮細胞凋亡情況未進行檢測。針對第一點，后續(xù)我們將通過在體實驗進一步補充完善。Occludin是經(jīng)典的腸上皮細胞間緊密連接蛋白，在腸屏障功能維持方面起了較為重要重要的作用，其它的TJ蛋白還有ZO-1、ZO-2和ZO-3，20種異構(gòu)體以上的claudin蛋白以及其它一些非典型蛋白。進一步通過生物信息學(xué)分析與文獻查找，選取ROCK1作為miR-21的靶基因進行下一步研究。生物信息學(xué)分析方法可參考前述。miRNA的調(diào)控特點是“多對多”，事實上生物信息學(xué)方法可以預(yù)測出相當(dāng)數(shù)量的靶基因，而動物miRNA的互補程度低，因此程序算法的預(yù)測結(jié)果理論上也會較多。結(jié)合打分情況，我們發(fā)現(xiàn)Rho-ROCK蛋白家族[13]在預(yù)測結(jié)果中出現(xiàn)概率較高，包括(1)Rho-GTP酶超家族成員：Rho、Rac以及Cdc42等；(2)GTP酶活化蛋白(GTPase activating protein, GAP)：Arhgap22和Arhgap24等；(3)Rho亞家族下游效應(yīng)分子：Rho激酶1即ROCK1。GAP是Rho-GTP酶的負調(diào)因子，通過加速Rho-GTP酶水解，使其失活。參與Rho-GTP酶活性調(diào)節(jié)的還有：鳥苷酸交換因子(guanine-nucleotide exchanging factors，GEFs)以及GDP解離抑制因子(GDP dissociation inhibitor，GDI)，其中前者為正向調(diào)節(jié)，后者為負向調(diào)節(jié)抑制Rho-GTP酶活性。而ROCK1作為Rho蛋白家族的下游底物，顯然其作用較為明確，而ROCK的底物包括肌球蛋白輕鏈以及內(nèi)收蛋白[11]等，參與細胞骨架調(diào)整、細胞收縮和腫瘤細胞浸潤，同時參與了微管以及F-actin的極化調(diào)節(jié)[14]。有研究證實ROCK通過影響IECs的F-actin結(jié)構(gòu)引起腸上皮通透性增加，也有研究發(fā)現(xiàn)Rho信號通路的激活通過磷酸化肌球蛋白，可使腸上皮細胞間TJ蛋白ZO-1及occludin發(fā)生改變，繼而引起腸屏障通透性增加與功能紊亂[15]。因此，我們選取ROCK的異構(gòu)體ROCK1作為miR-21的靶基因進行研究。通過在細胞水平轉(zhuǎn)染miR-21 mimic及inhibitor上調(diào)和下調(diào)NCM460細胞系的miR-21水平，qPCR及Western blot檢測發(fā)現(xiàn)miR-21過表達引起ROCK1的mRNA降解，蛋白水平表達下調(diào)；相反miR-21表達抑制引起ROCK1 mRNA與蛋白表達上調(diào)，可以看出miR-21能影響ROCK1的表達。為確定其是否為miR-21的靶基因，我們采用螢光素酶報告基因?qū)嶒炦M行驗證，發(fā)現(xiàn)相比較于轉(zhuǎn)染克隆有ROCK1突變型3’UTR的序列，在轉(zhuǎn)染克隆有野生型ROCK1 3’UTR質(zhì)粒中，miR-21組的螢光素酶相對活性較對照組低。因此我們得出結(jié)論，miR-21在細胞水平對腸屏障的結(jié)構(gòu)起到維持作用，而ROCK1是miR-21的靶基因，miR-21可能通過Rho-ROCK1通路進而影響腸屏障相關(guān)蛋白occludin的表達。

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